优化条件下普鲁兰梗孢和韦内基枝孢生产漆酶:在纺织染料脱色中的应用

摘要

纺织染料废水处理是一项艰巨的任务。本研究旨在鉴定能够产生细胞外漆酶的真菌，在优化的条件下可以脱色纺织染料。从土壤和朽木中分别分离出普鲁兰绿梗霉和韦内克支孢霉，鉴定为产漆酶真菌。研究了最大漆酶产量的生理条件。真菌生物量与漆酶产量及其生长有关。将优化后的培养基用于几种纺织染料的脱色。A.普鲁兰菌在培养第9天漆酶活性最高，为19.18 U/ml;C. werneckii偏好半乳糖，在第12天漆酶活性最高，为1.53 U/ml，在30 Ë (C)和pH 5.0时漆酶活性最佳。两株真菌均偏爱色氨酸作为氮源，并利用24 mm和0.3 mm CuSO4接种量获得最佳漆酶产量。普鲁兰漆酶是组成型漆酶，韦内基漆酶是诱导型漆酶。 The increase or decrease in laccase activity is in direct proportion to the rate of fungal growth. Optimized culture broth from A. pullulans and C. werneckii had 1.25 and 2.03 fold increase in laccase activity respectively and they were both able to decolourize malachite green specifically i. e 73% and 35% and had least decolourizing abilities on methylene blue in the absence of inducers and after three hours of incubation. The ability of these newly isolated fungal strains to produce laccase extracellularlly and also decolourize dyes would serve as a way to eliminate industrial textile waste water.

关键字

漆酶，纺织染料，韦内克支孢子虫，普鲁兰丝球藻，

简介

漆酶(苯二醇:氧氧化还原酶，EC1.10.3.2)属于酚氧化酶组，是一种含铜酶，能催化大量有机和无机底物的氧化，包括单酚、二酚和多酚、氨基酚、甲氧基酚、芳香胺和抗坏血酸，其中氧有一个四电子还原成水[15]。漆酶除了是蓝铜蛋白外，还有一个独特的特征是它的糖基化。植物漆酶是20- 50%糖基化，而真菌漆酶是5- 20%糖基化。这在其分类中是有用的，因为植物漆酶参与聚合，而真菌漆酶参与解聚合反应[6]。漆酶最早是由吉田于1883年从日本漆树的渗出液中描述的，但它也在大多数真菌[8]，细菌，高等植物[35]和昆虫[31]中被发现。真菌漆酶在生物技术应用中比细菌漆酶有更多的作用，主要是因为高氧化还原电位，特别是在脱木质素[36]中注意到+800 mV

来自真菌的漆酶分布在子囊菌、氘菌和担子菌中，因此对白腐真菌的漆酶生产研究最多。漆酶在木质素降解、形态发生和发病等方面具有多种生物学功能。真菌漆酶的催化特性和广泛的底物特异性使其在纸浆脱木质素、纺织染料转化、生物传感器、异种生物降解和生物修复等各种工业和环境应用中具有巨大的潜力。与其他酚氧化酶相比，漆酶不需要H2O2的存在进行氧化，这使得它更适合于更多的生物技术应用，如异种生物的生物降解和染料[22]的脱色。每年生产的大约10,000种染料主要用于印刷和纺织工业，这些染料对光线、化学物质甚至微生物降解都很稳定。这些染料释放到环境中的有色化合物可能会影响水生植物的光合作用，同时伴随的最终产物对生物体有毒或致突变[3]。生物修复是应用微生物的生物活性来降解环境中的有毒化学物质的一种方法。白腐真菌是最有效的木质素降解微生物，它通过三种细胞外非特异性和非立体选择性木质素降解酶，即漆酶和过氧化物酶(木质素过氧化物酶(EC 1.11.10.14)和锰过氧化物酶(EC 1.11.1.13)[26]的协同作用，特异性降解几种染料。漆酶已被用于氧化解毒或去除各种芳香异种生物和污染物，发现在工业废物和污染的土壤或水[2]。此外，使用漆酶进行脱色处理是一种潜在的、比生物修复技术更有优势的程序，仅仅因为有大量的酶生产。

近年来研究了来自Trametes属的漆酶降解染料[7]的能力。Foorontafal等[14]利用曲霉属和曲霉属的三种真菌漆酶对染料进行脱色。Maleej-Kammoun等[23]还利用一种新的Tramates sp菌株的漆酶对孔雀石绿进行了染料脱色。由于严格的环保法规，纺织行业为了节约成本，正在寻求开发具有成本效益的废水修复方法。以往的沉淀、过滤、吸附和TiO2氧化等方法，与真菌及其酶在纺织品染料脱色中的成本高、环保[12]相比，成本高、环保[12]

本研究旨在分离、筛选和生产两种不同的真菌，分别从腐烂植物材料和腐烂木材的土壤中分离得到普鲁兰孢霉和韦内奇枝孢霉。生理条件，将有利于他们的生长最大漆酶生产将通过各种优化过程确定。从这两种真菌分离株所产生的优化培养液中获得的漆酶可用于几种当地纺织品染料的脱色。这将为减少纺织染料废水造成的环境危害提供新的见解。

材料与方法

化学品及传媒

愈创木酚、儿茶酚和Bradford试剂均来自美国Sigma公司。为了本研究的目的，所有其他使用的化学品都是分析级和高纯度的。当地的染料是从尼日利亚拉各斯的纺织业购买的。

微生物与维护

用于漆酶生产的真菌分别从尼日利亚非统组织伊莱菲奥逊州奥巴费米·阿沃洛沃大学的非农场地点的腐烂木材和含有腐烂森林凋落物的土壤中分离出来。腐烂的木材和含有森林凋落物的土壤被收集在几个无菌玻璃纸袋中。连续稀释，随后在添加0.01%氯霉素的麦芽萃取琼脂(MEA)上进行电镀，以抑制细菌生长。进行多次传代培养，直至获得纯菌落。纯真菌分离株在4°C的琼脂斜面上保存，直到需要进一步使用

产漆酶真菌的筛选

为了分离出一种产漆酶的菌种，对分离得到的纯真菌进行了产漆酶的培养基筛选。筛选培养基为蛋白胨- 0.3，葡萄糖- 1.0,KH₂阿宝₄- 0.06, ZnSO₄- 0.0001, k₂HPO₄- 0.04, FeSO₄- 0.00005, MnSO₄- 0.005 MgSO₄- 0.05，愈创木酚10mm，琼脂- 2.0)。真菌培养物接种在琼脂平板上，在黑暗条件下培养7天。以红褐色为筛选介质的底物对木质素的降解具有积极作用。从腐木和含腐植物材料的土壤中筛选出具有产漆酶能力的真菌进行进一步研究。

产漆酶真菌的鉴定

几种真菌分离株的鉴定将通过使用棉蓝乳酸酚(用于霉菌)和革兰氏染色(用于酵母)的染色技术，利用生长特征(即质地、色素沉着、形态、孢子形成)和形态进行。在光镜下观察制备的载玻片。对酵母[4]进行糖发酵试验，进行生化表征

漆酶生产

将生长良好的真菌琼脂栓子分别接种到漆酶发酵生产培养基中。漆酶生产培养基为(g/100 ml)蛋白胨- 0.3，葡萄糖- 1.0,KH₂阿宝₄- 0.06, ZnSO₄- 0.0001, k₂HPO₄- 0.04, FeSO₄- 0.00005, MnSO₄- 0.005 MgSO₄- 0.05和10 mM愈创木酚。28°C孵育15 d。酶的产生量在固定的时间间隔内进行测定。回收生产介质，使用Whatman 1号滤纸进行过滤。滤液作为酶源[19]。

漆酶生产培养条件的优化

在最佳条件下对鉴定的纯分离菌进行浸泡发酵，使其胞外生产漆酶。各种碳源(麦芽糖，蔗糖和半乳糖)，氮源(尿素，nhh)₄所以₄pH值(用1n HCl和1n NaOH调整的醋酸缓冲液)温度(23- 60℃)，接种量(1- 5,6 mm琼脂栓子)，诱导剂(愈创木酚，硫酸铜)的效果和培养时间(天)的影响是不同的，以获得最佳漆酶生产。在旋转轨道激振器中对每个参数进行优化的振动条件，而温度对两种真菌漆酶生产的影响是在恒温培养器中在静态条件下进行的。

漆酶测定

以愈创木酚为底物，分光光度法测定漆酶活性。反应混合物中含有0.1 ml培养液粗滤液，愈创木酚终浓度为1.0 mM, 10 mM醋酸酯缓冲液pH为5.0 0.8 ml，最终反应体积为1.0 ml。反应混合物在室温下孵育15分钟。在450 nm分光光度下进行反应;愈创木酚消光系数为12100 M^－1厘米^－1．漆酶活性的一个单位定义为每分钟催化一微摩尔愈创木酚氧化的漆酶量。反应在室温下进行。[29]

蛋白质的测定

以牛血清白蛋白(BSA)为标准测定蛋白浓度。[9]

真菌生物量的测定

通过估计收集滤液后的干重来确定从粗酶中获得的生物量B。将含有已干燥真菌的滤纸(Whatman 1号滤纸)称量，FA。估算未使用滤纸的重量FB，然后从含有干燥真菌生长的滤纸中减去FB。

B = F_一个- f_B

优化后的培养液对染料的脱色性能

将0.5 ml优化的培养液加入2 ml(最终浓度为0.096 mg/L)的每种染料溶液中，然后在室温静态条件下孵育3小时。监测样品，每30分钟记录最大吸光度的下降

染料脱色率计算公式为:

脱色率(%)= [(A_我——一个_t) /_我] × 100，其中，

人工智能:染料的初始吸光度，:染料在任何时间间隔的吸光度。设计阴性对照(无酶反应混合物)作为对照，比较处理样品的脱色率。

结果与讨论

产漆酶真菌的分离与筛选

连续稀释高达10⁸10 .土壤中含有腐烂的植物材料⁶在麦芽萃取琼脂(MEA)上反复传代培养后，从两个来源获得了超过十六(16)株纯真菌菌株。16株纯分离株中仅有3株能产生胞外漆酶。晕区最强的产漆酶真菌分别为pullulans和C. werneckii，分别来自腐烂植物和腐烂木材的土壤。

潜伏期的影响

图1结果表明，pullulans和C. werneckii的活性分别在生长第9天和第12天达到最高。真菌漆酶生成达到最大值，活性分别为19.18 U/ml和1.53 U/ml。漆酶产量随着潜伏期的增加而减少。漆酶的最佳生产有不同的孵育期。根据Kaal等[18]的研究，真菌的木素溶解酶系统虽然可能存在于生长的初级阶段，但通常是在N或C消耗的情况下被触发的，在菌丝干重降低的初级阶段达到最大。Elisashvili et al[13]和Sivakumar et al[34]报道，香菇和灵芝分别在孵育第7天和第10天获得最大漆酶产量。Cavallazzi等[11]发现香菇在孵育30天后漆酶活性最高。

pH的影响

本研究使用的pH值范围为3.0 ~ 7.0。详见图2．从中可以看出，韦内基枝孢漆酶和普鲁兰球孢漆酶分别在pH值5.0和pH值6.0时最大生成。真菌的生长相对减少，因为pH值的轻微变化会影响生长，从而影响漆酶的产生。真菌漆酶的形成发生在一个狭窄的pH值范围内，而低水平的酶在pH值低于或高于这个值。这可能是因为pH值的改变会改变酶[33]的三维结构。Haltrich et al[17]指出，大多数真菌培养物更喜欢在微酸性的培养基中生长和酶生物合成，这与所获得的结果一致。此外，Adejoye和Fasidi[1]报道了Schizophyllum commune的pH最优值为5.5,Sivakumar等[34]观察到灵芝sp的漆酶产量最优值为6.0

温度的影响

两种真菌分离株分别在23-60°C的不同温度下生长。C. werneckii和A. pullulans漆酶的最佳温度分别为30°C和37°C图3．温度升高有利于真菌生长，但漆酶产量在37°C和30°C分别达到峰值后下降。从结果中可以观察到，将温度提高到两种微生物的最佳温度以上，漆酶的形成都会减少，这可以解释为细胞膜组成的改变和蛋白质分解代谢的刺激。最佳培养温度取决于所使用的微生物的生长动力学，而不是所产生的酶

接种量的影响

对于接种量大小对A. pullulans和C. werneckii漆酶产量的影响，从活跃生长的真菌菌丝体上切下1-5个琼脂栓子(直径6 mm)接种到生产培养基中。pullulans和C. werneckii均利用4个琼脂栓子获得最大的漆酶产量。接种量的大小在酶的生产中起着重要的作用。接种量的增加进一步提高了漆酶的产量和两种微生物的真菌生长。我们观察到，随着漆酶活性的降低，两种生物的干菌丝重量(生物量)都有所下降。较低水平的接种量可能不足以启动生长，而较高水平的接种量可能导致竞争性抑制(Sabu et al.， 2005)。Sharma et al.(1996)报道接种量控制并缩短了初始滞后期，因为较小的接种量会增加滞后期。将接种量增加到5个会产生有害影响，它被解释为营养物质的快速消耗，导致代谢活性下降。

碳源效应

常规碳源对真菌生产漆酶的适应性的影响是重要的，因为漆酶生产依赖于使用的微生物分类[27]。为了研究不同碳源对漆酶形成的影响，用单糖(半乳糖)、双糖(麦芽糖)和多糖(可溶性淀粉)代替葡萄糖(对照)。每种碳源以10.0 g/l的浓度添加到生长培养基中作为主要碳源。结果表明，半乳糖和淀粉分别是诱导漆酶形成的最佳诱导剂。所有其他碳源都在不同程度上抑制漆酶的产生(图5Bollag和Leonowicz[10]提出，葡萄糖等易被同化的成分允许本构漆酶的产生，但抑制了几种真菌对其的诱导。与我们的结果一致，在碳源中，淀粉支持灵芝sp[34]的最大漆酶产量。Mansur等[24]研究表明，使用果糖代替葡萄糖可使担子菌的特异性漆酶活性增加100倍

氮源效应

将各种氮化合物(尿素、l -精氨酸、l -色氨酸甘氨酸)分别添加到培养基中，添加量与所述培养基中硫酸铵(对照)的量相当。l -色氨酸对A. pullulans和C. werneckii的酶活性表达水平最高。除精氨酸和甘氨酸对C. werneckii和A. pullulans的酶活性最低外，其他氮源也能产生相当数量的漆酶。在含氮源不同的培养基中，漆酶的比例不同。Gogna等[16]指出，真菌木质素分解酶生产最广泛使用的氮源是铵盐。Sivakumar等[34]报道酵母浸膏刺激灵芝提高漆酶产量。

硫酸铜(CuSO₄)漆酶生产浓度

铜作为一种微量元素作为金属激活剂具有重要作用，诱导漆酶转录，并在漆酶生产[28]中发挥重要作用。为了找出诱导a . pullulans和C. werneckii最大漆酶产量的合适硫酸铜浓度，采用了一系列浓度(0-0.5 mM)的硫酸铜。在0.3 mM时，p . pullulans和C. werneckii的漆酶产量均达到最大值。由此可以推断，硫酸铜可以提高C. werneckii的漆酶产量，但对真菌的生长影响很小，但对p . pullulans的漆酶产量和真菌的生长都有促进作用。

然而，当铜浓度超过最佳浓度时，真菌生长和漆酶显著下降。这可能是由于铜在较高浓度下的抑制作用。Baldrian[6]指出，较高的铜浓度可能对真菌有毒，影响它们的生长和酶的作用。硫酸铜浓度为30 μM时，灵芝产漆酶量最大。Niladevi和Prema[25]在使用浓度为1 mM的硫酸铜时获得了最大的漆酶活性。Galhaup等人[15]报道，添加浓度在1 mM到10 mM之间的硫酸铜刺激了漆酶的产生。

染料脱色

漆酶对同一类染料脱色的能力各不相同，完全取决于微生物来源的生物学性质。在灵芝漆酶作用下，孔雀石绿的脱色率为98%(初始浓度为60 mg/L)，脱色率为60.5%(初始浓度为60 mg/L)

与其他种类的染料相比，三苯基甲烷染料耐酶处理，脱色需要时间

优化后的pullulans培养液对孔雀石绿(72.456±0.05%)、Allura红(52.23±0.07%)、亚甲基蓝(5.93±0.08)和酒石黄(19.82%±0.07)的脱色活性提高了1.25倍，而C. werneckii漆酶对孔雀石绿(30.03±0.97%)的脱色活性提高了2.03倍，在无任何诱变剂的静态条件下孵育3h后才能有效脱色。

通过加入HBT(一种合成漆酶介质，通过促进O2向漆酶底物[37]的电子转移来协助不同底物的漆酶氧化)等漆酶介质，可以消除两种来源的优化漆酶肉汤不能有效脱色亚甲基蓝和酒黄石的问题

结论

pullulans和C. werneckii所产粗漆酶经优化后对几种本地购买的纺织染料的脱色潜力不同。这为利用这些微生物进行生物修复提供了有用的见解和廉价的方法。

确认

作者要感谢尼日利亚Obafemi Awolowo大学微生物系的Tunde Oni先生在本研究微生物方面的帮助。

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