香型野生仙客来黄酮醇合成酶的蛋白表达

摘要

帮助…的发展DNA标记而新的花色突变体，我们之前分离并分析了类黄酮与芳香型野生仙客来(cyclamen purpurascens)花着色有关的生物合成相关基因。随后分离出两个黄酮醇合成酶基因(CpurFLS1和CpurFLS2)，发现CpurFLS2与花的颜色有关。下一步，在体外观察酶活性是必要的;因此，我们对CpurFLS2蛋白进行表达分析。在本研究中，我们提供了在大肠杆菌中生产重组可溶性CpurFLS2蛋白的最佳条件。

关键字

仙客来，黄烷醇合成酶，蛋白表达。

简介

目前有三个芬芳仙客来品种，它们都是由仙客来品种杂交而成的仙客来persicum有香味的物种c . purpurascens［1］．我们的总体目标是利用离子束培育出具有新颖花瓣颜色的芳香新品种辐照．因为离子束照射往往造成较大的伤害DNA在开花前从诱变仙客来群体中选择所需突变体时，PCR筛选是有用的。澄清机制因此，有必要对仙客来花着色的基因进行鉴定[2］．

仙客来的花色是由一种主要的积累控制的植物与色素有关的化合物称为类黄酮s.紫菜花中的主要黄酮类化合物为单一花青素，malvidin 3,5-二葡萄糖苷(Mv3,5dG)和两种黄烷醇，槲皮素和山奈酚[3.，4］．花青素是一种众所周知的植物色素，具有很强的花卉色彩。大量的花青素生物合成已从许多植物中分离出相关基因，包括仙客来[5-8］．然而，仙客来黄烷醇合成酶(FLS)基因尚未被分离出来。当黄烷醇与花青素结合时，偶尔会改变花朵的颜色，这一过程被称为辅色素沉着[9］．例如，低FLS会导致矮牵牛花颜色变红[10］．因此，确定花青素和黄烷醇的组合对于理解花卉的颜色是很重要的。我们最近从紫癜球菌(C. purpurascens)分离出两个FLS基因(CpurFLS1而且CpurFLS2)，并且是补语实验利用拟南芥fls突变体，发现这两个基因都在黄酮醇合成酶中起作用。这两个基因的表达也存在差异，CpurFLS1在幼花瓣和其他花瓣中均有本构性表达器官（图1)．相比之下,CpurFLS2在幼嫩花瓣中表达较强，而在花药、叶片和叶柄中表达较弱。而且，没有表达的CpurFLS2在开放的花瓣(图1)．这些模式表明CpurFLS1而且CpurFLS2拥有功能多样性， CpurFLS2与花的着色有相关性c . purpurascens．因此，下一步重要的是确定这两者之间的功能差异基因，包括底物特异性。因此，在本报告中，我们研究的最佳条件CpurFLS2蛋白质表达及纯化[10］．

材料与方法

蛋白表达及纯化

的全长开放阅读框CpurFLS2以NdeI位点为正向引物，以NdeI位点为反向引物，PCR扩增出cDNA(登录号:LC210073)XhoI网站。将扩增片段亚克隆到pGEM-T Easy载体(Promega)中，用酶切酶切心好而且XhoI．然后，将切除的片段连接到his标记pET16b表达载体(Merck)的NdeI-XhoI位点，得到pET16b- ckmomt2。使用T7引物对插入物进行仔细测序，以验证没有发生突变。为了生产在n端带有his标签的重组蛋白，将得到的质粒pET16b-CkmOMT2用于转化大肠杆菌菌株BL21 (DE3)(默克)。携带pET16b-CkmOMT2的大肠杆菌在2 ml含有100µgmL-1氨苄西林的溶生菌培养液(Difco)中培养至OD₆₀₀0.4 - -0.5。加入异丙基ß- d -硫半乳糖吡苷(IPTG)至终浓度为0-0.1 mM后，在20°C至37°C下进一步培养616 h。然后在FastBreakTM Cell Lysis Reagent (Promega)中重沉，并根据制造商的方案使用HisLinkTM Spin protein Purification System (Promega)纯化融合蛋白。

结果与讨论

我们的目的是检查CpurFLS2重组蛋白生产大肠杆菌在各种条件下。在20°C孵育温度下，加入10µM IPTG后，重组CpurFLS2蛋白表达量增加，在50µM IPTG下表达量增加(图2)．此外，与培养6 h相比，培养8 h时表达量更高(图2)．然而，当潜伏期超过10小时时，CpurFLS2表达与未加IPTG处理相同。随后我们调整孵育温度(分别为25°C、28°C、30°C和37°C)，并类似地分析了对表达的影响。在所有条件下，…的增加CpurFLS2观察蛋白质;然而，在大多数情况下，蛋白质是不溶的(数据未显示)。因此，我们确定了重组可溶性的最佳条件CpurFLS2蛋白质的产生大肠杆菌1) IPTG终浓度为10 μ M, 2)培养温度为20°C, 3)培养时间为8 h。

我们随后尝试纯化重组体CpurFLS2蛋白使用his标记的表达载体。结果，在上述最优培养条件下，n端his标记CpurFLS2在重组大肠杆菌中成功生产出蛋白质。的等电点CpurFLS2为6.15，推测分子量为37.7 kDa(数据未显示)。纯化蛋白的分子质量与融合蛋白的预期质量一致，其中增加了2 kDa的his标签(图3)．这些结果表明成功纯化了重组可溶性蛋白CpurFLS2．下一步是进行酶促测定CpurFLS2来确定酶活性和底物特异性。最近从不同颜色的洋葱中分离出两种FLS蛋白，其中AcFLS-H6(从红洋葱中分离)和AcFLSHRB(从黄洋葱中分离)之间只有3个氨基酸差异。尽管氨基酸相似度较高，但以二氢黄酮醇为底物时，AcFLS-HRB的催化效率约为AcFLS-H6的两倍。预测氨基酸序列的比较CpurFLS1而且CpurFLS2揭示了大约50个差异(图4)，提示酶活性和/或底物特异性的差异。为了检查酶活性，我们表达CpurFLS1在上述培养条件下。结果观察到重组CpurFLS1的强表达与CpurFLS2；然而，所有的都是不可溶的(数据未显示)。

结论

这些结果表明，在不同的品种中，生产重组可溶性蛋白的最佳条件不同CpurFLS1而且CpurFLS2．进一步澄清了可溶性重组蛋白表达的最佳条件CpurFLS1因此是必要的。我们之前从香仙客来品种“Kaori-nomai”中纯化了花青素- o -甲基转移酶(CkmOMT2) [11，12］．产生CkmOMT2的最佳条件是1)IPTG最终浓度为100 μ M, 2)培养温度为28°C, 3)培养时间为18 h。因此，尽管蛋白质是从客客来中分离出来的，但蛋白质表达的最佳培养条件因蛋白质而异。在未来的研究中，我们将研究为什么蛋白质表达条件不同的问题。这些发现将有助于仙客来花卉着色的研究。

致谢

我们非常感谢石川正秀教授(埼玉理工学院)提供的帮助和建议。本研究由日本科学促进会(JSPS) KAKENHI基金(JP15K18641)资助，该基金授予Y. Akita。

参考文献

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12. Park S，等。对不同颜色洋葱中两种黄酮醇合成酶的比较分析为黄酮的生物合成提供了思路。农学通报，2017;65:5283-5298。