嗜油念珠菌β-1,3-葡聚糖酶的纯化及其对扩张青霉的生物防治作用

摘要

嗜油念珠菌最初是从墨西哥奇瓦瓦Cuauhtémoc地区的苹果果皮中分离出来的，它利用外源性β-1,3-葡聚糖酶的产生作为采后苹果中对抗扩展青霉的一种作用模式。在低盐培养基上，以葡萄糖、层膜素或扩张松果细胞壁片段为唯一碳源，测定了嗜油松果产生的β-1,3-葡聚糖酶的活性。仅用葡萄糖培养48小时后，β-1,3-葡聚糖酶活性最高(249 U/L)。β-1,3-葡聚糖酶通过DEAE Sepharose上的阴离子交换层析从生长介质中纯化，与超滤后的粗提物相比，β-1,3-葡聚糖酶的比活性提高了74倍。SDS-PAGE分离纯化的β-1,3-葡聚糖酶分子量为48.3 kDa。纯化后的酶水解海藻素为最终产物葡萄糖，并在天然聚丙烯酰胺凝胶上鉴定为单体蛋白。酶在pH 5和40℃时活性最佳，在30℃时稳定1小时。纯化后的β-1,3-葡聚糖酶对扩张酵母分生孢子的萌发率和菌丝生长率分别降低到51.8%和31%。结果表明，嗜油藤产生β-1,3-葡聚糖酶是其对扩张假单胞菌的一种抑制作用方式

关键字

细胞壁降解酶，采后真菌疾病，疾病防治。

简介

近年来，用于水果采后防治的生物防治剂的发展，已被视为可替代使用合成化学产品的方法[1，2］．水果采后病原菌损害所造成的经济损失程度因国家而异，在发展中国家可达50% [3.］．控制这些采后病原体的最常见方法是使用化学合成杀菌剂，这也对人类和生态系统构成风险。世界各地都有报道，酵母菌、细菌和真菌等微生物具有控制水果采后真菌的能力[4-7］．此外，商业生物制品以c . oleophila已开发，如BioNext(比利时)和Lesaffre International(法国)等产品[8，9］．据报道，这些微生物能够控制采后真菌，如青霉菌expansum，它们单独或联合使用，可通过养分和空间竞争、耐药诱导、抗生素作用和产生裂解酶等多种作用方式，降解致病真菌的细胞壁[1］．β-1,3-葡聚糖酶等酶现在被认为是采后病原真菌生物防治的重要组成部分[1，7，10-12］．

c . oleophila是一种附生酵母，从芝麻县Cuauhtemoc的“金香”果皮中分离出来。，墨西哥[13］．这种酵母已显示出几种控制作用模式p . expansum采后的苹果果实[5，14］．

在本工作中，分离、表征和纯化了一个外-β-1,3-葡聚糖酶c . oleophila为了评价该酶作为采后苹果果实扩张青霉的生物防治剂的应用，对L-06菌株进行了试验。

材料与方法

微生物及培养条件

c . oleophila分离株来自CIAD, a.c. Unidad Cuauhtémoc, Chih的“温带微生物”标本。墨西哥。分离株保存在-80°C。的c . oleophilaL-06的β-1,3-葡聚糖酶产量较高，因此被选为本研究的研究对象。在NYDA (15 g/L琼脂、8 g/L营养肉汤、5 g/L酵母膏和10 g/L葡萄糖)中培养72 h。的p . expansum实验使用的菌株来自美国俄勒冈州胡德河的俄勒冈州立大学中哥伦比亚农业研究站。使用前，p . expansum在苹果果实中培养，然后在PDA(土豆，葡萄糖，琼脂)中4°C保存，在25°C的相同培养基中培养一周，不含琼脂(PD)。

提取p . expansum细胞壁

本程序采用Bar-Shimon等人的方法[15］．1ml ap . expansum分生孢子悬液(2 × 106个细胞/mL)接种到1 L PD肉汤中，在25°C下恒定摇床速率155 rpm下培养6天。菌丝产生的菌丝p . expansum使用Whatman No. 1纸过滤收集，然后用无菌水清洗三次，包括均质两分钟(T 25 Basic ULTRA-TURRAX®，IKA®，西班牙里奥哈)。细胞壁样品在-20°C冷冻8小时，然后按照前面的描述再次解冻和均质，直到沉淀物完全溶解。将约20 mL的均质菌丝在4℃下保存10-15分钟。这些样品以1625 × g离心(Beckman GS-15R, Ramsey, MI USA) 2分钟，丢弃上清液，再次将沉淀物悬浮在水中，再离心6次，直到得到透明的上清液。上清液冻干48 h， -20℃保存至使用。

的增长c . oleophilaL-06

L-06的发酵剂c . oleophila在50 mL的NYB(营养液，酵母提取物，肉汤)培养基中制备，然后接种到200 mL的相同培养基中，然后在30°C下，以165转/分钟的速度摇晃，孵育100小时(Precision Scientific Model 31534, USA)。L-06浓度调整为4 × 103 UFC/mL(使用血细胞计制备悬液)，初始光密度(OD)为0.001 (A500)(分光光度计VARIAN UV-Vis Cary 1E，美国)。在100小时的孵育期间，每小时无菌抽取1 mL等份以确定OD。菌落形成单位(CFU)在L-06分离物生长阶段每3小时用NYDA稀释溶液进行培养皿计数。对cfu进行Log10变换，以确定指数增长阶段。

β-1,3-葡聚糖酶在不同底物上的活性

为了获得更多的L-06细胞和更高的酶活性，酵母在NYB中生长至指数期结束。酵母细胞以4000 × g离心后转移至最低盐培养基(MSM、2.5 g/L硫胺素、0.8 g/L尿素、2.06 g/L nhh)₄没有_3.， 0.5 g/L MgSO₄， 1 g/L KH₂阿宝₄， 0.01 mg/L FeSO₄， ZnSO 8.7 mg/L₄， 3 mg/L MnSO₄含任何一种的2毫克/毫升p . expansum细胞壁碎片，层膜素或葡萄糖为唯一碳源)获得最大量的酶活性。在200 mL MSM溶液中测定酶活性，孵育时间为24、48、72、96和120小时，温度为30°C，转速为165转/分钟。β1,3-glucanase生产。按照Bar-Shimon et al.的方法获得酶提物[15］．在孵育24、48、72、96和120 h时抽取5 mL MSM，以6136 × g离心去除酵母细胞。上清液用0.2 μm Millipore过滤器过滤后用于酶促测定。沉淀物在蒸馏水中洗涤两次，并在2 mL蒸馏水中重悬，在600 nm处测量生物量。沉淀物在37°C下脱水至恒定重量，在数天内获得酵母干重。β1,3-glucanase化验。为了测定酶提取液中β-1,3-葡聚糖酶的活性，遵循Ippolito et al. 2000的程序，并测定每个培养时间点的活性。测定液中含有62.5 μL酶提液+ 62.5 μL 0.5%层膜素(层膜素溶解于50 mM, pH为5.0的醋酸缓冲液中)，在40℃孵育20、40、80和100 min后停止反应。为了在每个时间点停止反应，在每个溶液中加入125 μL二硝基水杨酸(Sigma, D0550-100G，由300 mL 4.5% NaOH与880 mL含有8.8 g 3,5-二硝基水杨酸和255 g双酒石酸钠钾的溶液混合而成)。溶液在100°C的水浴中孵育5分钟，并用分光光度法(Microplate reader Bio-Rad 550)在490 nm处测定吸光度。 Absorbance readings for each time point of the enzymatic kinetic study were transformed to g/L of glucose using the regression equation Y=0.322x + 0.009 (R²= 0.994)。将酶动力学研究中每个不同时间点的葡萄糖浓度汇总，生成表示每个酶动力学时间点总葡萄糖浓度mg/mL/min的方程，将其转化为单位，再转化为微摩尔/min*L = U/L。

总蛋白测定

Bradford, 1976程序被用于确定每个样品的总蛋白质含量。取每个样品25 μL与200 μL Bradford试剂(1X)混合，室温孵育5min。以牛血清白蛋白为基准，在595 nm处测定吸光度，用回归方程Y= 0.0049x + 0.0057 (R2=0.991)将其转化为μg/L。

β1,3-Glucanase净化

β-1,3-葡聚糖酶的纯化。酶纯化采用超滤(Amicon Filter膜10 kDa, Sigma Z706345-8EA, USA)浓缩样品，4000 × g离心15 min, DEAE阴离子交换层析。超滤酶提取物应用于DEAE Sepharose Fast Flow (Sigma)色谱柱，该色谱柱与5个柱体积平衡，230 mL, 20 mM Tris HCl, pH 8.0。在20 mM Tris HCl缓冲液中，pH为8.0,NaCl梯度为0.2、0.3、0.4 M，流速为500 μL/min。收集3 mL馏分，测定总蛋白含量和β-1,3-葡聚糖酶比活性。在变性和还原条件下，用SDSPAGE测定酶的纯度。使用10%聚丙烯酰胺和4%双丙烯酰胺溶液的混合物制备聚丙烯酰胺凝胶。室温下，100毫伏(mV)电泳1.5 h。迁移样品用AgNO染色_3.解决方案。在室温下，在20 mA的不连续系统下，用2 mg/mL的层膜素在分离凝胶中进行原生PAGE程序。电泳后，凝胶在200 mL 50 mM醋酸钠缓冲液中，pH为5.0，在40°C下孵育1小时。凝胶浸泡在0.005%苯胺蓝150 mM磷酸钾中，pH 8.6, 15分钟。紫外光照下观察波段(紫外反式照明器高性能柯达EDAS 290，美国)。

β-1,3-葡聚糖酶的表征

确定了最佳pH值、温度和热稳定性。使用50 mM的醋酸钠缓冲液来确定酶的最佳pH值。测试的pH值范围为5到8。将62.5 μL纯化β-1,3-葡聚糖酶溶液和62.5 μL 0.5%海带素的混合物在40℃下孵育90 min，测试不同的pH值。最大酶活性被认为是100%相对活性。几种温度对β-1,3-葡聚糖酶进行了测定。使用50 mM的醋酸钠缓冲液来确定这些试验中所确定的最佳温度和最佳pH值。62.5 μL纯化β-1,3-葡聚糖酶溶液和62.5 μL 0.5%海带素的混合物在0、4、10、20、30、40和50℃下孵育1.5 h。观察到的最大酶活性被认为是100%相对活性。为了确定酶的热稳定性，将62.5 μL纯化的β-1,3-葡聚糖酶在50 mM醋酸钠缓冲液中孵育，在30、40、50、60、70、80和90℃下，以先前试验中得到的酶的最佳pH值孵育60 min。 After this step, 62.5 μL 0.5% of laminarin was added to the previously incubated solutions before initiating a new incubation period at the optimal temperature. The maximum enzymatic activity was considered 100% relative activity.

β-1,3-葡聚糖酶对p . expansum分生孢子萌发和菌丝生长

不同量的纯化β-1,3-葡聚糖酶，1.9,3.75和7.5 U/mg，与300p . expansum分生孢子在酶联免疫吸附测定(酶联免疫分析)板中，27°C孵育48小时。此外，阴性对照包括β-1,3-葡聚糖酶，在100°C加热5分钟后失活，阳性对照也包括a . niger (Sigma 49101, USA) β-1,3-葡聚糖酶。孵化之后p . expansum分生孢子萌发率通过计数已发芽的分生孢子萌发率进行评价。分生孢子萌发的最大值被认为是100%的相对活性。与此同时，p . expansum在PDA中27°C生长7天。然后，取出0.5 mm2含有菌丝的琼脂，再次接种于PDA中，分别接种1.9、3.75和7.5 U/mg纯化的β-1,3-葡聚糖酶，在27℃下孵育120 h。此外，阴性对照包括β-1,3-葡聚糖酶在100°C加热5分钟后失活，阳性对照也包括a . niger β-1,3-葡聚糖酶。孵化之后p . expansum对菌丝生长进行评价。最大的菌丝生长被认为是100%的相对活性。

统计分析

每个实验重复三次。当结果以百分比形式获得时，将其转换为ArcSen并进行ANOVA分析。统计设计完全随机，分为3个重复。均数比较采用Tukey检验(α=0.05)。SAS(统计分析系统，8.0,Cary, NC，美国)for Windows。

结果与讨论

的增长c . oleophilaL-06

的生长曲线c . oleophilaL-06载于(图1)光密度(OD值为1)相当于5 X 105 CFU/mL，在30°C下孵育100小时。当CFU/mL转化为Log10时，有一个线性响应，这表明酵母细胞的增长速度为指数级。结果还显示了长达27小时的指数相跨度。Bar-Shimon等人报告了类似的生长曲线c . oleophila．因此，(在NYB中)最大的生长发生在27小时，酵母的每个生命周期(一代)持续2.6小时。Madigan等人认为，在生长的最高点，酵母细胞的酶机制是完整的，因此能够产生更多的酶。基于这些结果c . oleophilaL-06孵育27 h [16］．然后通过离心从NYB培养基中分离酵母细胞，然后转移到MSM中，以便进行以下实验。

β-1,3-葡聚糖酶在不同底物中的产生

β-1,3-葡聚糖酶的比活性在培养48 h时最高，蛋白浓度为1.7 U/mg (图2一个)．这些结果证实了最高水平的酶活性c . oleophila正如Madigan等人所指出的那样，L-06发生在生长最快的时期。[16］．在此之后，酶活性急剧下降。在整个潜伏期内，酶比活性降低了0.04 U/mg。当葡萄糖、层膜素、酶活性变化时(P<0.01)p . expansum细胞壁被单独用作唯一的碳源。（图2一个)显示酶活(U/L)与时间(h)的关系，其中碳源对酶活的影响也极显著(P<0.01)。葡萄糖作用48 h后酶活性最高，为249 U/L (Tukey p<0.05)，层膜素次之，为233 U/L。酶活性在这段时间后下降，但一些酶活性直到孵育结束仍保持。72 h时酶活最低，为173.9 U/Lp . expansum细胞壁。微生物对碳源的反应是可变的(Martin等)。一些微生物，如哈兹木霉和asperellum木霉，在含有真菌细胞壁的培养基中产生高水平的β-1,3-葡聚糖酶Bara等。[17］．其他的，如神经孢子菌和绿色木霉，在含有葡萄糖的培养基中生长时，产生低活性或没有活性。在这项研究中，c . oleophilaL-06在葡萄糖作用下产生的β-1,3-葡聚糖酶水平高于PeCW，这与在培养基中添加葡萄糖时的酿酒酵母相似。葡萄糖和海藻素的实验结果表明c . oleophilaBar-Shimon等人认为L-06需要葡萄糖才能产生高水平的β-1,3-葡聚糖酶活性，但在潜伏期的一定时间内，高葡萄糖水平通过反馈抑制作用抑制β-1,3-葡聚糖酶活性Wisniewski等人[15，18，19］．（图2 b)表示干重与时间的关系，酶比活性与时间的关系。

β1,3-Glucanase净化

非凝胶附着洗脱样品在水解海藻素生成葡萄糖为唯一产物时出现β-1,3-葡聚糖酶比活性峰。凝胶洗脱样品有两个比活性峰，分别为分数49对应的b (a)峰和分数62对应的c (b)峰。图3)．最高的比酶活性对应于峰值c的部分，超滤后获得更大的酶浓度，以便后期表征和用作生物防治剂p . expansum．峰b具有与葡萄糖苷酶类似的比活性，可能是由于β-1,3-葡聚糖酶的存在，其比活性较低Peng等，[20.］．在色谱过程结束时，使用0.4 M NaCl溶液洗脱其他蛋白质。这些蛋白不表现出β-1,3-葡聚糖酶的特异性活性。据报道，哈氏锥菌中β-1,3-葡聚糖酶的同工酶多达10种，其中7种被2%葡萄糖抑制[20.］．3种桃顶孢菌外源β-1,3-葡聚糖酶由不同的基因表达，其中GNI和GNII氨基酸序列相同;与第三种β-1,3-葡聚糖酶(GNIII)相比，这些酶表现出差异。对这些酶的进一步分析表明，它们也可能具有不同的功能。β-1,3-葡聚糖酶从c . oleophila与总蛋白相比，L-06的纯化量为74倍，比酶活性为15.5 U/mg，表明蛋白纯化量约为74倍。与粗提物相比，酶回收率大于20% (表1)．因为酶是在小的馏分中回收的，所以有必要将提取物再提纯十次。

表1。L-06嗜油C.分离物β-1,3-葡聚糖酶的纯化工艺。

由于β-1,3-葡聚糖酶的最高比活性(DEAE Sepharose)，用62馏分测定纯化的β-1,3-葡聚糖酶的分子量和纯度。（图4一)显示一条相对质量为48.3 kDa的蛋白带，对应于β-1,3-葡聚糖酶c . oleophilaL-06。Peng等人在酵母中报道了类似的β-1,3-葡聚糖酶(47.5 kDa)。（图4 b)对超滤粗提物(井1)和DEAE Sepharose的β-1,3-葡聚糖酶(井3)进行天然PAGE电泳分析，显示β-1,3-葡聚糖酶活性。在凝胶电泳中使用海带素(2 mg/mL)作为底物，可以识别对应于β-1,3-葡聚糖酶活性的溶出区，在这里用深色带表示。粗提物DEAE Sepharose只有一条电泳带，在两种电泳、变性/还原和天然条件下，均表明β-1,3-葡聚糖酶从黄芪中分离得到c . oleophilaL-06为单体，分子量为48.3 kDa。这些结果与Bar-Shimon等人的报道一致。[15］．

描述的c . oleophila3-Glucanase L-06外β1日

pH值:酶活性在所有pH值下均存在，pH值3.0除外(图5 b)．的lack of activity at this low pH could be due to degradation or to modification of the active site due to the low pH [21］．最佳pH值为5.0，酶的相对活性为13.2 U/mg(100%相对活性)，在pH 4.0 ~ 6.0范围内，酶的相对活性高于80%。在pH 7.0和8.0时，相对活性损失超过50%。β-1,3-葡聚糖酶产酶的pH值之间存在显著差异(α=0.05)。本工作获得的结果与来自不同微生物的大多数β-1,3-葡聚糖酶的结果相似[22，23］．

温度:除了0°C (图5一个)．酶的最佳温度为40℃，比活性为11.2 U/mg。在50°C时，比活度为90%。各组间差异有统计学意义(α=0.05)。低温，如4°C，比活度降低到40%;在0°C时，没有特异活性。

热稳定性:在30 ~ 60°C的温度范围内60分钟，用来评估相对酶活性。30℃时热稳定性更好，比活度为8.9 U/mg (图5 b和5度)．比活度高达60°C，损失大于70%。各处理间酶活性差异显著(α=0.05)。在这项工作中分离出的酶可以被认为是一种中等热稳定性的酶，因为它在50到60°C之间表现出特定的活性。这种酶在4°C或更低温度下的低活性或无活性可能是一种不利因素，因为苹果果实是在0°C低温储存的。的c . oleophila据报道，L-06分离物能够在低温下生长[13］．L-06在对抗植物致病真菌时，也可能在0℃和5℃的冷藏温度下对几种温带水果表现出β-1,3-葡聚糖酶活性[24］．

由于β-1,3-葡聚糖酶在高温(如60°C)下具有特异活性，该酶可被认为是一种有效的工业生物催化剂。此外，它具有较高的抗变性剂，如助溶剂，乱向剂和洗涤剂，寿命长。这些特征可能允许c . oleophilaL-06的商业化生产。本工作分离纯化的酶具有与Peng等报道的在Williopsis saturnus上工作时相似的特性，其最佳pH值为4.0，最佳温度为40℃，热稳定性为70℃。

β-1,3-葡聚糖酶对p . expansum分生孢子萌发和菌丝生长:p . expansum纯化酶的剂量分别为1.9、3.75和7.5 U/mg。分生孢子萌发与阳性对照相似，黑曲霉β-1,3-葡聚糖酶(图6)．治疗剂量之间存在显著(α=0.05)差异，包括两者c . oleophila黑曲霉β-1,3-葡聚糖酶。较高剂量的酶对分生孢子萌发有较大的抑制作用。黑曲霉酶对分生孢子萌发的抑制率为55.4%c . oleophila(50%)酶，这些处理与其他处理之间差异显著(α=0.05)。

百分比p . expansum菌丝生长(图6 b)在不同β-1,3-葡聚糖酶处理后显示。两种治疗剂量间均有显著差异(α=0.05)c . oleophila黑曲霉β-1,3-葡聚糖酶。剂量越大，抑制作用越强p . expansum菌丝的生长。黑曲霉对菌丝的控制能力较强c . oleophila．的c . oleophila与其他处理相比，最低剂量的酶产生显著(α=0.05)差异。c . oleophilaβ1,3-glucanase破坏p . expansum细胞壁葡聚糖[25，26］．p . expansum分生孢子萌发和菌丝生长受到抑制c . oleophilaL-06分离的β-1,3-葡聚糖酶可能表明其产生的水解酶是一种作用方式c . oleophilaL-06隔离。Guerrero-Prieto等人报道c . oleophilaL-06、L-07光滑、L-07皱褶表现出生物防治作用p . expansum采后的苹果果实中含有B. cinerea。在这项工作中报告的结果可能表明，它是更可取的使用酵母本身，而不是酶单独，因为c . oleophila可能包括几种作用模式，如产生溶酶，争夺营养物质和空间，以及诱导抗性p . expansum［5］．

结论

c . oleophilaL-06生成的β-1,3-葡聚糖酶分子质量为48.3 kDa，最佳pH值为5.0，最佳温度为40°C，热稳定性区间为20 - 40°C，酶活性可达60°C。β1,3-Glucanase抑制p . expansum使用7.5 U/mg的纯化酶时，分生孢子萌发率提高50%，菌丝生长率提高70%。结果表明，β-1,3-葡聚糖酶的生成由c . oleophila其中一种行动方式是反对吗p . expansum．

参考文献

1. Dewi R，等。枯草芽孢杆菌SAHA 32.6生产ß-葡聚糖酶的培养基优化用于油棕病原菌的生物防治。阿联酋食品与农业杂志，2016;28:116-125。
2. Rahul N，等。水果和蔬菜真菌病害采后管理面临的挑战——综述。环境科学学报。2015;1:126-130。
3. 就AA。通过减少新鲜农产品的采后损失来增加粮食供应。采后Symp Eds。门卡雷利，杜鲁提。植物学报。682,ISHS。2005; 2169 - 2176。
4. Ippolito A，等。小黄霉对苹果果实采后腐烂的控制及防御反应的诱导。采收后生物学与技术，2000;19:265-272。
5. Guerrero-Prieto V等人。拮抗嗜油念珠菌组合对苹果果实上扩张青霉的完全控制。智利农业研究，2014;74:427-431。
6. Guigón-López C，等。以双孢蘑菇和杂食植毛菌为底物诱导木霉和长臂僵菌脱细胞外蛋白酶活性的研究。中国生物医学工程学报。2014;
7. 陈毅，等。销售能提高β-1,3-葡聚糖酶活性，降低土壤真菌生物量。科学通报。2015;10:e0134799。
8. Droby S，等。20年的收获后生物防治研究:是时候建立一个新的范式了吗?植物科学进展。2009;52:137-145。
9. Mari M，等。水果采后病害防治:老问题与创新方法。斯图尔特收获后评论2014:1-1。
10. Culleton H，等。同源α- l -阿拉伯呋喃糖苷酶和endo-1,4-β- d -葡聚糖酶在曲霉腺病中的表达、纯化和鉴定。J IndMicrobiolBiotechnol。2014; 41:1697 - 1708。
11. Guigón-López C，等。棉花根腐病病原菌杂食植毛菌寄生期间木霉酶表达的变化。中国生物医学工程学报，2015;
12. 蒙泰罗VN和ulhoa CJ。马氏木霉细胞壁诱导β -1,3-葡聚糖酶的生化特性。2006; 52:92 - 96。
13. Guerrero-Prieto V等人。Identificación曼扎纳草属植物(l)轧机。家事变体(Borkh)Mansf。Para control biológicoposcosecha。《墨西哥昆虫病理学杂志》2004;22:223-230。
14. Guerrero-PrietoV等。营养物胜任力;嗜油念珠菌、控制、反扩青霉和灰霉病(Pers.)。墨西哥昆虫病理学杂志，2011;29-2:1-10。
15. Bar-Shimon M，等。酵母生物防治剂嗜油念珠菌产生的胞外裂解酶的鉴定。《当代遗传学》2004;45:140-148。
16. Madigan M，等。Brock, biología de los microorganmos。(10 thedn)。Pearson Prentice-Hall，马德里，2004;1096页。
17. Bara MT，等。木霉产外β -1,3-葡聚糖酶的纯化及特性研究。微生物学杂志，2003,19:81-85。
18. 一种利用蛋白质-染料结合原理快速而灵敏地定量微量蛋白质的方法。《肛肠生物化学》1976;72:248-254。
19. Wisniewski M，等。酵母毕赤酵母(Pichiaguilliermondii)作为生物防治剂的使用:对灰葡萄孢附着特性的研究。美国农业部农业研究处(美国)1991.
20. 彭毅，等。海洋酵母Williopsissaturnus WC91-2外源β -1,3-葡聚糖酶的纯化及分子特性。: MicrobiolBiotechnol。2009; 85: 85 - 94。
21. Vazquez-Garciduenas S等人。生物防治剂木霉ß- 1,3 -葡聚糖溶解体系分析。环境微生物学与应用，1998;
22. Keeratijarut A，等。来自致病性OomycetePythiuminsidiosum的免疫活性exo -1,3-β-葡聚糖酶是温度调节的，并表现出糖苷水解酶活性。科学通报。2015;10:e0135239。
23. 王旭，等。海洋酵母Pichiaanomala YF07b对螃蟹致病性酵母菌杀伤毒素的纯化与鉴定。微生物学杂志。2007;55:396-401。
24. 田sp，等。微生物生物防治剂劳伦隐球菌诱导红枣果实β -1,3-葡聚糖酶基因的鉴定与表达。2007; 97:260 - 268。
25. Oelofse D，等。来自酵母的Exo-ß-1,3葡聚糖酶抑制炭疽菌和灰葡萄孢孢子萌发。植物病理学杂志。2009;37(1):1-6。
26. O 'Connell E，等人。埃默氏Talaromyces emersonii胞外葡聚糖酶外-1,3- β -葡聚糖酶的纯化。应用微生物学与生物技术。2011;39(5):689 -696。