净化mCRP35-47肽相关抗体的亲和色谱法Antigen-Ligand列上

Qiu-yu李¹,Hai-yun李²吴Yi-ming³,冯⁴^,5*明辉赵⁴^,6

¹呼吸和重症监护医学、北京大学第三医院,北京,中华人民共和国

²重点实验室环境与疾病相关的基因,教育部,基本医疗科学学院,西安交通大学,西安、山西,中华人民共和国

³国家重点实验室的自然和仿生药物。化学生物学、制药科学学院,北京大学,北京,中华人民共和国

⁴肾,医学系的,北京大学第一医院,北京,中华人民共和国

⁵国际肾脏病学会、北京大学医院,北京102206,中国的公关

⁶Peking-Tsinghua生命科学中心,北京,中华人民共和国

*通讯作者:: 冯余
肾,医学系的,北京大学第一医院,肾脏学、北大国际医院,北京102206,中国公关。电子邮件:yufengevert1@sina.com

收到日期:27/09/2019;接受日期:07/10/2019;发表日期:11/10/2019

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文摘

净化mCRP35-47狼疮肾炎的自体抗体建立的基础上的进一步研究角色的mCRP35-47狼疮肾炎的临床过程。第一步是获得狼疮性肾炎患者的血清和净化亲和色谱的血清免疫球蛋白。第二步是激活与CNBr琼脂糖。最重要的一步是准备该肽来自固定配体的耦合。35- - - - - -47to the gravity column and the total IgG is flow though the gravity column and can be eluted. mCRP35-47 peptide related antibody is harvested and its specificity has been verified by SPR. Human mCRP35-47 peptide related antibody with high purity from the plasma can be obtained by affinity chromatography and can be applied to further functional experiments.

关键字

mCRP35-47肽相关抗体、亲和色谱法纯化、抗体亲和配体,表面等离子体共振

介绍

血清c反应蛋白(CRP)是一种炎症的标志和一个假定的可溶性模式识别受体有助于有效地去除死细胞或入侵的病原体通过激活补体因子H (1,2]。因此,有趣的钝化c反应蛋白的反应在活跃的狼疮肾炎和anti-CRP的存在自身抗体在病人的一个子集3- - - - - -6]。我们以前的工作暗示同上形成反差的主导自身免疫抗原决定基c反应蛋白与狼疮肾炎肾损伤及预后有关。重要的是,这种抗原决定基mCRP构象所特有的,是主要的配体结合位点(7]。

调查patient-derived抗体会发挥越来越重要的作用,为临床研究和净化过程得到FPLC发展以来的最新研究进展。抗体可以很容易地从病人血清样本的蛋白质纯化与凝胶排阻净化/ G亲和纯化后。然而,抗体特异性抗原的纯化仍然是一个技术问题,因为他们的低丰度和标准净化程序。最明显的目标来自人体的抗体能与传染性病原体相关抗原,如病毒和细菌。因此这些传染性病原体的抗体可以作为源抗感染治疗。此外,许多高价值目标的治疗的兴趣,比如与癌症和炎症性疾病有关,通常自体抗原。这些抗原抗体在这项研究中可以用来研究自身免疫性疾病。这里,我们开发了一种新方法亲和色谱法纯化抗体绑定目标抗原的固相抗原特异性的琼脂糖。

在这里,我们已经开发出一种新方法净化的特定抗体的亲和色谱法通过锚定目标抗原固相琼脂糖和将这种方法应用到临床自身免疫性疾病的抗体检测。

亲和色谱法技术基于特定亲和力的生物活性物质和特定的配体,以达到分离的目的。亲和色谱法是最有效的蛋白质分离和纯化的方法(8,9]。亲和色谱法的目的是根据目标蛋白质的特异性,如酶和底物、抗原和抗体。亲和色谱法具有高纯度、高产量,并能维持生物大分子的自然活动。因此,亲和色谱法具有良好的选择性和被广泛用于从复杂系统中提取特定目标蛋白质。Ahirwar [10)开发了一个快速和有效的一步亲和层析技术。这种色谱的固定相是琼脂糖带豆的抗体蛋白a靶蛋白的纯度一步获得的色谱法可以达到90%,收益率超过66%。质粒DNA被亲和色谱法纯化berenil作为配体。质粒DNA的产量和纯度分别为87%和99%,和手术时间和成本大大降低,因为他们的低盐和单步色谱法。亲和色谱法的分离效率与其他色谱技术相比具有明显的优势。只有一步的分离可以获得理想的效果,也就是说,实验过程简化和时间(11)保存。

这种固定化的方法生产配体和affinity-purification免疫球蛋白本质上是相似的,无论配体。琼脂糖4 b可能是最广泛使用的矩阵亲和色谱法,但其他材料是可用的。活化琼脂糖4 b通常是由反应与溴化氰(CNBr);这可以进行耦合,之前在实验室或ready-activated冻干琼脂糖可以购买。商业产品显然是比“自制”活化琼脂糖更方便,但它是更昂贵的,可能不太积极12]。

材料和方法

材料

•琼脂糖4 b。

•溴化氰。(警告:CNBr是有毒的,应该处理在一个通风橱)

•氢氧化钠:1米;10 M。

•乙醇胺缓冲:2 M乙醇胺。

•琼脂糖树脂洗缓冲:1毫米HCl pH值3.0。

•耦合缓冲:0.1 M NaHCO3/0.5M氯化钠pH值8.3。

•多肽耦合的解决方案:6毫米多肽溶于耦合缓冲区。

•屏蔽解决方案:0.1 Tris-HCl pH值8.0。

•清洗解决方案1:0.1醋酸缓冲/ 0.5 M氯化钠pH值4.0。

•清洗解决方案2:0.1 Tris-HCl / 0.5 M氯化钠pH值8.0。

•平衡解决方案:0.15 PBS。

•洗脱液的1/2/3:0.1 M醋酸缓冲/ 0.5 M氯化钠5/4/3 pH值。

解决方案准备

•解决方案(pH值7.0):K2HPO4: 3.4克;EDTA: 1.86克;蒸馏水:1000毫升;调整7和10 M氢氧化钠溶液pH值。

•解决方案B (pH值7.0):K2HPO4: 3.4克;EDTA: 1.86克;生理盐水:29.22克;蒸馏水:1000毫升;pH值调整到7 10 M氢氧化钠。解决方案

•0.01 PBS (pH值7.4):氯化钠:8.0克;Na2HPO4 * 12水:2.9克;氯化钾:0.2克;KH2警察丁:0.26克;蒸馏水:1000毫升;调整7和10 M氢氧化钠溶液pH值。

设备

•快速蛋白液相色谱仪(FPLC)、美国通用电气

•圆柱壳,美国通用电气

•HiPrepTM SephacrlTM S300 16/60,通用电气医疗、英国

美国通用电气•G蛋白亲和层析柱

•0.22μm过滤器,微孔S.A.公司,法国

方法

答:净化血清免疫球蛋白的亲和色谱法(13]:

•血清血浆置换的狼疮性肾炎3例的完整mCRP抗体,anti-mCRP35-47抗体,收集和反mcrp199 - 206抗体阳性和离心机在10000 rpm 20分钟在4°C,和上层清液。

•AKTA-FPLC调试,所有缓冲区必须由超声波除气和过滤0.22μm过滤膜。解决方案A和B是用来冲洗泵的压力。解决方案是用来平衡蛋白质G亲和柱(5毫升)。

•解决方案10毫升样本和流量被设定为1毫升/分钟。5列的解决方案是用来洗提的材料。绑定免疫球蛋白和5列筛选了大量的解决方案B,和收集的筛选了蛋白质峰和2 M三/盐酸中和(pH值9.0),以确保管中的液pH值7.4。洗脱后,G蛋白亲和柱平衡与5列卷的解决方案,20%乙醇,储存在4°C。

•提取的免疫球蛋白是透析对PBS + 0.01米和0.5米生理盐水缓冲一夜之间在4°C。透析后,上层的拍摄和OD280用紫外分光光度计测量。蛋白质含量是A280 nm / 1.43(毫克/毫升)。

b .以下步骤是基于上述提取免疫球蛋白在4°C:总

赖氨酸琼脂糖4 b提供冻干的添加剂。这些添加剂必须冲走在中性pH值。

责任与CNBr活化琼脂糖的

•洗10毫升(解决体积)的琼脂糖4 b 1 L真空过滤的水。Resuspend 18毫升的水(不允许琼脂糖变干)。

•加入2毫升0.5碳酸钠缓冲区,pH值10.5,慢慢搅拌。在一个通风柜和玻璃pH电极溶液中浸泡。

•重量1.5克CNBr小心翼翼的放在一个密封的容器(注:体重在一个通风橱;戴手套)记得净化设备,联系CNBr一夜之间在1 M氢氧化钠。雷竞技网页版

•添加CNBr搅拌琼脂糖。由一滴一滴地保持pH值在10.5和11.0之间添加4 M氢氧化钠直到pH值稳定,所有CNBr溶解。如果pH值高于11.5,激活将会效率低下,琼脂糖应该丢弃。

•滤浆使用烧结玻璃或布氏漏斗,洗2 L的琼脂糖冷0.1柠檬酸钠缓冲,pH值6.5 -不允许琼脂糖变干。小心地丢弃滤液(注:这包含CNBr)。

B.2制备固定化的配体

•1克CNBr-activated琼脂糖4 b weighd和稀释15毫升盐酸1毫米50毫升离心管和后涌入列列完全膨胀。列体积大约是3毫升,然后用盐酸1毫米15 - 20分钟洗净。

•5毫升的耦合缓冲区添加,resuspend 15毫升离心管和转让。15毫克肽在800年解散μl DMSO和添加到再悬浮。PH值调整到8.0。9毫升的暂停是在室温下孵化1 h。

•暂停转移到一个空的列和渗透是收集。剩下的液体与耦合缓冲洗5次(每次10毫升,和下一个开始每次洗液体是空的)。然后添加10毫升屏蔽解决方案和孵化在室温下2 h。

•悬挂被转移到一个空的列和渗透(10毫升的屏蔽解决方案)被丢弃,清洗三次交替清洗解决方案1和2 + 10毫升每一次(10毫升)。

•把琼脂糖到合适的色谱柱用50毫升的PBS。商店在4°C PBS含有叠氮化钠0.1%。

B.3。示例应用程序和洗脱

•血浆置换液添加和孵化室温1小时或4小时。

•悬挂被转移到一个空的列和渗透收集。列是用大量PBS (50 ml),直到没有发现蛋白质测定染色。

•用1/2/3洗脱液(pH值从高到低),2毫升每一次,代表每次2分钟。洗脱后,13毫升的PBS迅速增加了洗出液。15毫升中和洗出液。超滤- 200μl(10分钟)4000克使用50毫升50/30 kDa超滤管和被执行。

•监控A280和收集蛋白质包含1 M Tris-HCl峰值成管状,pH值8.8中和酸性分离缓冲。

•洗柱与PBS,直到洗出液pH值7.4。列存储在PBS含有叠氮化0.1%。透析多肽的特异性抗体合适的缓冲(例如,PBS)消除甘氨酸/三。

B.4。验证的功能肽相关抗体亲和色谱法

B.4.1。SPR证实mCRP35-47抗体亲和层析纯化的抗体相关的肽

我们纯化总免疫球蛋白与狼疮性肾炎患者的血清蛋白G列和孤立的抗原决定基特定mCRP35-47抗体由重力列。我们需要做进一步的实验之前验证抗体的特异性抗体。

实验1:提取mCRP35-47抗体是涂有CM5芯片作为固定相。mCRP35-47作为流动相做实验的结合。

实验2:mCRP35-47抗体被亲和色谱法提取,但流动相肽mCRP 174 - 185。

实验3:提取mCRP35-47抗体亲和色谱法,CFH流动相。

B.4.2。抗体纯化的影响通过亲和色谱法结合的CFH mCRP被ELISA检测。mCRP及其抗体的肽段和mCRP孵化CFH熔覆板,和鼠标反mCRP单克隆抗体3 h12作为第一抗体,合标记抗小鼠免疫球蛋白作为第二抗体,与OD值检测。的影响不同mCRP及其肽抗体CFH和mCRP相比。

B.5。存储

肿胀的介质应储存在4 - 8°C的细菌,例如20%的乙醇。中不能被冻结。

为了防止蛋白(抗体)降解在整个色谱过程中,我们采取措施如下:

•温度:温度是影响蛋白质稳定性的最重要因素。温度越高,低蛋白质的稳定性。蛋白质的纯化过程是在4°。

•缓冲区组成:许多分子稳定影响蛋白质的结构。他们可以用来保护不稳定蛋白在纯化过程中,适当的溶剂,和适当的缓冲也有助于稳定蛋白质的离子强度。

•摇晃和剪切:蛋白质可能denaturate摇晃下,剪切,因此严重的搅拌和净化蛋白质时应避免震动。

结果

蛋白质纯化

原油产品获得病人的混合等离子体是透明和澄清。原油的PH值调整和样例透析后被释放。洗脱液峰值从平衡解决废水(筛选了图1)。

图1:蛋白质的原理图G蛋白峰列。

功能肽抗体有关

后续实验证明肽相关抗体的特异性表面等离子体共振(SPR) (图2)。

图2:(一)KD = 1.544哦。它表明有一个一位的组合。35- - - - - -47and peptide related antibody, (b)The stationary phase was mCRP35-47 peptide related antibody extracted from affinity chromatography, while the mobile phase was peptide mCRP 174-185. The response value indicates that the two substances had no binding, (c)It showed that the stationary phase was mCRP35-47 peptide related antibody extracted by affinity chromatography, the mobile phase was CFH, and the response value indicates that the two substances had no binding. The above indicated that the mCRP35-47 peptide related antibody extracted from lupus nephritis patients had high relative specificity.

作者发现mCRP35-47肽相关抗体时不能结合肽mCRP 174 - 185的绑定能力本身是强大和KD是1.544哦。

此外,mCRP35-47肽相关抗体能够抑制补体因子H和mCRP和它是剂量依赖性的方式(图3和图4)。

图3:固定相是CFH 26.5 nM反mCRP35-47肽相关抗体的存在(图3)或不存在(图3 b),当流动相通过6.25 nM(蓝色),12.5 nM(粉红色),25日(绿色)或50 nM mCRP(紫色),mCRP35-47肽相关抗体的结合可以显著抑制mCRP CFH,导致响应值下降。

图4:不同浓度的mCRP35-47肽相关抗体,抑制程度的mCRP CFH绑定与巧克力摄入量有关,也就是说,mCRP35-47肽相关抗体的浓度越高,贫穷绑定能力。

讨论和结论

亲和力填料是一种多肽配体与琼脂糖和聚醚通过化学键。这些配体很容易被微生物降解,在耐碱性差,需要高浓度的盐酸胍和更高的价格。清洁成本较高,在净化过程中,酸缓冲和高浓度变性剂。在严重的情况下,配体很容易脱落等等。因此,生产相关的肽抗体亲和力填充物的消费很大,这阻碍了抗体的生产规模,成为一个重要因素,增加抗体的生产成本。

此外,蛋白质分子的结构很复杂,容易被灭活,和粗蛋白含有多种蛋白质杂质。常常需要结合各种分离技术分离和纯化目标蛋白,这必然会使蛋白质分子的分离和净化的过程,它不同于生理条件下,化学和机械因素。它会导致不可逆的蛋白质的空间结构的变化,从而失去其活动。例如,改变温度,PH值和离子强度在层析过程中,和表面活性剂添加在电泳过程中可能会导致蛋白质的空间结构变化。灭活研究蛋白质失去了它的意义,因此它是一个紧急的问题保持自然活动的蛋白质分离和净化的过程。

单克隆抗体的制备实验适用于基础研究和临床试验。作者用这种方法发现在狼疮肾炎患者肾损害更加严重mCRP35-47肽相关抗体阳性和肾脏的长期生存是更糟。此外,鉴于这一事实,没有统一的标准,目前耐药性的检测,临床检测的结果不具有良好的可比性,同时也影响促进临床研究。因此,ELISA检测装备mCRP单克隆纯化肽相关抗体可以考虑,可以探索和单克隆抗体的标准化提供了一个进一步的临床研究和诊断的依据。

ACKNOWLEGEMENTS

这个项目得到了Medjaden学院和青年科学家研究基金会(批准号MJR20180030),中国国家自然科学基金委创新研究群体(没有。81621092,no.81900641)。

符合道德标准

所有的作者宣称他们没有利益冲突。

人类和动物权利和知情同意

知情同意是获得从每个病人血液采样和肾活检。这项研究是合规的赫尔辛基宣言。设计这项工作由当地伦理委员会批准。

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