花蒿甲醇叶提取物对亚砷酸钠致Wistar大鼠毒性的保护作用

Akinboro Akeem^1＊， Badmus Jelili²，阿德多苏·奥拉尼²阿金博罗·阿德塔约²和akiniran Rofiat²

¹尼日利亚奥格博莫索拉达克阿金托拉理工大学纯粹与应用生物学系

²拉达克阿金托拉理工大学生物化学系，奥格博莫索，尼日利亚

*通讯作者:: Akinboro Akeem
尼日利亚奥格博莫索拉达克阿金托拉理工大学纯粹与应用生物学系
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收到的日期: 06/9/2021;接受日期:20/9/2021;发布日期: 27/9/2021

摘要

植物的生物活性成分保护人体免受重金属引起的毒性。本研究考察了黄芪甲醇叶提取物的保护作用Holarrhena多花植物(MLEHF)抗砷酸诱导的雄性Wistar大鼠毒性。用两种剂量的提取物(100和200 mg/kg体重(b.w))预处理动物14天，然后在最后一次给药24小时后腹腔接触砷化钠(5mg /kg b.w)。检测血清TNF-α、尿素和肌酐水平。同时测定大鼠脾脏、睾丸和心脏的总蛋白(TP)、还原性谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、脂质氢过氧化物(LHP)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)。结果表明，砷酸盐只引起血清TNF-α、尿素和肌酐的显著升高。砷酸盐诱导大鼠心脏、睾丸和脾脏脂质过氧化(MDA和LHP)水平显著升高(P<0.05)。与未暴露对照组相比，砷酸盐显著降低心脏和睾丸GSH、SOD和GPx活性(P<0.05)。MLEHF可抑制砷酸盐对大鼠血清TNF-α、尿素、肌酐水平及睾丸和心脏GSH、SOD、GPx活性的不良影响。该提取物还逆转了砷酸盐诱导的心脏、睾丸和脾脏脂质过氧化(MDA和LHP)的增加。提取物的保护作用可能与叶提取物中的多酚类化合物有关。

关键字

Holarrhena多花植物，亚砷酸钠，氧化应激，抗炎

简介

已知接触不同来源的重金属会引发氧化应激，从而损害生物体的健康状况[1］．科学发现需氧生物的氧化应激与严重的退行性疾病如心血管疾病和癌症有关[2］．砷是自然存在的金属元素，在环境中无处不在[1］．自然、工业和非故意排放被认为是人类接触环境中a的主要来源[2］．由于工业或农用化学废物的径流，由于灌溉和工业作业对地下水的过度抽取，水被砷酸盐污染[3.］．饮用水仍然是人类，特别是成长中的儿童接触亚砷酸盐的主要途径[4］．尽管急性和持续不受控制的砷中毒与轻度炎症反应有关，[5]阻碍器官和细胞功能、氧化应激升高、神经退行性疾病、2型糖尿病[6]。此外，观察到人体膜结构和功能的下降、癌症发病率和生殖功能障碍都与砷暴露有关[7，8]。植物是人类的天赐之物，自古以来，植物就被用来增进人类的健康。史前的用法可以追溯到民间医学，将植物的各个部分以调制/汤剂的形式放在一起，以缓解疾病状况及其相关并发症[9］．最近，由于合成抗氧化剂的不良作用，研究集中在具有抗氧化潜力的植物化学物质对金属诱导的全身疾病的作用[10］．叶提取物Holarrhena多花植物最近已被证明含有多酚类化合物，对自由基具有强烈的抗氧化活性[11］．以前的一项研究揭示了叶子对亚砷酸盐诱导的肝损伤的预防潜力[9］．然而，本研究调查了叶在血清、脾脏、心脏和睾丸中砷诱导毒性的作用。

材料与方法

化学物质

亚砷酸钠[NaAs0_3.]，硫代巴比妥酸(TNB)，三氯乙酸(TCA)，还原性谷胱甘肽(GSH)和5,5 ' -二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)从Sigma Aldrich，美国获得。所有其他试剂均为分析级。

植物材料

Holarrhena多花植物叶子是在2019年6月的雨季在Ogbomoso收集的，并由尼日利亚奥约州Ogbomoso Ladoke Akintola理工大学(LAUTECH)纯粹与应用生物学系的植物学家认证。将这些叶子在室温下风干两周，之后将它们粉碎并保存在阴凉干燥的地方，直到可以使用为止。

植物提取物的制备

叶粉(100克)Holarrhena多花植物浸泡在3升70%甲醇中并剧烈搅拌。混合液在黑暗中静置72小时，间歇搅拌，然后用Whatman (No. 1)滤纸过滤。在40⁰C的温度下，用旋转蒸发器将滤液浓缩至干燥。得到的固体粗提物储存在冰箱中，直到准备用于制备测试溶液。

给药提取物的制备

叶提取物(10克)Holarrhena多花植物先用1ml DMSO溶解，再加入9ml蒸馏水作为原液浓度。随后的工作浓度进一步溶解在蒸馏水中，制成100 mg/kg和200 mg/kg体重。工作浓度下DMSO的最终浓度为1%。

实验动物，分组和协议

36只雄性Wistar大鼠，平均体重200克，来自尼日利亚奥约州奥博莫索LAUTECH健康科学学院动物馆。这些动物的处理和处理是根据我们机构处理实验动物的道德准则和行为准则，符合国际标准。它们被关在标准实验室光照条件下的笼子里(12小时光照/12小时黑暗周期)，喂食正常的大鼠颗粒和水，并让它们在两周内适应环境。将动物随机分为6组，每组6只，分别为A、B、C、D、E、f表1在下面。

组	治疗
一个	蒸馏水(对照)
B	5毫克/公斤。bw Sodium arsenite only
C	100毫克/公斤。bw extract only
D	100毫克/公斤。bw extract and sodium arsenite
E	200毫克/公斤。bw extract only
F	200毫克/公斤。bw extract and sodium arsenite

表1。动物治疗组。

组织匀浆和血清的制备

最后一个给药期24小时后，使用轻度麻醉(盐酸氯胺酮(30 mg/kg b.w))处死实验动物。这些动物被小心地打开，用注射器(刺穿心脏)将血液从心脏中抽出。切除脾脏、心脏和睾丸，在洗涤缓冲液中彻底清洗，去除可能抑制酶活性的血红蛋白。所有这些步骤都在4ºC下进行。在冰下使用特氟龙头均质器将1 g器官均质于9 ml均质缓冲液中，以保存酶活性。匀浆在9000转/分下离心10分钟，得到上清液作为线粒体后组分，并在4ºC下储存。血液采集于小素样瓶中，以4000转/分离心10分钟，采集血清。收集的血清保存在4ºC下进行进一步的生化分析。

生化参数

采用Burtis和Ashwood Biuret法测定血清和组织总蛋白[12肿瘤坏死因子α (Tumor necrosis factor -α， TNF-α)的定量测定采用固相酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞培养上清、血清和血浆中TNF-α的含量。该检测采用定量夹心酶免疫分析技术，将TNF-α特异性抗体预包覆在微板上，使用Ray Biotech诊断(Norcross, GA)试剂盒，基于抗体和抗原之间的相互作用原理来定量血清中的TNF-α [13］．血清肌酐[14]和尿素[15]按照Randox试剂盒中描述的方法进行评估。用脾脏、心脏和睾丸匀浆研究了抗氧化酶和大分子氧化产物;还原性谷胱甘肽(GSH)浓度的测定采用了Anderson [16]超氧化物歧化酶(SOD)活性采用Misra和Fridovich方法测定[17］．用硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)分光光度法测定丙二醛(MDA)，如Varshney和Kale程序所述[18］．

统计协议

结果以每个治疗组6只动物的均值±SD报告。数据分析采用单向方差分析(ANOVA)，随后Tukey使用GraphPad Prism 6.05版Windows进行事后分析(GraphPad Software, La Jolla California, USA)。www.graphpad。P<的值。05被认为有统计学意义。

结果与讨论

砷具有内在的毒理学潜力，可在砷暴露的人体组织中引发氧化应激，从而对健康产生深远影响[19］．氧化应激对几种靶器官和生物分子造成可逆或不可逆的损伤[20.］．它还限制了特定膜功能和基因表达所必需的细胞活动[21］．酶促和非酶促抗氧化系统是一种天然防御机制，可抵消金属诱导的自由基毒性所造成的恶化影响[22］．有趣的是，从许多植物中获得的生物活性成分已被证实含有可以改善和防止金属诱导的氧化应激毒性的重要成分。因此，本工作研究了甲醇叶提取物的抗炎和抗氧化作用Holarrhena多花植物亚砷酸钠诱导大鼠组织氧化应激。

肿瘤坏死因子-α (TNF-α)是一种已知的细胞间化学信使或由各种血细胞产生的细胞因子，负责调节人体的免疫反应[23］．血清TNF-α水平(P<0.05)显著升高(P<0.05)表2亚砷酸钠和提取物(D组和F组)的存在显著降低了血清TNF-α水平。这一结果与Hedayati和Co的体外研究一致，该研究报告了在芙蓉提取物存在时TNF-α的分泌增加[24］．含有免疫增强成分的植物萃取物已被证明对小鼠的乳腺肿瘤发展有预防作用[25］．亚砷酸钠及亚砷酸钠提取物对两组大鼠血清TNF-α水平的影响也可归因于亚砷酸钠粗甲醇提取物的抗炎作用Holarrhena多花植物叶子(25］．显著降低亚砷酸钠引起的血清肌酐和尿素水平的升高表明提取物的肾保护潜力[26］．

血清	一个	B	C	D	E	F
肿瘤坏死因子-α(pg / ml)	21.78±12.08	35.38±3.87	36.91±17.91	25.23±9.36	31.19±21.19	27.44±4.77
肌酐(mg / dl)	1.01±0.07	35.38±3.87	0.99±0.07	0.86±0.02	0.81±0.10	0.87±0.12
尿素(mg / dl)	56.33±6.85	72.47±12.98	57.73±6.59	43.66±3.93	53.45±8.33	47.71±3.99

表2。肿瘤坏死因子-α (TNF-αHolarrhena多花植物亚砷酸钠诱导大鼠。

数据以均数±标准差表示。同一行不同上标值差异有统计学意义(P<0.05)。A组(仅蒸馏水)、B组(仅亚砷酸钠)、C组(提取物100 mg/kg)、D组(提取物100 mg/kg +亚砷酸钠)、E组(提取物单独200 mg/kg)、F组(提取物200 mg/kg +亚砷酸钠)。

在砷改变的不同细胞内底物中，有一种水溶性含硫三肽，称为还原性谷胱甘肽(GSH)。该分子在需氧生物中的可用性和还原潜力与其半胱氨酸残基的巯基有关[27］．B组(仅亚砷酸钠)大鼠脾脏和睾丸GSH水平较对照组显著降低(P<0.05)。相反，仅用亚砷酸钠治疗的组观察到心脏谷胱甘肽水平无显著降低(表3)．观察到的谷胱甘肽水平的降低可能是由于自由基生成的增加或分子的消耗和合成的减少。因此，这可能导致细胞抗氧化能力下降，这一过程有助于组织的氧化损伤[26］．暴露于提取物和亚砷酸钠的大鼠通过逆转亚砷酸钠引起的脾脏和睾丸谷胱甘肽水平下降来保护大鼠的脾脏和睾丸。这一结果证明了粗甲醇提取物作为亚砷酸钠毒性大鼠抗氧化状态的助推器的功效。提取物的作用可能是由于其生物活性成分能够削弱亚砷酸钠与谷胱甘肽硫酰基的结合亲和力[28］．谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)是一组普遍存在于哺乳动物体内的酶，在高度易受氧化作用影响的不同组织细胞中发挥积极作用[29，30.］．GPx活性的降低可能是有毒物质持续积累导致生物分子氧化修饰的原因[31］．结果显示在表3大鼠暴露于亚砷酸钠后睾丸谷胱甘肽过氧化物酶活性显著降低(P<0.05)。经口给药的甲醇提取物Holarrhena多花植物在亚砷酸盐诱导的氧化应激中毒大鼠中，叶实质上提高了睾丸中GPx的活性。这一结果与Ugbaja和Co的报告相似[32]并增强叶子的提取能力，以改善金属诱导的睾丸酶紊乱[26］．仅暴露于亚砷酸钠的大鼠脾脏和心脏中观察到的GPx水平的不显著(P>0.05)降低可能是由于毒物的浓度或其作用在组织中需要更长的时间才显着。

参数(U / mgprotein)	组织	A组	B组	C组	D组	E组	F组
谷胱甘肽	脾	1.8±0.20^一个	1.1±0.60^c	2.5±0.60^一个	2.4±0.80^一个	2.2±0.80^一个	2.3±1.00^一个
	睾丸	0.04±0.01^一个	0.02±0.01^b	0.04±0.01^一个	0.05±0.02^一个	0.04±0.01^一个	0.04±0.02^一个
	心	4.2±0.71^一个	3.9±0.32^一个	3.8±0.25^一个	4.0±0.16^一个	3.7±0.37^一个	4.0±0.54^一个
GPx	脾	2.2±0.70^一个	2.1±0.70^一个	2.2±1.00^一个	2.30±1.10^一个	2.9±1.20^一个	2.9±1.20^一个
	睾丸	24.80±4.53^一个	14.60±2.58^b	24.60±1.50^一个	25.20±4.90^一个	29.80±4.17^一个	24.80±4.53^一个
	心	2.3±0.34	2.0±0.32	2.0±0.23	2.1±0.14	2.1±0.17	2.2±0.03
草皮	脾	ND	ND	ND	ND	ND	ND
	睾丸	3.37±1.05^一个	1.27±0.05^b	2.85±0.75^一个	3.27±0.96^一个	2.86±1.48^一个	3.28±0.72^一个
	心	89.0±25.00	48.5±13.70	61.8±13.00	3.27±0.96^一个	70.1±40.6	75.1±26.00
MDA	脾	20.3±7.8^一个	26.6±8.1^b	17.1±2.0^一个	22.5±4.8^一个	21.1±3.4^一个	16.6±3.5^一个
	睾丸	20.00±0.40^一个	34.00±0.90^b	26.00±0.40	23.00±0.60^一个	25.00±0.50^一个	19.00±0.50^一个
	心	58.90±3.53	97.00±3.63	33.80±1.53	78.40±5.31	30.40±1.35	58.00±3.24
LHP	脾	2.40±0.60^一个	4.30±0.90^b	2.70±0.90^一个	2.80±0.70^一个	2.80±0.80^一个	2.60±1.01^一个
	睾丸	ND	ND	ND	ND	ND	ND
	心	3.00±0.32	2.40±0.28	2.50±0.43	2.60±0.46	2.20±0.15	2.30±0.20

表3。青枝草甲醇叶提取物对大鼠脾脏、睾丸和心脏还原性谷胱甘肽(GSH)、氧化酶参数(SOD和GPx)、脂质过氧化(MDA)和脂质过氧化氢(LHP)的影响

同样，这项研究表明亚砷酸钠降低了睾丸和心脏组织中SOD的活性(表3)．SOD被认为是对抗细胞中氧自由基有害影响的第一道防线，通过催化超氧阴离子自由基变性为H₂O₂GPx转换H₂O₂谷胱甘肽氧化至水中[33，34］．这项研究的结果证实了先前的研究，即砷化合物对抗氧化防御系统的潜在危害[35］．亚砷酸钠介导的心脏和睾丸SOD活性改变可能与亚砷酸钠诱导的氧化应激水平升高有关[26］．甲醇叶提取物通过保护亚砷酸钠诱导的SOD活性降低，改善了睾丸和心脏组织的氧化应激。亚砷酸钠被提取物破坏的不良影响可能是由于叶子中存在多酚类化合物，如先前报道的[11]。许多生物膜的细胞成分容易被自由基氧化裂解。这些活性自由基在促进脂质过氧化的反应中与生物分子共价结合，从而直接引发细胞损伤[36]并与许多退行性疾病有关，如神经退行性疾病、癌变、炎症和衰老[37］．脂质过氧化过程中大部分膜的脂质组分降解产生不同的醛类次生产物，其中包括丙二醛(malondialdehyde, MDA)和脂质氢过氧化物，这是一种容易获得的脂质过氧化生物标志物[38］．结果表明，亚砷酸钠诱导大鼠脾脏、睾丸和心脏MDA和脂质过氧化氢水平显著升高(表3)．MDA和LHP水平的诱导可能是由于亚砷酸钠的有害作用增加了脂膜成分的氧化损伤，这是由于ROS/RNS的产生增加[39］．细胞谷胱甘肽水平的降低已被证明与本研究中观察到的脂质过氧化物形成升高呈负相关[21］．然而，亚砷酸钠处理组中MDA和过氧化氢的增加仅在提取物存在时才被消除，这表明其具有保护作用[19］．

数值用平均值±标准差表示。同一行不同上标值差异有统计学意义(P<0.05)。A组(仅蒸馏水)、B组(仅亚砷酸钠)、C组(提取物100 mg/kg)、D组(提取物100 mg/kg +亚砷酸钠)、E组(提取物单独200 mg/kg)、F组(提取物200 mg/kg +亚砷酸钠)。ND(未确定);还原性谷胱甘肽;谷胱甘肽过氧化物酶;SOD(超氧化物歧化酶);MDA(丙二醛);LHP(过氧化脂氢)。

结论

本研究证实了枸杞的抗氧化潜力Holarrhena多花植物叶提取物改善亚砷酸钠诱导的组织氧化应激。这些结果还表明Holarrhena多花植物叶子可以作为一种有效的保护剂，以防止金属诱导的毒性。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

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