蛋白表达的黄酮醇合成酶香野生仙客来(仙客来Purpurascens)

文摘

援助的发展DNA标记和新花色突变体,我们以前分离和分析类黄酮野生仙客来biosynthesis-related基因参与了芬芳的花朵颜色(仙客来purpurascens)。两个黄酮醇合成酶基因(CpurFLS1和CpurFLS2)随后被孤立和CpurFLS2发现与花的颜色。下一步,体外观察酶活性是必要的;因此,表达式CpurFLS2蛋白进行了分析。在这项研究中,我们提供最优条件重组可溶性CpurFLS2蛋白质在大肠杆菌生产。

关键字

仙客来、黄烷醇合成酶、蛋白质表达。

介绍

三个品种的芳香仙客来目前可用,所有这些都是由穿越仙客来品种仙客来persicum香味的物种c . purpurascens(1]。我们的总体目标是创建新的香品种与小说花瓣颜色使用离子束辐照。因为离子束辐照会引起大DNA重排,PCR筛选是有用的在选择理想的突变体从诱变处理仙客来开花前人口。澄清的机制花的颜色和识别的基因参与了仙客来的花颜色是有必要的(2]。

仙客来花颜色是由主要的积累植物pigment-related化合物被称为类黄酮的主要黄酮类化合物。c . purpurascens花是一个单一的花青素,二甲花翠素3 5-diglucoside (Mv3 5 dg),和两个黄烷醇,槲皮素和山柰酚(3,4]。花青素是众所周知的植物色素负责很强的花的颜色。大量的花青素生物合成相关基因已从许多植物物种包括孤立仙客来[5- - - - - -8]。然而,黄烷醇合成酶基因(s) (FLS)在仙客来尚未被孤立。黄烷醇偶尔修改花颜色当结合花青素,这一过程称为co-pigmentation [9]。例如,在佩妮FLS的下降导致的花是红色的颜色(10]。确定花青素和黄烷醇是重要的理解花的颜色。我们最近从c . purpurascens分离出两种FLS的基因(CpurFLS1和CpurFLS2),在补充实验使用一个fls的拟南芥突变体的发现,两个黄酮醇合成酶的基因功能。差这两个基因的表达也透露,CpurFLS1的组成型表达年轻的花瓣和其他器官(图1)。相比之下,CpurFLS2表达式是年轻的花瓣但无力花药,叶和叶柄。此外,没有表达CpurFLS2在开放的花瓣(图1)。这些模式建议CpurFLS1和CpurFLS2拥有功能多样性CpurFLS2,相关性和花朵颜色c . purpurascens。作为下一个步骤,因此,重要的是确定这两个功能之间的差异基因,包括底物特异性。在这个报告中,我们因此检查的最佳条件CpurFLS2蛋白表达和纯化10]。

材料和方法

蛋白表达和纯化

完整的开放阅读框(ORF)CpurFLS2互补脱氧核糖核酸(加入数量:LC210073)被使用正向引物PCR扩增和反向引物与心好网站XhoI网站。放大碎片subcloned入pGEM-T简单向量(Promega)和消化心好和XhoI。然后,切除的片段被结扎的NdeI-XhoI网站His-tagged pET16b表达载体(默克公司)收益率pET16b-CkmOMT2。插入测序仔细使用T7底漆集,以确认没有发生突变。生产重组蛋白n端与他,得到的质粒pET16b-CkmOMT2被用来变换大肠杆菌应变BL21 (DE3)(默克公司)。大肠杆菌窝藏pET16b-CkmOMT2种植在2毫升的溶原性肉汤(Difco)补充100µgmL-1氨苄青霉素,直到达成OD_600年0.4 - -0.5。后的异丙基ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG)的最终浓度0 - 0.1毫米,细胞进一步培养20°C到37°C 616 h。他们然后resuspended FastBreakTM细胞裂解试剂(Promega)和使用HisLinkTM旋转蛋白质纯化的融合蛋白纯化系统(Promega)根据制造商的协议。

结果与讨论

我们的目的是检查CpurFLS2重组蛋白质的生产大肠杆菌在不同的条件下。的孵化温度20°C, CpurFLS2重组蛋白表达后观察到的10µM IPTG,增加50岁以下的表达式µM IPTG (图2)。此外,表达较高的孵化时间8 h相比6 h (图2)。然而,随着培养时间超过10小时,CpurFLS2IPTG表达式是一样的,在任何情况下。我们随后调整了孵化温度(25°C, 28°C, 30°C,和37°C,分别)和同样分析了影响表达。在所有情况下,增加CpurFLS2蛋白质是观察;然而,在大多数情况下,蛋白质不溶性(数据没有显示)。因此,我们决定为重组可溶性的最佳条件CpurFLS2蛋白质的生产大肠杆菌1)最终IPTG浓度10µM, 2)的孵化温度20°C,和3)的培养时间8 h。

我们随后试图净化重组CpurFLS2使用His-tagged蛋白表达载体。因此,使用上面的最佳培养条件,n端His-taggedCpurFLS2蛋白质重组大肠杆菌生产的成功。的等电点CpurFLS2是6.15和假定的分子量为37.7 kDa(数据没有显示)。纯化蛋白的分子质量符合预期的融合蛋白的质量包括额外的2 kDa(他图3)。这些结果表明成功的重组可溶性净化CpurFLS2。下一步是执行的酶反应CpurFLS2来确定酶活性和底物特异性。最近两个FLS的蛋白质分离出不同颜色的洋葱,只有三个氨基酸差异AcFLS-H6(孤立的从红洋葱)和AcFLSHRB(从黄洋葱分离)。尽管相对较高的氨基酸相似性,AcFLS-HRB的催化效率大约是两倍的AcFLS-H6 dihydroflavonol时用作基质。比较预测的氨基酸序列CpurFLS1和CpurFLS2揭示了大约50差异(图4),表明不同的酶活性和/或底物特异性。检查酶活性,因此我们表达CpurFLS1在上面的文化条件下。结果,强烈的表达重组CpurFLS1是观察到的类似CpurFLS2;然而,所有人都不溶性(数据没有显示)。

结论

这些结果表明,最优生产条件的重组可溶性蛋白质之间的不同CpurFLS1和CpurFLS2。进一步说明可溶性重组的最优条件表达式CpurFLS1因此有必要的。我们以前纯化anthocyanin-O-methyltransferase (CkmOMT2)香仙客来品种“Kaori-nomai”(11,12]。CkmOMT2生产的最优条件1)最后一个100µM IPTG浓度,2)的孵化温度28°C,和3)的培养时间18 h。因此,尽管从仙客来分离蛋白质,蛋白质表达的最优培养条件根据不同蛋白质。在未来的研究中,我们将研究的问题为什么蛋白表达条件不同。这些发现将有助于研究花朵颜色在仙客来。

确认

我们感谢教授Masahide石川(埼玉县理工学院)提供帮助和建议。资助这项研究由日本促进社会科学(jsp) KAKENHI格兰特(JP15K18641)授予y .秋田犬。

引用

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