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国际创新研究期刊》的研究在科学、工程和技术

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从植物细胞培养生产黄酮醇槲皮素的榕树(榕树benghalensis l .)

h . Bandekar1和美国美国乐乐2
  1. 研究学者、食品工程与技术部门、化学技术研究所N.P.高山草地,Matunga,孟买,印度400年019年
  2. 教授,食品工程与技术部门、化学技术研究所N.P.高山草地,Matunga,孟买,印度400年019年
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文摘

本研究报告在体外生产黄酮醇从榕树benghalensis l .这是第一个研究槲皮素的报道。不同媒体使用等使用外植体愈伤组织诱导的节段,年轻的叶子光盘和根部分。易碎的愈伤组织获得媒体补充与植物生长调节剂(pgr) 14 - 18天后接种。愈伤组织是亚文化,允许成熟调查其生物量积累和槲皮素的生产。愈伤组织增殖是通过补充蔗糖(3%)Lglutamine (150 mg / L)。液相文化与上述介质成分没有固化的代理建立了槲皮素被分离从文化中提取,经高效液相色谱法使用高性能薄层和量化色谱法。最大槲皮素含量0.31毫克/克干电池重量(起重集团)是通过这个系统从母亲植物提取的20倍。

关键字
热带榕属植物benghalensis L。,callus induction, liquid phase cultures, proliferation, quercetin.

介绍
榕树benghalensis l .(悦榕庄)是一种木本植物属于家庭桑科无花果。这种植物是印度国家的树。它有一个长寿命和归因于获得大尺寸。一些物种的一个独特的特征从这个属包括榕树benghalensis是天线根部系统扩展到地上最终形成自己的分支机构。它是热带地区广泛栽培和归化在几乎每一个潮湿的热带地区。这种植物是土著亚太次大陆,并广泛分布在印度,也产于缅甸(缅甸),泰国,中国南部,和马来西亚[1]。其全球分销包括迈阿密,佛罗里达,昆士兰,北马里亚纳群岛、关岛、斐济、法属波利尼西亚[2]。自古以来,一些成员属榕树已经使用传统的各种各样的人种医疗救济和已被证明是非常重要的。
生物分子从榕树benghalensis植物吸引了极大的关注,主要是因为在疾病预防的重要作用。这些植物尤其是具有抗氧化剂类黄酮、黄酮醇、单宁等发挥重要作用在清除自由基,对人体是有害的,因此获取营养食品和制药的重要性。槲皮素是一种黄酮醇,一种强有力的抗氧化剂,被认为有许多属性:anti-cancerous,抗菌,抗病毒,抗炎,anti-pyretic和止泻药(3、4、5)。

相关工作
传统医学系统高度依赖于各种植物部分,为了获得所需的提取物用于治疗目的。这要求一个不变的依赖的植物可能导致过度开采自然种群。同时,这些重要的生物分子的大规模的要求可能具有严重威胁生存的植物来源。植物组织培养系统作为有效的替代工具对体外培养的植物和操纵方便大量有商业价值的次生代谢产物的生产没有任何明显伤害母亲。此外,植物细胞培养提供能够获得代谢物的优点是可预测的,比从复杂的全植物容易分离,避免了干扰中间化合物存在于整个植物和呈现一个潜在的安排学习引出响应[6]。因为这些生物分子往往积累在指定的植物物种数量相对较低,新兴的需求在当今市场对自然,可再生产品已将我们的注意力重新集中在体外细胞培养潜在工厂二次代谢物。
在目前的研究中,我们试图建立一个植物组织培养系统利用榕树benghalensis外植体生产一个强有力的黄酮醇槲皮素。然而,木本植物被发现一般顽固的体外再生。因此,必须精心考虑各种参数时离体培养的植物。体外培养使用外植体的榕树benghalensis micro-propagation已经尝试过的目标[7,8]。然而,这是第一次尝试获得次生代谢物(槲皮素)通过组织培养生产。这样的研究可能形成未来工作的基础生产相同或相关的其他重要的生物活性化合物的物种通过组织培养系统的维护。

材料和方法

外植体的准备和接种
节段,年轻的叶子光盘和气生根的榕树benghalensis植物从研究所收集的化学技术(ICT),孟买。凭证标本(LMPF1 LMPF2和LMPF3)沉积在药用天然产物研究实验室、制药科学系的,信息通信技术。研究节点外植体的愈伤组织诱导和叶光盘早些时候表现在我们实验室[9]。在目前的研究中,空中的根也作为外植体。一个附加的步骤学习冲销概要文件为每个外植体(表1),执行消毒外植体被转移到无菌培养皿,涂抹在无菌滤纸。用于接种的节段切除和媒体。
图像

媒体优化
木本植物中(WPM) [10], Murashige和斯库(MS)[11]和Gamborg的B5培养基用于接种的外植体[12]。不同的植物生长激素和细胞因子组合被添加到媒体研究愈伤组织诱导。根据我们先前的研究植物生长调节剂(PGR),结合2 mg / L苄氨基蝶呤(BAP)和0.1 mg / L Napthalene乙酸(NAA)和MS培养基对愈伤组织诱导是优化[9]。使用相同的PGR组合对愈伤组织诱导WPM和B5媒体。

愈伤组织增殖
这是调查使用不同的碳源即蔗糖、葡萄糖、果糖和麦芽糖浓度为2%,3%和4%。氨基酸如丙氨酸、天冬酰胺、谷酰胺和酪氨酸浓度的50 mg / L, 100 mg / L, 150 mg / L和200 mg / L每个被用来研究它们对扩散的影响。明胶0.4%细菌学的琼脂,0.1% gelrite (gelrite®口香糖,σ)被用于固相的文化。媒体的pH值调整高压灭菌前5.8±0.2。
孵化条件:文化管在16 h光/ 8 h孵化黑暗光周期对愈伤组织和植物生长室扩散。

细胞悬液的文化
细胞悬液文化从愈伤组织开始在同一介质液体媒体组成的固体琼脂培养基没有固化的代理。文化是在轨道振动器保持在100 rpm 25ºC和16 h光/ 8 h黑暗的光周期。从今以后,股票暂停文化是亚文化每18天后新鲜培养基在1:1的比例。其余的文化是用于各种分析。

增长测量和可行性测试
新鲜细胞重量(结合)和干电池权重(起重集团):实验在non-sterile条件下进行每天服用2毫升的样品一个星期。结合估计收集细胞悬液反复使用2毫升埃普多夫管和洗涤细胞包有相同体积的蒸馏水。干燥后的起重集团决心细胞在一夜之间50°C。
解决细胞体积(SCV)和包装细胞体积(PCV)从细胞悬液文化:参数都是选择在体外评估文化的快速增长。解决细胞体积决心通过允许10毫升的细胞悬液沉积物pre-autoclaved 15毫升毕业锥形离心管后30分钟间隔为4 h。它计算了沉积物的体积的百分比细胞群悬挂的总量。另一方面,PCV确定的包装细胞的体积在1000 rpm离心法后10分钟的总量。
细胞的细胞计数:可行性可行性检查使用fluorescien二乙酸(FDA)计数器沾染了伊文思蓝(EB)测试时每10天子培养。1毫升暂停样本沾10μl FDA股票和一个完整的黑暗中孵化室15分钟埃普多夫管。样本随后在1000转离心10分钟和颗粒在1毫升蒸馏水resuspended 3分钟。计数器使用100μL 1%伊文思蓝染色进行10分钟在室温下[13]。此后,随机计数细胞生存能力都是通过显微镜下的血球计。

感兴趣的生物活性化合物的提取和分析(槲皮素)
槲皮素的提取植物部分(叶)和细胞培养(细胞生物量):叶子的植物和细胞生物从实验室细胞培养在50岁ºc,干就干一夜样本(20 g)在100毫升甲醇提取2 h使用索氏仪器。methanolic提取集中使用旋转蒸发器干燥。干提取(1.3 g)当时受到回流水解和100毫升的7% H2SO4 30分钟。反应混合物过滤,滤液提取2部分乙酸乙酯在分液漏斗(25毫升)。乙酸乙酯层相结合,用蒸馏水洗净,晒干。叶的残留样品(47个毫克)和细胞生物样本(52毫克)获得5毫克的每个样本在10毫升甲醇溶解,100有人看到μL高性能薄层色谱分析(效果)。
仪器及色谱条件:薄层色谱法进行20厘米×10厘米效果硅胶G60F254(默克公司、印度)。标准解决方案和样本应用于15毫米的基板使用Camag Linomat 100自动化喷涂器配备μl(美国汉密尔顿)注射器。板块是80毫米的距离移动开发阶段甲苯:乙酸乙酯:丙酮:甲酸(5:2.5:7.5:0.5 v / v)在室温下(28 + 2ºC)在Camag玻璃twin-through室之前饱和流动相蒸汽后20分钟。发展板块被风干。光密度扫描后获得的色谱图是在254 nm Camag薄层色谱扫描仪3控制下Camag winCATS平面色谱软件。
槲皮素标准曲线和量化:股票的解决方案的标准槲皮素(1毫克/毫升)准备与甲醇在甲醇和稀释(1:10 0)。不同体积的储备溶液1、2、3、4、5和6μl,被发现在TLC板获得浓度10,20、30、40、50、60 ng /地点分别为槲皮素。槲皮素的含量在叶和细胞生物样品然后决定(毫克/克干电池重量基础)从标准曲线。
隔离和高效液相色谱法(HPLC)分析槲皮素:100克干细胞生物量受到了上面提到的提取过程。乙酸乙酯层所以获得干和加载硅胶柱洗脱液用氯仿:甲醇(挺)逐渐增加(40:6 0)、槲皮素筛选了。为了确定纯度的孤立的从细胞培养获得的槲皮素,高效液相色谱法分析与JASCO(八王子、东京、日本)系统,使用250毫米x 4.6毫米身份证。RP-18(5-μm粒度)Purospher明星列(默克公司),1.00毫升/分钟的流量和流动相甲醇:水在254 nm(比例)。
所有的化学品,除非所提到的,均为分析纯,且从HiMedia采购,印度

结果和DUSCUSSION
愈伤组织诱导、愈伤组织增殖和细胞悬液的文化
愈伤组织诱导:外植体的筛选是通过使用节点部分,年轻的叶子光盘和根部分。14 - 18天的接种后观察愈伤组织诱导。取决于所使用的媒介,最大观察愈伤组织在节段作为外植体在女士中(图1)。愈伤组织依赖于一个复杂的相互作用的因素,如消毒流程,减少主要污染物包括病毒、细菌、酵母、真菌和培养基成分,从而使外植体的筛选获得良好的愈伤组织必不可少的步骤。乙醇被用于我们的单独研究的浓度范围和不同的曝光时间。此后,次氯酸盐的选择和评价消毒效果。次氯酸盐的离解NaOCl在水中形成HOCl报道作为此类活动的显著影响[14]。我们的研究我们发现,70%的乙醇在不到2分钟曝光之后,4%次氯酸钠(2分钟)是有效的节段灭菌。然而,年轻的叶子和根部分要求大约1分钟,70%乙醇和次氯酸30秒曝光(表1)ethanol-hypochlorite组合被发现有效可行的外植体> 80%,作为进一步研究的最佳条件。在更高的浓度和更高的曝光时间,毒性观察。
图像
与生长调节剂MS培养基是显示所有的外植体诱导愈伤组织比生长调节剂补充WPM和B5媒体(图1)。愈伤组织诱导的变化在不同的媒体可能是由于NO3 / NH4 +比率的差异,一个重要因素对氮吸收和调节pH值在植物组织培养与之前的研究一致[15]。生长调节剂的作用在植物细胞和组织培养实践具有重要意义。因此不同生长调节剂单独或组合对愈伤组织的诱导和发展进行评估。
因此,节点部分被用作外植体在MS培养基2 mg / L BAP和0.1 mg / L NAA对愈伤组织诱导的实验进一步进行。愈伤组织的成熟是媒介优化4周- 2个月成功接种新的媒体紧随其后。
愈伤组织增殖:低光和二氧化碳提供体外是增长的主要原因,文化需要糖尤其是液相文化系统。文化不能正常生长没有外生的碳水化合物供应(16、17、18)。因此各种碳源的影响包括葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖进行评估以提高愈伤组织增殖在我们的研究中。蔗糖在植物细胞培养用于各种目的作为碳源或监管机构的细胞渗透。选择的范围是2%,3%和4%的糖,研究表明,高糖水平也可能引起细胞脱水和影响细胞增殖(19、20)。葡萄糖被报道为愈伤组织诱导和胚胎发生的愈伤组织形成的重要添加剂(21、22)虽然被发现不合适的比蔗糖在我们的研究中。同时,麦芽糖效率已经知道显示等于或超过蔗糖在支持胚胎发生的物种(23、24),但在我们的研究支持至少扩散。果糖还被报道支持叶子花属的愈伤组织诱导和增殖sp.蔗糖或葡萄糖[25]但我们的研究并不支持这个。因此,在我们的研究中最大的愈伤组织诱导获得80%蔗糖(3%)被添加为糖源(图2)
图像
图4 (a)显示细胞扩散质量与3%蔗糖和MS培养基补充150 mg / L谷酰胺。
细胞悬液建立了文化在女士中有3%的蔗糖和150 mg / L L -谷氨酰胺(图4 b)。细胞生存能力测试结果显示,80%的亚文化和实验可行的细胞。
图像
槲皮素的量化样本做了使用标准曲线。观察一个好的线性与R2 = 0.9999标准曲线的浓度(图5 b)说。从标准曲线的浓度槲皮素在叶样本从母亲获得植物被发现0.018毫克/克是在良好的协议与先前的研究(Taskeen et al . 2009年)。槲皮素从培养细胞生物质通过植物组织培养是0.31毫克/克干电池重量的基础上。从这个结果,发现槲皮素的细胞生物量在实验室培养达到20倍比从母亲获得工厂这是一个非常重要的增加表明商业系统的重要性。
槲皮素的分离和高效液相色谱分析
图像
图6 (a)的高效液相色谱色谱纯化槲皮素分数从硅胶色谱(a)收集乙酸乙酯提取物细胞生物量
槲皮素的分离培养的细胞生物量是使用硅胶色谱提供32毫克的化合物,在良好的协议与效果的结果。孤立的槲皮素的纯度由高效液相色谱确定,被发现> 98% w / w。色谱分离化合物的细胞生物量和乙酸乙酯提取物的色谱所得细胞生物量是图6所示。

结论
与成功的生产槲皮素通过细胞培养的榕树benghalensis,这项研究工作承诺另一个商业上重要的生物活性化合物的源系统。未来的范围涉及维护高槲皮素生产细胞株的榕树benghalensis应该培养后,主要生产大型生物反应器研究参数的可行性。

确认
作者感谢大学拨款委员会——特别援助计划(UGC-SAP),印度提供项目的财政支持。

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