表没食子儿茶素没食子酸酯对氟诱导的氧化应激相关血液毒性的保护作用

摘要

氟(Fl)是一种自然存在的电负性化合物，被列为强毒性物质和人类致癌物。红细胞是了解不同外源生物诱导的细胞膜氧化应激敏感性的一个很好的模型。氟(25mg/kg/BW)显著提高了溶血率、硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)、偶联二烯(CD)、蛋白质羰基含量(PC)等脂质过氧化标志物，并改变了血液学参数，降低了抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽转移酶(GST)、谷胱甘肽还原酶(GR)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)。非酶抗氧化剂(还原性谷胱甘肽、维生素â′和维生素â′)和膜结合atp酶(Na+/K+- atp酶、Mg2+- atp酶和Ca2+- atp酶)水平也降低。EGCG (40mg/k/BW)与Fl联合口服28天，显著降低TBARS、CD和PC水平，显著增加膜atp酶、膜完整性、活力、酶和非酶抗氧化剂。综上所述，结果清楚地表明EGCG可显著减轻Fl诱导的大鼠血液毒性。

关键字

NaF, EGCG，红细胞，氧化应激，ROS，大鼠

简介

氟是一种普遍存在的天然化合物，也是一种广泛存在的工业污染物，是自然和人为共同作用释放到环境中的。低浓度的氟已被证明对牙齿和骨骼发育有益，因此，几十年来，许多国家广泛使用饮用水源中氟的预防性补充[1］．此外，氟化合物广泛应用于工业、农业和家用化学品，如清洁产品、杀虫剂、灭鼠剂。因此，每年都有成千上万的报告与过量摄入含氟牙科产品和意外或自杀性接触含氟化学品有关的急性或致命中毒。长期摄入高剂量氟中毒会对健康造成不良影响，例如氟牙症和氟骨症、关节炎、骨质疏松症、不孕症和智力迟钝[2］．地方性氟中毒是一个严重的全国性问题，在许多国家影响到数百万使用高含氟地下水满足日常需要的人[3.］．氟化物通常被描述为一把双刃剑，因为在小剂量下，它是一种重要的微量元素，对预防龋齿和骨质疏松有显著的保护作用。另一方面，过量接触氟对机体产生有害影响。它可以通过与酶分子的金属部分形成络合物，直接或间接地调节酶活性[4］．通过这种方式，Fl干扰了碳水化合物、脂类和蛋白质的代谢过程[5］．氟抑制主要代谢途径的酶，如糖酵解和克雷布斯循环。此外，Fl抑制脂肪酸氧化，降低丙酮酸脱氢酶的活性，从而减少了细胞中乙酰辅酶a的数量。氟负调控三磷酸腺苷酶(一种在氨基酸聚合中起重要作用的酶)的活性，从而抑制氨基酸与多肽结合的过程并阻断DNA合成[6］．长期暴露于Fl化合物可引起许多细胞特别是红细胞的ROS变化，导致细胞功能受损[7］．

活性氧(ROS)通过细胞代谢和其他外源性环境因子在红细胞中产生。它们是由一种称为氧化还原循环的过程产生的，并由过渡金属(如Fe)催化²⁺和铜²⁺［8］．当人类和动物接触氟化物时，它们经历了ROS/RNS的增加，包括过氧自由基(ROO.)、超氧自由基、单线态氧、羟自由基(OH.)通过Fenton。氟化物可通过过量产生活性氧而抑制抗氧化剂，增加红细胞脂质过氧化[9］．

血液是参与氟化物分布的主要组织[10］．然而，Fl诱导红细胞(rbc)死亡的能力，以及这一过程背后的分子机制，尚未得到充分的研究。两项研究描述了患氟中毒的牛贫血的发展[11]以及暴露于亚致死剂量氟化物的小鼠[12可能预示着红细胞过早死亡Susheela [13]报道了Fl中毒的人体与严重贫血有关，这是由于细胞膜变性导致红细胞寿命缩短，使它们变成了棘皮细胞。最近，暴露于NaF的大鼠红细胞对与Na相关的单价阳离子在质膜上的运输产生了明显的抑制作用⁺- k⁺-泵抑制和Ca²⁺端依赖K⁺损失(14］．

关于营养保健品有益作用的现有知识对营养疗法产生了巨大影响，并刺激了对富含生物活性化合物的营养保健品有利特性的研究。饮食调整是血液系统异常管理的关键因素之一。多年来，多酚类植物化学物质被认为可以通过清除自由基来保护细胞免受氧化损伤。在所有的多酚类化合物中，EGCG因其广泛的生物学特性而受到广泛的关注。流行病学证据显示，饮用富含egcg的绿茶可预防人类某些慢性疾病[15，16，17］

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是从绿茶中提取的主要儿茶素之一，具有广泛的生理作用，包括抗氧化活性、自由基清除、离子螯合和抗炎特性[18-21］．我们实验室最近的一项研究表明EGCG对Fl诱导的毒性具有肝保护活性。基于EGCG的亲脂性和多种药理作用，我们假设EGCG的有益作用可以扩展到红细胞的细胞内部分，并防止Fl过量产生ROS引起的病理改变[22，23］．

因此，本研究旨在评估补充EGCG对Fl诱导的大鼠血液毒性的治疗潜力。我们还试图通过研究血液中红细胞部分的脂质过氧化、抗氧化酶等生化标志物来阐明其治疗作用的分子机制。

材料与方法

化学物质

EGCG (图1)， NaF和calcein-AM，购自Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)。所有其他化学品和溶剂(冰醋酸、肝素、硝基蓝四氮唑氯化铵、磷酸二氢钾、还原性谷胱甘肽、磷酸二氢钠、氟化钠、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、过氧化氢)均为经认证的分析级，购自孟买S.D.精细化学品公司或印度孟买Hi media实验室私人有限公司。试剂盒从印度孟买的span诊断公司获得。

动物

健康雄性白化Wistar大鼠(160-180克)来自于安纳马莱大学Rajah Muthiah医学院和医院实验医学系中央动物屋，饲养在空调房间(25±2°C)，周期为12小时(光照)- 12小时(暗)。食物和水被随意提供给所有的动物。研究方案得到了Rajah Muthiah医学院和Annamalainagar医院机构动物伦理委员会的批准。160/1999号/ CPCSEA;第952/2012号提案)，实验设计按照印度政府社会正义与赋权部和奇丹巴拉姆Annamalai nagar大学Annamalai University机构动物伦理委员会批准的现行伦理规范进行。

药物的选择和制备

NaF剂量(25 mg/kg/BW)选取自Chinoy的既往报道[24］．NaF溶解于生理盐水中，每日灌胃给药，持续4周。在NaF给药前90分钟，以10% tween 80溶解EGCG粉，每日以20、40和80 (mg/kg/BW)剂量口服，持续4周。采用三种不同剂量的EGCG(20、40和80 mg/kg/BW)对氟处理大鼠进行了初步研究，以确定剂量依赖性效应。实验4周后，观察到20、40和80 mg/kg EGCG预处理显著(p<0.05)降低氟中毒大鼠氧化标志物水平，提高酶促和非酶促抗氧化水平。与20、80 mg/kg组相比，40 mg/kg组效果显著。因此，我们选择EGCG的有效剂量为40 mg/kg进行研究。

实验设计

将动物分为四组，每组6只，分别给予口服治疗，治疗方法如下:

•I组:标记为对照组，仅接收车辆

•第二组:标记为阳性对照，接受40 mg/kg/BW EGCG剂量

•III组:标记为NaF对照组，剂量为25mg/kg/BW

•IV组:标记为EGCG (40 mg/kg/BW)和NaF (25mg/kg/BW)预处理

所有治疗均采用胃内插管口服。研究总时间为28天。定期记录食物和水的摄入量。最后一次给药48小时后，肌肉注射盐酸氯胺酮(25 mg/kg)麻醉大鼠，颈椎断头处死。血液样本被收集到肝素化管中，并进行生化估计。获得的血液被离心分离血浆和红细胞。将包装好的红细胞在冰冷的磷酸盐缓冲盐水(pbs -磷酸盐缓冲液0.01 M, pH 7.4，含0.15 M NaCl)中洗涤三次，然后使用。为了测定氧化应激参数，采集的血液在5000转/分下离心10分钟以分离血浆。用0.9% NaCl洗涤红细胞3次。洗净的红细胞用dH2O (1:3, v/v)在0℃下裂解30分钟。从裂解液中提取所有样品。 After extraction, samples were stored at -80oC before performing the appropriate analytical method.

生物化学分析

血液学的参数

红细胞计数(RBC)、白细胞计数(WBC)使用Sysmex公司的自动血液学分析仪KX-21N进行估计。用莱特氏染色的血液涂片进行白细胞计数。采用Duke法测定血红蛋白浓度、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)、血小板计数和出血时间[26]， Sabrazes毛细管法凝血时间[27］．

红细胞和红鬼膜的分离

Dodge等制备红细胞及其虚膜[28]和费尔班克斯等人[29略作修改。填充细胞用生理盐水冲洗。用Tris-buffer, 0.31 M, pH 7.4清洗包装后的细胞，用于生化评估。另一个填充细胞通过添加低渗5毫米磷酸盐缓冲液(pH 8.0)和1毫米EDTA进行溶血。4-6 h后，在4-6◦C下，12000转/分离心45分钟，红细胞虚影沉积。溶血液用于抗氧化试验。红细胞膜微球悬浮在0.02 M Tris-buffer (pH 7.2)中，用于各种生化分析。红细胞膜蛋白含量由Lowry et al.[30]测定。

红细胞膜脂过氧化的测定

硫代巴比妥酸反应物质的脂质过氧化按照Esterbauer和Cheeseman方法测定[31]，并根据Reznick和Packer所描述的方法测量蛋白质羰基水平[32］．红细胞结合双色氨酸的测定依据Konings [33］．

非酶抗氧化剂的测定

还原性谷胱甘肽(GSH)含量参照Beutler等方法估算[34]，以μmol /g Hb表示。用Ellman方法测定与二硫代硝基苯甲酸反应后的总巯基(TSH)。35］．按照Omaye等人的方法测定维生素C和E的浓度。[36]和德赛[37),分别。

酶促抗氧化剂测定

第二个试管中的红细胞用四倍稀释的水溶解，然后反复冻融循环。根据Misra和Fridovich描述的方法估算SOD (U/g Hb)活性，[38］．CAT (U/g Hb)，活性采用Aebi [39]，通过测量过氧化氢在240 nm处的分解。GPx (U/g Hb)活性采用Flohe和Gunzler [40]，以t-丁基过氧化氢为底物，NADPH在240 nm处氧化。数值以每克血红蛋白的单位表示。采用Goldberg和Spooner方法测定红细胞GR活性[41］．GR活性在红细胞中表现为nM NADPH氧化为NADP/ g Hb/min。谷胱甘肽s转移酶(GST)测定[42］．葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)活性使用试剂盒(来自(R&D) span diagnostics Ltd.，印度)进行测定，该试剂盒用于快速定量测定G6PD活性，同时评价同一样品中的血红蛋白含量，以单位/克血红蛋白(U/ g Hb)表示结果。

膜结合酶测定

Na⁺/ K⁺- atp酶的测定，采用Quigley和Gotterer方法，[43］．Na⁺/ K⁺- atp酶活性在两种条件下测定;在Mg存在时²⁺, Na⁺/ K⁺(总atp酶)，其次是Mg²⁺, Na⁺/ K⁺和乌本苷。Na⁺/ K⁺- atp酶活性测定为总atp酶活性与瓦巴因不敏感atp酶活性之间的差异。采用Fiske和Subbarrow方法估算atp酶作用下释放的无机磷酸盐，[44］．Ca²⁺- atp酶活性参照Desaiah等方法测定。[45］．Mg²⁺- atp酶活性在1mM EGTA(特异性螯合Ca²⁺离子)，并从总活性中减去这一项，以得到净Ca²⁺atp酶活性。

红细胞活力测定

根据Bratosin等人描述的程序，使用钙黄素- am(钙黄素乙酰氧基甲酯)评估大鼠红细胞的活力。[46钙黄素，非荧光膜透性染料，迅速进入活细胞，在那里它被胞质酯酶转化为绿色荧光钙黄素，保留在膜完整的细胞中，但从死亡或受损细胞中挤出。钙黄蛋白am在DMSO中制备为10mm的原液，并在-20ºC下存储。每次实验前用培养液稀释原液至100 μM工作液。对照组和naf处理过的红细胞(100 μl, 1%红细胞压积)用5 μM calcein-AM在37ºC黑暗环境下孵育45 min。然后用1ml培养液稀释样品，立即进行流式细胞术。流式细胞分析采用EPICS XL细胞仪(Beckman Coulter Inc.， Brea, CA, USA)，使用SYSTEM II (Version 3.0)软件进行采集和分析。在对数尺度上设置荧光通道FL-1。每个实验分析3 × 104个细胞的生存能力。

红细胞膜完整性的测定

采用溶血法测定红细胞膜的完整性。NaF孵育后，样品沉淀(3000 rpm, 4ºC, 5分钟)，收集上清液。根据上清液中的血红蛋白(Hb)含量，在405 nm处用光度法测量细胞溶血。在蒸馏水中溶解红细胞的上清液吸收按100%溶血计算。

统计分析

所有数据均采用SPSS/10学生软件进行分析。假设检验方法包括单因素方差分析(ANOVA)和LSD。三组实验数据均以均数±标准差表示，以P < 0.05为显著性。对照红细胞与红细胞比较，差异有统计学意义⁺EGCG;红细胞⁺EGCG vs红细胞⁺氟化钠;红细胞⁺NaF和红细胞⁺40 mg/kg/BW EGCG。

结果

EGCG对对照组和实验大鼠摄食量、体重变化及器官体重比的影响

Fl和EGCG对正常和实验动物摄食量和饮水量、体重变化及器官:体重比(%)的影响见表1．氟化氟处理后，大鼠的水和颗粒消耗量显著降低(P < 0.05)，体质量显著下降。口服EGCG后大鼠体质量比显著增加(P < 0.05)。对照组大鼠与单独EGCG治疗大鼠之间未观察到明显变化。

EGCG对血液参数的影响

文中介绍了EGCG对对照大鼠和实验大鼠血液参数研究的影响表2．检测出血时间(min)、凝血时间(s)、RBC (Lakhs)、Hb (g/dL)、MCV(fl)、MCH (pg)、MCHC (g/dL)、(%)、WBC(千)、淋巴细胞(%)、中性粒细胞(%)等血液学参数。与对照组相比，Fl组大鼠红细胞、血红蛋白、循环血小板、白细胞、淋巴细胞和中性粒细胞等血液学参数显著降低(p< 0.05)。口服EGCG显著(p< 0.05)改善了这些改变的参数，如RBC、WBC、淋巴细胞和中性粒细胞计数高于单纯氟化氟治疗组。与对照组相比，EGCG单独处理大鼠的血液学参数也显著增加(p< 0.05)。

EGCG对红细胞膜脂过氧化的影响

结果显示EGCG对对照组和实验组动物红细胞膜氧化应激标志物指标的影响图。2．氧化应激标志物TBARS、蛋白羰基(PC)含量和共轭二烯(CD)活性显著升高(P < 0.5)。与对照组相比，口服EGCG可显著(P < 0.5)恢复脂质过氧化标志物。EGCG对照组与车辆对照组之间无显著差异。

EGCG对氟诱导红细胞非酶抗氧化变化的影响

表3显示对照大鼠和实验大鼠的非酶抗氧化剂水平，即GHS、维生素C和E。与对照组相比，氟化钾处理大鼠红细胞中非酶抗氧化剂谷胱甘肽、维生素C和E水平显著降低(p < 0.05)。EGCG能显著(p < 0.05)恢复Fl中毒大鼠GSH、维生素C和E的耗尽水平。与对照组相比，EGCG单独治疗大鼠没有明显改善。

EGCG对氟诱导红细胞酶抗氧化活性变化的影响

EGCG对对照组和实验大鼠红细胞SOD、CAT、GPx、GR、GST和G6PD活性的影响均为阴性表4．与对照组相比，Fl中毒大鼠SOD、CAT、GPX、GR、GST和G6PD活性显著降低(p<0.05)。与Fl单独处理的大鼠相比，EGCG与F联合给药前大鼠SOD、CAT、GPX、GR、GST和G6PD活性均有显著(p<0.05)恢复。与对照组相比，EGCG单独处理的大鼠这些酶抗氧化活性显著提高(p<0.05)。

EGCG对红细胞膜结合atp酶的影响

图3显示预给药EGCG对Fl中毒大鼠红细胞膜结合钠的影响⁺/ K⁺atp酶、镁²⁺- atp酶和Ca²⁺- atp酶水平在对照和实验大鼠。与对照组相比，Fl处理大鼠红细胞膜结合atp酶水平显著降低(p<0.05)。与Fl单独处理组相比，EGCG联合Fl可显著(p<0.05)提高红细胞膜结合atp酶水平。与对照组相比，EGCG单独处理大鼠的膜结合atp酶无明显变化。

EGCG对氟改变大鼠红细胞活力的影响

图4显示了EGCG对对照组和实验动物fl处理大鼠红细胞活力的影响。用钙黄蛋白am进行流式细胞术分析，与对照组相比，Fl中毒大鼠红细胞酯酶活性显著降低(p<0.05)。EGCG给药后大鼠红细胞酯酶活性显著(p<0.05)高于Fl单独给药大鼠。与对照组相比，EGCG单独处理的大鼠红细胞酯酶活性没有改善。

EGCG对氟改变红细胞膜完整性的影响

EGCG对对照组和实验大鼠红细胞Fl改变膜完整性的影响图5．与对照组相比，氟中毒大鼠溶血增加，膜完整性降低(p<0.05)。与Fl单独处理相比，EGCG显著(p<0.05)降低了大鼠的溶血率，增加了红细胞的膜完整性。EGCG单独处理大鼠红细胞未见明显溶血现象。

讨论

氧化应激是一种不受控制的自由基过量产生的状态，超过了适当的抗氧化中和的阈值，从而对正常细胞造成损害。氟的消耗与自由基的产生有关，自由基可与多不饱和脂肪酸反应生成脂质氢过氧化物，进而引发脂质-自由基链式反应，导致细胞膜氧化损伤[47］．红细胞的作用及其产生自由基的倾向可被认为是氧化反应中的敏感细胞和中间细胞[48］．铁是一种强有力的过渡金属催化剂，铁的存在使红细胞极易受到过氧化损伤[48］．红细胞细胞膜富含多不饱和脂肪酸，多不饱和脂肪酸是自由基反应的主要目标，并可能使红细胞易受氧化损伤[49］．在用于识别一般健康状况的各种指标中，体重是大鼠的可见指标之一。在4周的实验期间，除测定体重外，还测定了相对对照组和实验大鼠的饮食和饮水变化。在我们的研究中发现Fl处理大鼠体重增加减少，水和食物摄入量减少。也有报道称，暴露于Fl的大鼠饮水和食物摄入量减少，生长速度迟缓，器官体重改变[50］．EGCG (40mg/kg BW)对Fl中毒大鼠的形态学改变显著减弱，与Fl处理大鼠相比，EGCG显著有效地恢复了形态学改变。在许多体外系统和体内模型中，EGCG已被报道表现出强大的供氢、抗氧化和清除自由基的特性[51］．

在压力下，血液参数可能是更快速和可检测的变化，是评估不同健康状况的燃料[52］．因此，在生命科学的临床和实验研究中的血液学参数不能被过分强调。特别是，文献报道已证明，在不同动物物种中，血液参数从正常状态的改变可作为疾病或应激的有价值指标[53］．在本研究中，我们观察到F中毒大鼠由于ROS的过度产生而显示出明显的血液参数改变，这与markoviic等人的报道一致。[54］．其他数据来自Sharma等人。[55]还报道Fl改变了雌性白化大鼠的血液参数。有趣的是，egcg处理的fl中毒大鼠显示出这些血液学参数的显著更新，使它们恢复到接近正常水平。这种恢复主要是由于EGCG的强抗氧化性能及其邻近三羟基结构的存在，其中氧原子充当电子供体，与亲电离子形成键，从而帮助弥补抗氧化防御系统[56］．ROS介导的氧化应激通过脂质过氧化在Fl诱导细胞死亡，从而引起红细胞膜功能障碍中所起的作用已得到证实[57］．MDA是自由基诱导脂质过氧化的最终产物，其含量可以反映红细胞脂质过氧化水平，促进细胞膜完整性和细胞活力的退化[58］．除了细胞脂质外，研究表明细胞蛋白质也可能受到自由基积累的影响。蛋白质羰基衍生物的形成被认为是蛋白质氧化损伤的有用测量方法[59］．蛋白质的羰基衍生物可能是由氨基酸侧链的氧化修饰和ros介导的肽裂解产生的。在我们的研究中，我们观察到Fl处理的大鼠红细胞膜上脂质过氧化、蛋白质羰基含量和偶联双烯的水平增加。这些结果与之前shivarajashankara和shivashankara的报道相似[60］．EGCG可显著降低nafh中毒大鼠脂质过氧化、偶联二烯和蛋白质羰基化水平，显示EGCG具有清除自由基的能力。这可能是由于4环结构中存在8个羟基，易于溶于水，并在EGCG代谢过程中被修饰成多因子成分，如硬脂酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸，据报道，这些成分表现出增强的ROS清除活性，从而减少fl诱导的氧化应激[61］．

本研究揭示了氟中毒对红细胞膜中非酶抗氧化剂水平的影响。氟化钾处理显著降低还原性谷胱甘肽(GSH)、维生素C和维生素E水平。这些结果与Shanthakumari等人的发现相印证。[57他们发现氟化钾处理过的红细胞中非酶抗氧化剂水平下降。与对照组相比，氟中毒大鼠给予EGCG后非酶抗氧化水平显著升高。这可能是由于EGCG中存在羟基，它提高了II期抗氧化酶水平，并对Fl诱导的氧化应激提供保护。

抗氧化酶，如SOD, CAT, GPx, GR, GST和G6PD，被认为是细胞抵御氧化应激介导损伤的第一道防线。评估这些抗氧化酶是评估fl诱导毒性中促氧化剂-抗氧化状态的一种适当的间接方法。其中，SOD和CAT是清除ROS和活性氮的重要酶。SOD是一种酶，负责将超氧自由基转化为过氧化氢等危害较小的产物，而CAT则能减少过氧化氢，保护组织免受高活性羟基自由基的侵害[62］．在我们的研究中NaF中毒显著降低了SOD和CAT的活性，这与Montalvo等人的发现是一致的。[63)。谷胱甘肽相关酶如GPx, GR和GST直接或间接作为抗氧化剂。GPx是一种含硒酶，利用谷胱甘肽将过氧化氢分解成无毒产品。在本研究中，Fl处理降低了红细胞细胞膜中GPx、GR和GST的活性。布鲁斯等人。[64]报道了nafh处理大鼠GPx和GST活性水平下降和GSH水平下降的主要原因是ROS的过度产生，这与本研究结果一致。GPX、GST和GR是SH依赖酶，它们的SH基团被fl诱导的ROS灭活，导致酶失活。EGCG通过恢复GSH水平和抵消Fl中毒产生的自由基，显著上调GPx、GST和GR水平。在fl中毒的大鼠中，G6PD活性的降低表明NADPH的生成受损，而NADPH是将GSSG还原为GSH所必需的[60］．EGCG给fl中毒大鼠后，由于EGCG的抗氧化增强特性，这些抗氧化系统明显恢复到接近正常水平[65，66，67，68］．

在许多病理条件下，膜相关酶(如atp酶)的活性下降已被报道[69］．在本研究中，在fl处理的大鼠中观察到红细胞中膜结合atp酶的活性显著降低。钠活性降低⁺/ K⁺atp酶可能是由于自由基对F诱导的脂质过氧化增强，因为Na⁺/ K⁺atp酶是一种含-SH‖基团的酶，具有脂质依赖性。钠活性降低⁺/ K⁺atp酶可导致钠流出减少，从而改变膜的通透性[70］．膜渗透性的破坏或膜的破碎导致钙离子的泄漏²⁺离子进入细胞，从而增强不可逆的细胞破坏。Ca²⁺过量给药Fl也降低了Ca²⁺细胞膜atp酶活性。人们普遍认为，由于Fl对SH基团具有较高的亲和力，它能与各种酶蛋白结合并使其失活。毫克²⁺atp酶活性参与细胞内其他需要能量的过程，对脂质过氧化反应敏感。EGCG能显著降低大鼠红细胞脂质过氧化水平，维持细胞膜结合酶活性。这可能是由于EGCG能够通过抑制膜脂过氧化作用保护SH基团免受氧化损伤，稳定膜。红细胞活力的抑制可能与质膜破坏导致包括血红蛋白在内的细胞蛋白的释放有关。间接抑制红细胞膜的完整性[71］．许多报道证实fl诱导的细胞凋亡与膜g蛋白的激活有关，并随后刺激PKA-， PKC-，酪氨酸激酶-，pi -3激酶依赖的信号通路，可能在MAP激酶上收敛[72］．此外，Fl诱导明显的氧化应激，导致活性氧(ROS)的产生，过度脂质过氧化(LPO)和细胞内抗氧化酶(如过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶)活性的改变[73］．在本研究中，由于ROS的过度产生，Fl中毒大鼠红细胞的活力和膜完整性显著降低，这与Anuradha等人先前的报道一致。[74]和蔡等人。[75］．许多其他的报道也归因于Fl破坏线粒体外膜，从而触发细胞色素C释放到细胞质中，并激活内在的(caspases-9和-3依赖的)凋亡途径并损伤红细胞[76］．EGCG具有强的抗氧化性，能稳定细胞膜，维持红细胞膜的完整性和活力，能显著恢复Fl中毒大鼠的细胞膜完整性，提高红细胞的活力。

结论

综上所述，氟暴露通过增加溶血、脂质过氧化、蛋白质氧化和降低膜结合atp酶、酶性和非酶性抗氧化剂活性来诱导大鼠红细胞氧化应激。口服EGCG可能通过降低脂质过氧化和蛋白质氧化水平，提高红细胞膜中酶抗氧化剂和非酶抗氧化剂的活性来拮抗Fl诱导的大鼠红细胞膜氧化应激。

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