纯化和表征Ž²的牛乳糖从Kluveromyces lactis隔绝酸奶垃圾网站

文摘

的一些性质β-galactosidase提取和纯化克鲁维酵母菌属lactis隔绝酸奶浪费网站进行调查。原油β-galactosidase隔绝克鲁维酵母菌属lactis由硫酸铵沉淀纯化,DEAE-Sephadex离子交换色谱法。部分纯化酶的特定活动107.50μmole /分钟/毫克的蛋白质和7%的收益率。酶的分子量是199 kDa由凝胶过滤Bio-gel p - 200。Michealis-Menten常数(公里)和最大速度(Vmax)获得的价值是3.56±0.62毫米和0.61±0.08μmole /分钟/毫升的酶与ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (oNPG)底物而公里和Vmax 18.01±0.23毫米和0.15±0.04更易与乳糖衬底/ 20分钟/ L。纯化酶的最佳pH值7.5和6.5分别与oNPG和乳糖衬底。最佳温度是40°C与基质。这β-galactosidase可以应用于乳清乳制品行业的副产品转化为有用的产品。

关键字

β-galactosidase;乳糖;克鲁维酵母菌属lactis, Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (oNPG);酸奶浪费

介绍

乳清是生成的水一部分牛奶乳制品行业的副产品。乳制品行业的污染最大的贡献者是奶酪、酸奶和冰淇淋工厂。乳脂乳清包含大约0.4 -0.5%,0.6 - -0.8%可溶性蛋白质,乳糖4.5 -5%,矿物质,微量的维生素和其他有机物(1]。大多数乳制品植物分离乳脂作为原料进行进一步处理。剩下的乳清制成各种产品,如浓缩或乳清粉、乳糖、乳清蛋白浓缩通过使用一个数组的过程或处理。处理剩余乳清在环境中是有问题的,因为它高有机质含量高生化需氧量(BOD)和高的化学需氧量(COD) (2]。连续的土地处置乳清可以危害土壤的物理和化学结构,降低作物产量,导致严重的水体污染3]。为了克服这些并发症,近期的研究尝试尝试解决这个问题通过专注于技术的发展,采用乳清为原料来生产有用的产品。这些技术是之一水解乳清β-galactosidase生产低乳糖的或non-lactose牛奶乳糖不耐症的人,集中和冷冻奶制品。β-galactosidase也被用于分级乳清为原料的食品和饲料和生产糖替代品的渗透4]。水解乳清及其导数的扩展使用发酵中、生产饲料酵母的生物乙醇和其他商业上重要的微生物代谢产物。

β-galactosidase(β-D-galactoside galactohydrolase EC 3.3.1.23)可以从各种各样的来源获得如微生物、植物和动物组织(5,6]。酶微生物来源的技术感兴趣。微生物酶已报告提供各种优势其他来源,如容易处理,更高的增殖速率和生产产量和不包含潜在的有害物质。由于β-galactosidase商业兴趣,大量的微生物调查了他们的生产7]。在这些真菌是工业生产的首选候选人的酶(8)和酵母被认为是主要的食品微生物源应用程序,因为他们是安全的(肝)。本研究旨在分离、净化和描述β-galactosidase从酵母菌株(孤立的从酸奶垃圾站点)水解乳糖可能的生物技术应用的能力。

材料和方法

粗酶的制备

克鲁维酵母菌属lactis先前孤立从酸奶浪费样品并报水解乳糖(9)是100毫升的酵母乳糖蛋白胨培养基中培养(YPLB) 25°C 24小时旋转瓶。约30毫升YPLB文化被用来接种3 L刚做好的YPLB和孵化25°C在100 rpm旋转瓶24 h。酵母细胞收获离心分离在6000 rpm 15分钟在4°C。大约40毫升无菌YPLB肉汤的重组酵母细胞悬浮细胞溶解和200毫升的冷Z缓冲(0.10钠磷酸盐缓冲剂,10毫米氯化钾,MgSO 1毫米₄和50 mM 2-mercaptoethanol, pH值7.0包含20μl 0.1% SDS和40μl氯仿)使用细砂在研钵和研杵和迫击炮。混合物在6000 rpm离心机在4摄氏度为15分钟得到粗酶(上层清液)。

β-galactosidase化验和蛋白质浓度测定

β-galactosidase活动被测量的水解化验显色衬底,o-nitrophenyl-β-Dgalactopyranoside (oNPG)使用米勒(1972)的方法(10]。β-galactosidase活动由孵化1毫升的Z缓冲0.2毫升的4毫克每毫升oNPG(0.01钠磷酸盐缓冲剂,pH值7.2)和5λ的酶量10分钟。在室温下反应被终止的0.4毫升1.0 Na₂有限公司₃反应混合物。光密度是阅读在420 nm分光光度计。一个单位的酶活性被定义为所需的酶解放1.0μmol 1分钟。蛋白质硝基酚的浓度是由布拉德福德(1976)的方法(11使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准。

酶的纯化

粗酶(200毫升)被带到65%硫酸铵沉淀饱和度。收集的离心沉淀,透析对几个变化50%甘油磷酸钠0.1米缓冲区,pH值7.0,进一步纯化DEAE-Sephadex离子交换柱。洗脱与0.1钠磷酸盐缓冲剂,pH值7.0的流量60毫升/ h与线性梯度和蛋白质筛选了0 - 0.5 M氯化钠。

聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳在缺乏执行SDS为酶制剂的同质性测试。这是执行根据淀粉微球的手册中描述的方法(聚丙烯酰胺凝胶电泳、实验室技术,修订版,1983年2月)7.5%杆凝胶。电泳在0.1磷酸钠进行缓冲,pH值7.0。

表观分子量的测定

纯化的表观分子量β-galactosidase估计凝胶过滤在一列(2.5 * 80.0厘米)的Biogel p - 200。列是校准与牛血清白蛋白(MW 66000 da;5毫克/毫升),卵清蛋白(45000 MW哒,5毫克/毫升),γ-globulin (MW 150000 da;5毫克/毫升),丙酮酸激酶(MW 230000 da;5毫克/毫升)和肌酸磷酸激酶(MW 88000 da;5毫克/毫升)[12,13]。

β-galactosidase测定动力学参数

的动力学参数[Michealis-Menten(公里)和最大速度(Vmax)]酶测定的0.1钠磷酸盐缓冲剂,pH值7.0包含10毫米MgSO氯化钾和1毫米₄,用不同浓度的oNPG从1毫米到10毫米。孵化在37°C反应是前10分钟和0.4毫升0.1 Na停止吗₂有限公司₃。以乳糖为底物,酶的动力学参数测定在修改缓冲区B(磷酸钾缓冲,pH值7,包含20毫米MgCl氯化钠和2毫米₂描述通过与不同浓度的乳糖金等人从20毫米到100毫米。测定了0.1毫升酶在37°C和孵化20分钟后测定混合物的反应是停在沸腾5分钟β-galactosidase活动的定量分析测定葡萄糖释放由添加2毫升的葡萄糖从葡萄糖氧化酶试剂工具包。吸光度测量500海里。一个单位的酶活性被定义为产生一μmol葡萄糖的酶量定义的条件下最小。

β-galactosidase活动pH值的影响

β-galactosidase的最佳pH值与oNPG衬底决定通过测量酶活性用缓冲区0.05但不同博士所使用的缓冲区是醋酸(pH值4 - 5.5),磷酸钠(pH值6.0 - 7.5),三羟甲基氨基甲烷(pH值8.0 - 9.0)和硼酸液(pH值9.5和10.0)。反应混合物中含有1毫升每个缓冲区,0.2毫升oNPG解决方案和0.05毫升的酶和孵化10分钟37°C。通过添加0.4毫升Na反应终止₂有限公司₃反应混合物和吸光度读在420海里分光光度计。以乳糖为底物,酶的最佳pH值是由孵化1毫升每个缓冲区,0.5毫升的20毫米乳糖和0.2毫升的酶为20分钟37°C。沸点测定混合物的反应是停止5分钟和2毫升的血糖试剂后被添加到它的吸光度是阅读在500海里。

温度对β-galactosidase活动的影响

β-galactosidase活动最适温度是决定oNPG和乳糖基板在各种温度下10°C到70°C。oNPG衬底,1毫升Z缓冲和0.2毫升的20毫米oNPG最初pre-incubated在水浴温度为10分钟,之后0.05毫升酶添加和孵化温度相同的另一个10分钟,以乳糖为衬底,1毫升缓冲B和0.5毫升200毫米乳糖是pre-incubated在不同温度下10分钟,之后0.2毫升酶增加,反应混合物孵化温度为20分钟。

结果与讨论

β-galactosidase获得克鲁维酵母菌属lactis隔绝酸奶垃圾网站纯化的收益率为7%,具体活动107.50μmole /分钟/毫克的蛋白质。在DEAE-Sepahdex洗脱图提出了图1。电泳在缺乏蛋白质SDS凝胶棒显示两个可见乐队离子交换后的一步。所有试图使用交联葡聚糖凝胶过滤各种树脂g - 200, Sephacryl 200和300两种蛋白质分离导致相当大的低收益率。酶的分子量大约为199 kDa提出(图2)这是可比的酵母,念珠菌球拟酵母属,214 kDa [14,15]。它也与酶的分子量240 kDa隔绝链霉菌属solfataricus [16]。的Km值3.56±0.62毫米和18.01±0.23毫米oNPG和乳糖酶底物的获得图3和图4也分别与1.7毫米和17.3毫米的Km值获得oNPG并从商业制备乳糖酶克鲁维酵母菌属lactis(17]。然而,乳糖的Km值低于36.31毫米的价值获得的酶芽孢杆菌polymyxa [18)和25毫米获得的价值克鲁维酵母菌属marxianus(19]。酶的最适pH值为7.5 (图5)和6.5 (图6)分别与oNPG和乳糖作为衬底。这些值具有可比性的酶芽孢杆菌stearothermophilus使最大活动pH值7.0 [20.]。酶的最适温度活动oNPG和乳糖基板40°C所示图7和图8分别。这几乎是类似于酶的最适温度得到重组大肠杆菌与k . lactis基因,37°C和40°C分别oNPG和乳糖作为底物时(14]。也相当于45°C的最佳温度获得相同的酶曲霉属真菌粳稻(21]。

它可以得出结论克鲁维酵母菌属lactis隔绝酸奶垃圾网站是一个潜在的候选人β-galactosidase的生产。酶的性质表明其可能使用乳制品废物转化为经济上有用的产品。

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