双酚A对大鼠发育过程中神经行为变化的保护作用

摘要

背景:双酚A (BPA)是一种环境雌激素污染物，它被用于制造塑料产品，包括饮料、牙科材料和婴儿奶瓶。暴露于双酚a是不可避免的，被认为是主要的公共健康风险，特别是在发展中国家。BPA毒性的关键影响主要发生在胎儿发育和产后发育期间。锌(Zn)是内源性酶抗氧化过程中必不可少的元素。细胞增殖、分化、正常生长、免疫功能和伤口愈合都需要它。硒(Se)也是具有抗氧化作用的营养必需元素。它在各种神经退行性变模型中保护大脑免受氧化损伤。目的:探讨哺乳期BPA暴露对大鼠新生儿的影响，并探讨和比较锌和(或)硒对BPA诱导的发育和神经行为改变的可能保护作用。方法:将泌乳母鼠分为5组，每组8只。在21天内(从分娩到断奶)，母鼠每天接受以下治疗:对照组为生理盐水(1ml /kg, P.O)，双酚a (40mg /kg, P.O)单独或与锌(20mg /kg, P.O)、硒(0.1 mg/kg, P.O)联合或同时使用。每天对所有幼犬进行身体发育和神经行为发育的评估。在新生儿t迷宫和开放场地试验(OFT)等行为实验中也有表现。用脑匀浆检测单胺水平(DA、NE和5-HT)和氧化应激标记物(SOD、GPX和CAT)。结果:出生后BPA暴露导致幼鼠出现绒毛、毛发发育、耳朵张开、伸直反射、悬崖躲避、负25°地向、掌抓和听觉惊吓的时间显著延长。BPA还显著降低了大鼠t迷宫的正确选择次数和OFT的行走频率，而显著提高了幼鼠的饲养频率和潜伏期。 There was also significant reduction in the brain oxidative stress markers (SOD, GPX and CAT) as well as in NE and 5-HT in addition to significant elevation in DA content. On the other hand, Zn and/ or Se co-administration with BPA improved physical and neurobehavioral development as well as performance of pups in the behavioural experiments. They also showed significant elevation in the brain oxidative stress markers (SOD, GPX and CAT), NE and 5-HT levels while significant reduction in the brain DA content as compared to BPA alone. There was significant elevation in the number of correct choices in Zn treated group only. Co-administration of Zn and Se has no more pronounced effect than each one alone except in the effect on brain monoamines and oxidative stress markers. Conclusion: Postnatal BPA exposure delayed some aspect of physical and neurobehavioral development as well as behavioural functions as learning, locomotors and exploratory activities, in addition to emotionality disturbance. Zn and/or Se can protect against BPA-induced alterations. The protective effect of Zn either alone or in combination was more pronounced than Se concerning learning and some reflexes. However, the protective effect of Zn and Se combination has more pronounced effect regarding brain monoamines level and oxidative stress markers only than each of them alone.

关键字

双酚A，出生后发育，行为变化，锌，硒，大鼠

简介

双酚A(BPA)是一种工业塑化剂它具有已知的雌激素特性，被广泛用于制造环氧树脂(用于食品和饮料罐衬里)和牙科密封剂[1，2］．BPA很容易从聚碳酸酯塑料和环氧树脂中滤出，无论是在加热罐头过程中，还是在与碱性和酸性物质接触时。雷竞技网页版经证实，储存、刷牙和洗碗会导致聚合物降解，从而导致其释放[3.］．BPA暴露与身体健康的诸多影响有关，而BPA对发育中的大脑的作用机制尚不清楚。BPA的危害会导致不同的心脏病、糖尿病、肥胖和吸毒血压以及肝毒性[4，5］．双酚a在女性体内的浓度高于男性，儿童体内的浓度高于成人，家庭收入低的个体体内的浓度高于收入高的个体[6］．双酚a是亲脂性的，在血清和母乳中都能检测到;它也会积聚在人体脂肪中[7］．双酚a在胎儿和新生儿发育过程中具有强大的影响，因为肝脏在这些阶段抑制双酚a的能力有限。在胎儿发育期间，暴露于双酚a是特别值得关注的，因为双酚a会越过胎盘屏障，在胎儿和胎盘内积聚。[8］．胎儿期暴露于双酚a与后代下丘脑、垂体和认知功能的变化有关[2，9]，而妊娠期间持续接触会导致子宫内生长迟缓[10］．

先前的研究集中在产前BPA暴露对生殖系统发育和神经系统发育的风险上，并提出了广泛的负面后果。有趣的是，在围产期和产后或成年期暴露于少量BPA，即使低于每日可接受的暴露水平，都会对大脑结构和功能产生不利影响[11，12通过靶向突触发生、记忆巩固和树突发育。事实上，海马和前额叶皮层的突触可塑性受到BPA的影响，BPA影响突触界面，包括突触间隙和突触前活动区[13，14］．然而，BPA与大脑后续发育及其功能之间的关系仍不清楚。因此，在出生后发育期间，研究BPA暴露的影响是非常重要的，因为这是大脑发育的关键时期，大脑具有高度的可塑性，极易受到环境的伤害[11］．尽管儿童时期是BPA暴露最多的时期[15，16]，产后暴露还没有完全研究。

锌(Zn)，是一种已知的内源性酶抗氧化系统的基本成分。它在细胞膜完整性方面起着至关重要的作用，并在细胞代谢的许多方面发挥作用。它是抗氧化剂，或者是抗氧化酶的辅助因子。锌是胎儿期和产后中枢神经系统正常发育所必需的，也是多种蛋白质、酶、激素和生长因子的形成和功能所必需的，这些蛋白质、酶、激素和生长因子在神经发育期间指导干细胞增殖和分化[17-19］．此外，锌也参与中枢神经系统外的代谢过程，如激素的运输和生产神经递质最终会影响大脑功能的前体[18，19］．此外，锌还参与了其他生物过程，包括DNA合成、正常生长、行为反应、大脑发育、骨形成及繁殖[20.］．有证据表明锌缺乏会导致生长迟缓、睾丸萎缩、皮肤和粘膜改变、食欲不振、伤口愈合延迟、细胞介导的免疫功能障碍和异常的神经感觉反应[21］．此外，有人提出神经系统疾病，包括精神障碍和感觉敏锐度下降与锌缺乏有关[22］．

锌缺乏可能与压力增加有关，并可能改变情绪反应和抑郁诱导的行为，如攻击性和焦虑，以及认知缺陷和学习记忆障碍[23，24］．研究表明，在产前和产后早期，补充锌可以改善大鼠后代的空间学习、认知功能和运动活动。锌也被认为是一种重要的营养胚胎发生胎儿生长和功能发育。它在维持细胞功能方面起着重要的作用乳腺用于乳汁的合成及分泌[25］．饮食中锌的摄入可以防止身体脂质状态的改变，因此可以防止一些毒性作用，包括细胞膜的氧化损伤和动脉粥样硬化作用[26］．此外，锌的摄入可以增强骨骼碱性磷酸酶活性，防止骨吸收，因此饮食摄入锌可能对骨骼有保护作用[27］．

硒(Se)是人体必需元素，能提高硒酶的活性。它存在于谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性中心，这是一种抗氧化酶，保护脂膜和大分子由过氧化物产生的氧化损伤。此外，据报道，硒具有对抗自由基的能力，并保护蛋白质、DNA和染色体的结构和功能免受氧化损伤[28］．然而，对大脑功能最重要的硒蛋白可能是硒蛋白P [29］．这种蛋白质在大脑水平合成，保护大脑免受自由基损伤，特别是过氧酸盐[30.］．此外，硒含量随着年龄的增长而下降[31］．因此，硒缺乏可能是认知功能下降的危险因素。硒是另一个重要的辅助因素，流行病学研究结果表明，硒含量降低与神经退行性疾病和心血管疾病以及癌症风险增加有关[32］．硒还原与DNA损伤之间存在关联氧化应激，以及一些证据表明Se不仅可能影响癌症风险，还可能影响癌症的进展和转移[33］．对硒水平较低的受试者进行硒干预已显示出在降低所有癌症的发病率和死亡率方面的一些益处，但更具体地说，在肝癌、前列腺癌、结肠直肠癌和肺癌方面。它的保护作用似乎与它存在于多种形式的谷胱甘肽过氧化物酶中有关，已知谷胱甘肽过氧化物酶可以保护DNA和其他细胞损伤免受氧化应激[34，35］．

基于上述考虑，本研究旨在研究产后BPA暴露的影响，哺乳期正是大脑发育的关键时期，也是大脑损伤最敏感的时期。该研究还旨在调查和比较锌和/或硒对产后BPA暴露的可能保护作用，BPA暴露被认为会导致新生儿发育和神经行为障碍。

材料与方法

动物

成年雄性和雌性sd大鼠(雄性体重200-220克;体重180-200克的雌性)被用于这项研究。它们来自埃及NILE制药和化学工业公司。动物被饲养在适当的环境条件下。他们继续吃标准的食物，并随意提供水。大鼠被安置在不锈钢笼子里(每笼3 - 4只)，交配前饲养一周。这项工作是根据埃及爱资哈尔大学(药学院)的伦理准则进行的。

药物及化学品

双酚A，硫酸锌和硒购自Sigma-Aldrich化学公司(圣路易斯，密苏里州，美国)。以tween 80为表面活性剂，在玉米油中制备双酚A。硫酸锌和硒均溶于蒸馏水中。

实验设计

分娩后将泌乳母鼠分为5组。

组1：从分娩后第0天(PND 0)到出生后第21天(PND 21)断奶，母鼠每天灌胃1 ml/kg生理盐水，并作为对照组。

组2：从分娩(PND 0)到断奶(PND 21)，母鼠每天口服BPA溶液(40 mg/kg) [36］．

组3：从分娩(PND 0)到断奶(PND 21)，母鼠每天灌喂BPA溶液(40 mg/kg)， 30分钟后再灌喂锌溶液(20 mg/kg) [37］．

组4：母鼠每日灌喂BPA溶液(40 mg/kg)， 30分钟后从分娩(PND 0)至断奶(PND 21)开始给予硒溶液(0.1 mg/kg) [38，39］．

组5：从分娩(PND 0)到断奶(PND 21)，每天灌喂BPA溶液(40 mg/kg)， 30分钟后给予Zn溶液(20 mg/kg)， 30分钟后给予Se溶液(0.1 mg/kg)。

反射和感觉功能的发展(神经行为发育)，包括正转反射、悬崖躲避、负25°地向、掌握和听觉惊吓[40］．此外，还通过两种行为实验对大鼠幼仔进行了评估:在新生儿t迷宫中的表现:在新生儿t迷宫中测量正确选择的次数/10次，在露天测试中测量潜伏时间、行走频率、饲养频率和梳理时间。此外，用脑匀浆来评估脑单胺水平(DA, NE和5-HT)。最后用脑匀浆研究氧化应激标志物(SOD, GPX和CAT)酶活动。

身体发育

对于每只幼鼠(3-4只幼鼠/窝)，记录以下每一种身体体征出现明显的时间[40，41］．所有试验均在分娩(PND 1)至断奶(PND 21)的幼鼠身上进行。

•耳廓脱离:每天观察并记录外耳的展开情况。

•柔和的头发:绒毛的初级被毛的外观头发每天进行观察和记录。

•皮草发展：每天观察和记录皮毛的完全发育。

•耳朵打开：每天观察并记录双耳完全打开情况。

•眼睛开：每天观察并记录双眼完全睁开的情况。

神经行为发展

对于每只幼鼠(3-4只幼鼠/窝)，记录以下每项反射和感觉功能明显的时间[40，41］．所有试验均在分娩(PND 1)至断奶(PND 21)的幼鼠身上进行。

扶正反射:幼崽仰卧(仰卧位)，并监测翻身和直立所需的时间，每天两次试验，每次试验最长时间为30秒

悬崖回避:这些幼崽被放在悬崖边缘或桌面上，观察它们是否能在60秒内避免跌落，并表现出缩回和后退的动作。

负地向25°：幼崽被放置在25°倾斜的胶合板表面，头朝下，观察长达60秒。每只小狗每天试验1次。

手掌抓：测定幼犬被抚摸时前爪抓住回形针的能力。每只小狗每天试验1次。

听觉惊吓:观察到在幼犬头顶15厘米处的听觉刺激出现积极的惊跳反应(头猛跳和后肢伸展)，每个幼犬每天进行一次试验，可以很容易地识别出有无惊跳反应。

行为实验

它们包括评估幼鼠在陌生环境中的行为发展。

新生儿t迷宫的表现:这项测试是在PND 22上的小鼠身上进行的。

以新生t迷宫作为学习记忆指标，对幼鼠进行交替试验。新生儿t迷宫由黑色丙烯酸树脂制成，支架长度为5.1 × 30.5 × 5.1 cm，横臂长度为5.1 × 25.4 × 5.1 cm [40］．一个正确的选择导致一扇门被打开，通往一个连接的房间，里面有小狗的家庭被褥和它的窝友，而一个错误的选择导致了一个死胡同，随后被捡起来放在一个空笼子里隔离1分钟。每个选择臂的入口处都有门，一旦做出决定，就可以避免回溯。记录每个新生儿在十次试验中正确选择的数量。

开放场地测试(OFT):这项测试是在PND 23上的小鼠身上进行的。它最初是作为一种测量啮齿动物情绪行为的方法引入的。该测试为评估啮齿动物的运动活动、兴奋性、情绪和探索行为提供了一种通用的测量方法。OFT是大多数行为研究中非常重要的程序。它由一个40厘米× 40厘米× 25厘米高的方形木箱组成[42]，红色的墙壁和白色的地板被分割成16个相等的正方形(每个正方形4 × 4厘米)，使用永久性油漆[43，44］．实验在上午10点到下午4点之间在一个安静的房间里，在白光下进行所有动物在实验前1小时从笼子中取出食物和水后被带到测试环境。实验动物交替从笼子中取出;然后轻轻地把动物放在空地中央，录像3分钟[45］．每次试验结束时，露天场地用10%异丙醇彻底清洁竞技场，并在应用新实验对象之前用纸巾擦干，以防止之前大鼠残留的气味可能对其行为产生影响[46］．

在3分钟的观察期内，连续监测实验大鼠在OPF中的行为[44]，使用编码符号表示以下参数:延迟:从将动物放在竞技场中间到它迈出第一步的时间(以秒为单位)[41］．它是用秒表以秒为单位测量的。行走频率:动物走过的方格数[43，47］．这是在3分钟时间内的总计数。饲养频率:动物在有或没有前肢支撑的情况下伸直后肢站立的时间[48］．在3分钟的观察期内进行评分。梳理时间:动物挠脸、舔爪子、皮毛或生殖器的时间[48］．

神经化学参数(多巴胺(DA)，去甲肾上腺素(NE)和血清素(5-HT)水平

在最后一次测试后，大鼠在最小的干扰下被处死，以避免在几分钟内可能发生的大脑单胺浓度的变化[49］．多巴胺的测定采用商业ELISA试剂盒(多巴胺研究EIA)，该试剂盒来自Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG, Nordhorn，产品编号BA-10-0300 [50，51］．使用商业ELISA试剂盒(noradrenaline Research EIA)进行去甲肾上腺素的测定，该试剂盒由Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG, Nordhorn，产品编号BA-10-0200 [51，52］．最后，使用Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG, Nordhorn，产品编号BA E-5900的商业ELISA试剂盒进行血清素的测定[53］．

氧化应激标志物(超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和过氧化氢酶(CAT)酶活性)

在每只大鼠的脑匀浆中测量它们。SOD活性的评估依赖于该酶抑制甲硫phenazine介导的硝基蓝四唑染料还原的能力[54］．测量在560nm处持续5分钟吸光度的增加。GPX的测定采用氧化从谷胱甘肽(GSH)到氧化谷胱甘肽(GSSG)的反应由GPx酶催化，然后结合谷胱甘肽还原酶(GSSG- r)和NADPH (β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原)将GSSG循环回GSH。NADPH被氧化成NADP +。NADPH氧化为NADP +的过程可以通过在340 nm处的吸光度下降进行分光光度法监测，这表明了GPx的活性，其中测试样品中GPx的含量是耦合反应的速率限制因素[55］．另一方面，CAT的测定是基于CAT分解过氧化氢导致240 nm处光吸收的降低[56］．

统计分析

数据以均数±标准差表示。采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行多次比较，然后由Tukey Kramer进行事后检验。所有统计分析均使用Instat(版本3)软件包进行。使用GraphPad Prism (ISI®，美国)软件(版本5)绘制图表。

结果

肢体符号的发展

如图1双酚a的使用并没有显著延长幼鼠耳垂脱落的时间。此外，与BPA处理组相比，锌或硒与BPA共同施用并没有显著延长出现时间。此外，与BPA、(Zn+BPA)和(Se+BPA)处理组相比，锌、硒与BPA联合给药并没有显著延长幼犬的耳垂脱落时间。

与正常对照值相比，双酚a处理显著延长了绒毛出现的时间，达到138.6%。然而，与BPA处理组相比，锌和硒联合施用显著缩短了幼崽出现绒毛的时间，分别为75.4%和73.8%。此外，与BPA处理组相比，Zn和Se与BPA联合施用显著降低了绒毛出现的时间，达到75.4%，但与(Zn+BPA)和(Se+BPA)处理组相比，没有显著改变绒毛出现的时间(图1)．

与正常对照组相比，BPA显著延长了幼崽皮毛发育的出现时间，达到124.3%。然而，与BPA组相比，锌或硒与BPA共给的幼崽皮毛发育的出现时间显著缩短至80.5%或78.9%。此外，与BPA处理组相比，锌、硒和BPA联合施用显著缩短了幼崽皮毛发育的出现时间，达到79.7%，但与(Zn+BPA)和(Se+BPA)处理组相比，没有显著改变幼崽绒毛出现的时间。

与正常对照值相比，双酚a显著延长了幼犬的开耳时间，达到126.7%。然而，与BPA处理组相比，锌或硒联合BPA处理组显著缩短了幼犬开耳的时间，分别为82%和76%。此外，与BPA处理组相比，Zn和Se与BPA共同施用显著减少了耳开口出现的时间，达到79.6%，但与(Zn+BPA)和(Se+BPA)处理组相比，没有显著改变耳开口出现的时间。

BPA的使用并没有显著改变幼鼠睁眼的出现时间。此外，与BPA处理组相比，锌或硒与BPA共同施用并没有显著改变幼崽睁开眼睛的出现时间。此外，与BPA、(Zn+BPA)和(Se+BPA)处理组相比，同时给予锌、硒和BPA也没有改变幼崽的睁眼时间。

反射和感觉功能的发展(神经行为发展)

如图2与正常对照值相比，BPA的使用显著增加了幼犬矫直反射的出现时间(天)，达到133.33%。与此相反，与BPA处理组相比，与BPA处理组相比，锌与BPA共给的大鼠幼仔出现倒立反射的时间显著减少75%，而与BPA处理组相比，硒与BPA共给的大鼠幼仔出现倒立反射的时间没有显著改变。然而，与BPA处理组相比，锌、硒和BPA共同施用显著减少了幼崽的外观时间至75%，但与(Zn+BPA)和(Se+BPA)处理组相比，没有显著改变其外观时间(图2)．

与正常对照值相比，BPA显著增加了幼犬出现悬崖躲避的时间，达到129.63%。然而，与BPA处理组相比，锌或硒与BPA共同施用并没有显著改变幼崽出现悬崖躲避的时间。此外，与BPA、(Zn+BPA)和(Se+BPA)处理组相比，锌、硒和BPA联合给药并没有显著改变幼鼠悬崖回避出现的时间。

与对照组相比，BPA的施用显著增加了小鼠25°负地理取向的出现时间(天)，达到129.3%。相比之下，与BPA组相比，锌与BPA联合施用显著缩短了出现时间至77.36%。然而，硒共加对负地向性25°出现的时间没有显著影响。另一方面，与双酚a组相比，锌和硒联合给药显著减少了幼鼠出现负地理取向25°的时间，达到79.24%，但与单独使用锌或硒相比，没有改变。

与正常对照值相比，BPA的使用显著增加了幼鼠出现手掌抓握动作的时间(天)，达到127.42%。与BPA处理组相比，锌或硒联合BPA处理组的幼鼠出现掌抓动作的时间分别减少了77.22%和79.74%。此外，与BPA处理组相比，锌、硒和BPA联合给药显著减少了幼崽的手掌抓握时间，达到77.22%，但与(Zn+BPA)和(Se+BPA)处理组相比，没有显著影响幼崽的手掌抓握时间。

与对照值相比，BPA显著增加了幼鼠听觉惊吓出现时间(天)121.15%。与BPA处理组相比，Zn和Se共给组幼崽的生存时间显著缩短，分别为85.71%和80.16%。此外，与BPA处理组相比，锌和硒联合给药显著减少了幼崽出现听觉惊吓的时间，达到84.13%，但与(Zn+BPA)和(Se+BPA)处理组相比，没有显著改变出现听觉惊吓的时间。

新生儿t迷宫的表现

如图3与正常对照组相比，双酚a组幼鼠正确选择T-迷宫的次数显著减少至76.92%。与双酚a处理组相比，锌与双酚a处理组幼鼠在T-迷宫中正确选择的数量显著增加，达到138.33%。然而，与BPA处理组相比，硒与BPA共同施用并没有显著改变幼崽在T迷宫中正确选择的数量(图3)．此外，与BPA组相比，Zn和Se联合施用可显著提高T-迷宫中幼鼠的正确选择数量，达到141.7%，但与单独施用Zn和Se相比没有显著变化。

在开放场地测试(OFT)中的表现

如图4与正常对照值相比，BPA使幼鼠的潜伏期显著提高至138.5%。与BPA处理组相比，Zn和Se与BPA处理组的潜伏期分别显著缩短至72.2%和77.8%。此外，与BPA处理组相比，Zn和Se联合施用可使潜伏期显著缩短至73.3%，但与(Zn+BPA)和(Se+BPA)处理组相比，潜伏期没有显著改变。与正常对照值相比，BPA使幼鼠的行走频率显著降低至66.7%。与此相反，与BPA处理组相比，锌或硒与BPA处理组的幼崽行走频率分别显著提高至140%和143.33% (图4)．此外，与BPA处理组相比，同时给予Zn和Se可使幼鼠的行走频率显著提高至146.7%，但与(Zn+BPA)和(Se+BPA)处理组相比，行走频率没有显著变化。

与对照组相比，BPA的施用显著提高了饲养频率，达到167%。相反，与BPA处理组相比，锌或硒与BPA处理组的幼崽饲养频率分别显著降低至60.4%和63%。此外，与BPA处理组相比，Zn、Se和BPA处理组的饲养频率显著降低至66.5%，但与(Zn+BPA)和(Se+BPA)处理组相比，饲养频率没有显著变化。与对照组相比，BPA的使用并没有显著改变梳理毛发的时间。此外，与BPA处理组相比，锌或硒与BPA共同施用并没有显著改变幼犬的梳理时间。与BPA、(Zn+BPA)和(Se+BPA)处理组相比，同时给予锌、硒和BPA也没有显著改变幼犬的梳毛时间。

神经化学参数

如图5与正常对照值相比，BPA诱导大脑DA含量显著升高至777.8%。与BPA处理组相比，锌和硒与BPA处理组脑DA含量显著降低，分别为37.14%和51.43%。与BPA、(Zn + BPA)和(Se + BPA)处理组相比，Zn、Se与BPA联合处理组脑DA含量分别显著降低20%、53.85%和38.97%。与对照组相比，BPA组的脑NE水平显著降低至13.64%。与此相反，与BPA处理组相比，锌或硒共施用可使脑NE水平显著升高，分别达到350%和233.3%。此外，与BPA、(Zn + BPA)和(Se + BPA)处理组相比，同时给予Zn和Se可使脑NE水平显著升高，分别达到500%、142.86%和214.3%。与对照组相比，BPA也导致大脑中5-HT水平显著降低至15.2%。与BPA相比，Zn和Se与BPA共同作用时，大脑5-HT水平分别显著升高至314.3%和242.9%。与BPA、(Zn + BPA)和(Se + BPA)处理组相比，Zn和Se + BPA处理组脑内5-HT水平分别显著升高至457.14%、145.5%和188.23% (图5)．

氧化应激标记物(SOD, GP_X和猫)

如图6，与对照值相比，BPA诱导大脑SOD活性显著降低至13.8%。与此相反，与BPA处理组相比，锌或硒共处理组大脑SOD活性显著升高，分别达到249.3%和268.6%。与BPA、(Zn + BPA)和(Se + BPA)处理组相比，Zn、Se与BPA联合处理组脑SOD活性显著升高，分别达到511.4%、205.2%和190.4%。与对照组相比，BPA组的GPX活性显著降低至19.7%。与BPA组相比，Zn和Se与BPA组共给药后，大脑GPX活性显著升高，分别达到187.9%和213.13%。此外，与BPA组、(Zn + BPA)组和(Se + BPA)组相比，锌、硒和BPA组的脑GPX活性显著升高，分别达到319.2%、170%和149.8%。与对照组相比，BPA使大脑CAT活性显著降低至11.6%。与此相反，与BPA处理组相比，锌或硒与BPA共同施用可使大脑CAT活性显著提高，分别达到307.55%和314% (图6)．此外，与BPA、(Zn + BPA)和(Se + BPA)处理组相比，Zn、Se与BPA联合处理组的CAT活性分别显著提高至627.4%、199.7%和210.4%。

讨论

双酚a (BPA)广泛用于生产聚碳酸酯塑料，环氧树脂和树脂，被发现在许多家庭用品，如水瓶，罐头内衬，婴儿奶瓶，和牙科树脂。BPA暴露会对身体健康产生许多负面影响，但到目前为止，人们对BPA在大脑发育过程中的作用机制知之甚少。在这项工作中，我们想要调查在大脑连接正在形成的发育阶段接触BPA是否会对大脑功能和可塑性造成长期的有害影响，这种影响比BPA暴露的时间更长[2，57］．

在目前的研究中，产后BPA暴露是在哺乳期进行的。众所周知，双酚a会在哺乳期由母体转移至胎儿[58］．先前的研究显示BPA已在成人血清、母体血液循环[59]，羊膜和胎盘液体(60]，乳房牛奶(58，61]，以及婴儿的尿液[6］．目前的研究结果表明，产后给泌乳母鼠注射BPA会导致幼鼠出生后身体和神经行为发育的下降，表现为一些身体生长标志(包括绒毛、皮毛发育、耳朵张开)的出现时间延长，以及一些反射和感觉功能(右转反射、悬崖躲避、负地理定向25度、手掌抓、和听觉惊吓)在大鼠幼仔中，相对于相应的对照组。BPA暴露并没有改变出生后早期明显的生理症状，如耳垂脱落，眼睛睁开。这些发现与Ema等人的观点一致。[62]，他们发现大鼠口服剂量为0.2 ~ 200 μg/kg/天的BPA对发育标志(如睁眼年龄)没有影响。

目前的研究与Mendl和Paul [63];卡梅伦(64和Palanza等人。[65]，这表明两种反射反应，即直立反射和悬崖跌落厌恶，可以提供有关身体和运动发育以及感觉功能和/或处理的信息。这两种反射行为和生长速度并没有因通过母亲接触BPA而发生变化。此外，Ema等人发现BPA处理对矫直反射没有显著影响。因此，这种早期行为似乎对口服BPA治疗具有抗性[62］．

当前工作的数据显示，产后锌和/或硒处理改善了BPA引起的幼鼠生理和神经行为发育的恶化，表现为加速出现一些生理和神经行为成熟的迹象，而这些迹象是由BPA延迟的(如绒毛、皮毛发育、耳朵张开、手掌抓握和听觉惊吓)，当锌和/或硒与BPA抑制一起使用时，而与BPA处理组相比，锌单独或联合使用均可使幼鼠出现偏正反射和负地向25°的时间显著缩短。围产期或新生儿BPA暴露影响大脑发育和行为[66］．BPA可诱发攻击性、焦虑、认知缺陷和学习记忆障碍[67］．锌在脑功能中的作用尚不清楚。锌是必不可少的产前和产后的生长，成熟，和功能。在怀孕早期，锌是细胞增殖和胚胎着床以及细胞分化和器官形成所必需的。缺锌会导致所有组织畸形，在怀孕后期，损害神经元的复制和迁移。据报道，锌缺乏损害钙通道，导致细胞内钙减少，抑制生长因子的基因表达和核酸和蛋白质的合成。最后，研究人员发现，无论机制如何，实验动物体内的锌缺乏会导致生命后期学习和记忆方面的不良可逆性损伤，这似乎与神经元存活率下降有关。目前尚不清楚类似的现象是否会发生在人类身上。众所周知，母体锌缺乏会导致胎儿生长迟缓，这是冠状动脉疾病的一个危险因素心疾病2型糖尿病慢性肺疾病与肥胖[68，69］．

硒是一种抗氧化剂，也是大脑硒蛋白的主要成分，可能对维持大脑功能特别重要。一般来说，硒也被认为是一种对人体健康非常重要的微量元素，可以保护细胞免受自由基的有害影响[70］．关于硒的抗氧化作用，人们认为这种微量元素通过抑制金属介导的DNA损伤来保护细胞免受自由基的有害影响。它的作用是通过谷胱甘肽过氧化物酶介导的，这些酶使过氧化氢和过氧化氢失活，这是一种强有力的脂质损伤因子[70-72］．

在本研究中，观察到在哺乳期暴露BPA显著减少了新生儿在t迷宫中正确选择的数量。这些数据表明，出生后暴露于双酚a会显著导致幼鼠学习记忆障碍。这些发现与许多研究相一致，这些研究表明哺乳期间或从怀孕开始到断奶期间学习和记忆会受到显著损害[73，74］．一些免疫组织化学检查显示，与对照组相比，产前和新生儿暴露于低剂量和高剂量双酚a的小鼠海马许多区域的胆碱乙酰转移酶样免疫反应(ChAT-IR)水平显著降低[75］．特别是，与对照组相比，产前和新生儿暴露于低剂量和高剂量双酚a的小鼠胆碱能纤维的密度显著降低[75］．人们普遍认为海马体中的胆碱能功能对学习和记忆过程很重要[73，76，77］．这些结果有力地支持了这一发现，即记忆障碍与产前和新生儿暴露于BPA的小鼠海马体中胆碱能神经元功能障碍显著对应。人们还提出了BPA的其他一些作用机制，据报道BPA可作为甲状腺受体的拮抗剂[73，78］．众所周知，甲状腺激素对大脑发育至关重要。

多项研究结果表明BPA可诱导许多器官的氧化应激[79，80］．双酚a可促进活性氧(ROS)的产生，从而导致神经元损伤[1，81］．此外，据报道BPA和一些双酚类物质会导致线粒体功能降低[82］．人们普遍认为，在发育过程中，神经元对ROS高度敏感。虽然还需要进一步的研究来阐明BPA对发育过程的影响，但这些报告的发现表明，氧化应激可能有助于BPA的作用。此外，在动物模型和人类实验中，海马体对BPA特别敏感。在活的有机体内，怀孕和哺乳期暴露于双酚a会降低海马体中的神经元密度[83，84］．一些研究报告了BPA暴露后，雌二醇和睾酮改变诱导的脊椎突触形成，不仅在大鼠中，而且在非人类灵长类动物中，海马形态也发生了改变[1，85，86］．在产前和产后暴露后，纹状体中的突触可塑性也受到干扰，多巴胺能受体的功能改变和突触可塑性发育模式的干扰，导致运动行为的控制缺陷[86］．一些研究[87]的研究报告指出，在产前和产后发育期间暴露于BPA会对与行为奖励效应相关的中枢多巴胺能系统产生长期影响。在体外暴露于BPA会对海马培养中的突触发生和潜在的神经元脆弱性产生显著影响[86，88］．BPA对突触发生的影响可能通过几种机制介导，包括一些受体系统，如雌激素(ER-ὰ和ER- b)和甲状腺受体(TRs)。海马体中的突触重塑与记忆获得、保留和学习有关[89]，在发育的关键时期接触双酚a可能会导致认知功能的改变。此外，BPA诱导凋亡细胞死亡的直接神经元毒性已被认为是通过钙，ROS在体外．相反，BPA处理后，NF-kappaB级联被激活，用于生存信号传递[1］．因此，本研究中发现的导致海马体积和神经元密度减少的机制可能是多因素的，不仅与BPA对发育中的神经元的直接毒性有关，而且还与BPA改变突触发生的能力有关，这将导致无法建立足够突触活动的神经元的发育剪枝增加。海马神经元密度和体积的减少可能反映了神经元加速分化和成熟不足，而程序性细胞死亡的正常发育过程增加[74，90］．

目前的研究表明，锌单独或联合使用显著提高了新生儿T迷宫的正确选择。在之前的研究中，研究表明锌可以改善出生前后大鼠幼崽的空间学习和记忆[91］．我们的结果与许多研究结果相一致，这些研究表明，补充锌可以改善由各种损害(如母体锌缺乏)引起的认知障碍等行为缺陷[92]，以及创伤性脑损伤[93］．锌缺乏会导致胎儿期、哺乳期和产后早期的焦虑和学习记忆障碍等几种神经行为异常，研究表明，锌可以改善大鼠幼崽产前和产后的空间学习和记忆[91，94，95］．此外，研究发现Zn通过其作为神经元信使、突触传递调节剂和皮层可塑性的功能在认知和记忆中发挥重要作用[96］．锌是神经兴奋性的关键调节因子，它在髓鞘形成、GABA和谷氨酸的释放等神经递质中起重要作用，其神经调节作用可能与其有关抗氧化剂属性。因此，补充锌对认知功能的保护作用也可能取决于它的抗氧化作用。已发现必需微量元素Zn在发育和成人神经发生的控制中起着重要作用[97-99］．目前的研究结果与其他研究结果一致[91］．

从目前的工作中获得的数据表明，出生后BPA暴露导致大鼠幼仔的运动活动显著减少，这反映在行走频率的显著减少上，并显示出大鼠幼仔的情绪和探索活动的显著提高，这反映在大鼠幼仔的养育频率和潜伏期时间的显著提高上。目前的结果得到了先前的研究结果的支持，这些研究表明，在露天测试中，口服低剂量的BPA(如0.05 mg/kg)会降低运动能力[One hundred.］．另一项研究表明，妊娠期和哺乳期暴露于双酚a都会增加雄性和雌性成年小鼠的焦虑和抑郁行为[101］．此外，妊娠暴露对女性焦虑样状态的影响更强。海马体和杏仁核中AMPA和NMDA受体水平的改变可能与bpa诱导的行为变化有关[101］．

许多动物研究表明，在妊娠期暴露于双酚A会影响大脑发展和行为。围产期或新生儿BPA暴露改变大脑性别分化[58，66］．BPA可诱发攻击性、焦虑、认知缺陷和学习记忆障碍[67，102］．围产期暴露于BPA会增加雄性小鼠的焦虑行为，并提高多巴胺水平，但雌性小鼠不会[103］．在器官发生和母乳喂养期间接触BPA会上调多巴胺受体的功能，而在其他妊娠期接触则不会，这表明存在BPA毒性的关键发育窗口[104］．在啮齿类动物和非人类灵长类动物中，即使BPA暴露水平相对较低，也会对大脑产生不利影响[58，105］．此外，许多研究表明，在妊娠期和/或哺乳期暴露于低剂量和高剂量(40-400克/公斤/天)的BPA后，行为会发生改变，如雌性幼仔的雄性化行为或过度活跃[106，107］．这些行为变化表明BPA对发育中的中枢神经系统(CNS)有一定的影响。双酚a对中枢神经系统的影响在胎儿和出生后的大脑发育中可能越来越重要，现在已成为一个公共健康问题[2］．到目前为止，这种情况很少在活的有机体内研究了孕期和哺乳期BPA暴露对大脑发育的影响[74，108］．最后，几项针对啮齿动物的研究已经调查了神经毒性的终点，并表明在发育过程中对BPA的处理会导致大脑发育和行为的改变，其剂量与人类接触有关[109］．

本研究数据显示，出生后给予锌和(或)硒显著增加了幼鼠的下床活动，降低了养育频率和潜伏期。这些结果表明，锌和/或硒能抑制BPA诱导的运动、探索活动和情感行为的改变。Zn在勘探行为中的作用尚不清楚。在另一项使用开阔田野的研究中，Sobhanirad等人[18］．和皮耶哈尔等人。110］．发现高剂量蛋氨酸锌能增强大鼠的探索活动和运动能力。有人提出锌缺乏与神经系统疾病有关，包括精神障碍和感觉敏锐度的丧失[22］．锌缺乏还可能导致应激反应增加、情绪变化和抑郁诱导的行为(攻击和焦虑)以及注意力减少和学习和记忆恶化[23，24］．先前的研究表明，产前和产后早期大鼠补充锌可以改善子代的空间学习、认知功能和运动活动。另一项研究也证明了海马中锌含量与补充锌的新生大鼠空间记忆改善之间的相关性[91］．先前的研究表明硒在小鼠体内产生一种类似抗抑郁的作用。硒的抗抑郁作用似乎最有可能是通过与多巴胺能系统的相互作用来介导的。111］．据报道，缺乏硒的小鼠OPT活性降低，焦虑增加，表现为进入场中心的减少。这表明小脑功能对硒的减少特别敏感。112］．

目前的研究结果表明，产后BPA暴露显著降低了大脑氧化应激标志物(SOD, GP_X和CAT)酶活性。目前的研究结果与众多研究结果一致，这些研究表明BPA(25-50毫克/公斤/天，I.P.注射)已被证明能增强氧化应激和脂质过氧化，促进几个器官的细胞死亡(如大脑、肝，及肾脏)[74，113］．另一项研究表明BPA暴露与氧化应激之间存在联系，这可能会导致其某些毒性作用[114，115］．多项研究结果表明BPA增加ROS的产生，从而导致神经元损伤[1，81］．氧化应激可引起线粒体损伤，损伤的线粒体可产生更多的ROS。线粒体氧化损伤的累积可引起线粒体功能障碍[82］．人们普遍认为，在发育过程中，神经元对ROS高度敏感。虽然还需要进一步的研究来阐明BPA对发育过程的影响，但这些报告的发现表明，氧化应激可能有助于BPA的作用。最后，一些研究结果表明，BPA似乎可以通过表观遗传机制诱导DNA甲基化等生理反应[116，117］．何等人。[118]，报道新生儿暴露于BPA会增加磷酸二酯酶-4的表达，这是由于早期和增加的DNA低甲基化Yaoi等人。[119的研究表明，暴露于低剂量的BPA会改变小鼠胎儿前脑的DNA甲基化。

本研究数据显示，出生后给予锌和/或硒后，大脑氧化应激标志物(SOD、GPX和CAT)酶活性显著升高。目前的研究结果与许多研究结果一致，这些研究表明，给药硒可减弱脂质过氧化并改善生化变化[120］．因此，硒缺乏与实验动物大脑中GPx活性降低有关;硒缺乏可能与大脑抗氧化能力下降有关[121，122］．锌也是抗氧化剂[123]，或作为抗氧化酶的辅助因子，而膳食锌摄入量已被证明对细胞膜的氧化损伤和动脉粥样硬化作用具有有益的作用[26，115］．此外，补充锌和/或硒显著增强了BPA对抗氧化酶、脂质过氧化和自由基形成的有害作用。结论是，补充锌和/或硒可以显著防止bpa诱导的氧化应激，这是其神经毒性的主要因素[26，99］．

本研究结果表明，哺乳期BPA暴露显著降低了大鼠脑NE和5-HT水平，显著提高了大鼠脑DA含量。这些数据与之前的研究相一致，之前的研究表明，早年接触BPA会影响多巴胺系统[124，125］．此外，在妊娠期暴露于BPA期间，猴子的中脑多巴胺神经元数量减少[126］．据报道，BPA可能影响多巴胺合成的限速酶——酪氨酸羟化酶[127］．因此，得出的结论是，BPA暴露与多巴胺能系统的改变有关，这可能是一些神经缺陷的原因，如焦虑样行为[103，128］．

此外，另一项发现表明，产前和新生儿暴露于BPA导致的多巴胺能系统功能的改变可归因于多巴胺D3受体功能的改变。许多先前的研究结果表明，产前暴露于BPA会影响单胺系统的发育。松田等。[103]报告称，产前暴露于BPA会改变大脑中单胺的浓度。此外，Tian等人。[102]的研究表明，产前和新生儿暴露于BPA会增加小鼠尾壳核中多巴胺D2受体的结合。因此，这些发现表明，产前和新生儿暴露于高剂量和低剂量的BPA可能极大地改变神经元传输，包括成人大脑中的多巴胺能传输。

在器官发生或哺乳期间暴露于BPA均显著增强了吗啡诱导的奖赏效应[104]，并导致多巴胺受体诱导的小鼠边缘前脑g蛋白激活上调[104］．一般来说，在大脑的器官发生过程中，特别是在大脑发育过程中，神经细胞和神经胶质细胞发生了快速增殖、分化或迁移[73，129］．此外，中枢神经系统的功能发育在哺乳期最为迅速[129］．因此，这些结果有力地支持了我们目前的结果，即器官发生和哺乳期是BPA暴露影响中枢神经系统发育的最敏感时期。一些研究结果表明，在器官发生过程中暴露于BPA会影响神经元干细胞的分化或迁移。此外，哺乳期暴露于BPA会影响中枢神经系统的功能发育，包括突触发生和神经元网络的构建。综上所述，这些结果可能表明，尽管BPA对成年动物的处理不会影响生殖功能和社会行为，但在产前和新生儿阶段，特别是在器官发生和哺乳期间，暴露于BPA会对中脑发育中的神经元产生毒性[73］．另一项研究结果表明，产前和哺乳期暴露于低剂量的BPA可能会调节NE、GABA和Glu系统，从而导致行为改变[130］．

本研究数据显示，出生后给予Zn和/或Se后，脑NE和5-HT水平显著升高，而脑DA含量显著降低。锌是激素运输和生产所必需的神经递质最终会影响大脑功能的前体[18，19］．此外，Zn对GABA、天门冬氨酸和去甲肾上腺素的正常功能也很重要[131］．在发育早期缺乏这种营养素会对大脑结构和功能产生不利影响[132］．妊娠期和哺乳期饮食缺锌导致后代学习和记忆功能受损[133，134］．锌是介导蛋白质和核酸生物化学的酶的辅助因子[68］．胎儿和新生儿缺锌会导致大脑DNA、RNA和蛋白质含量降低[135，136］．重要的是，胰岛素样生长因子I和生长激素受体基因表达受Zn [137］．在神经上，突触前钮扣依赖于足够的锌来将神经递质传递到突触间隙[136，138］．硒会影响大脑中激素活动(和神经递质)的化合物，这被认为是硒影响人类情绪和动物行为的原因。硒转运蛋白硒蛋白P严重缺乏或功能障碍，可引起特殊组gaba能神经元退行性变，导致神经元功能受损。这可能会导致诸如运动异常(包括癫痫)和认知障碍(如影响学习)等疾病。原因是在相应的大脑区域——海马体、大脑皮层和小脑——有大量利用氨基丁酸的神经元。DA的途径也可能是硒依赖的;硒在黑质纹状体通路中具有神经保护作用，但高浓度时，硒对多巴胺能神经元有毒性作用。最近的研究结果也指出了乙酰胆碱神经传递的参与。硒与神经元信号相互作用的机制复杂，目前尚不完全清楚。它可能不仅限于硒蛋白的抗氧化特性，还包括炎症和其他信号机制，如蛋白质修饰和细胞膜的离子渗透性，以及钙稳态和脑胆固醇代谢的改变[139，140］．

结论

产后BPA暴露导致身体和神经行为发育的不同方面的改变和延迟。一些行为功能，如学习、运动和探索活动被推迟，而另一些行为功能，如情绪增强。锌和硒被证明可以保护幼鼠免受BPA引起的这些变化。Zn单独或联合使用对学习和某些反射的保护作用比Se更明显，而Zn和Se联合使用对脑单胺水平和氧化应激标志物的保护作用比Se单独使用更明显。因此，可以重新建议在哺乳期同时给予锌和硒，特别是在低社会经济地位的BPA暴露高风险条件下。

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