药学与药学研究与评论“雷竞技苹果下载，
菜单e-ISSN:2320-1215 p-ISSN: 2322-0112
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山东大学药学院国家糖工程研究中心，济南文华西路44号，邮编250012
收到了28/03/2016;接受07/05/2016;发表12/05/2016
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肝素钠是一种在凝血系统中起重要作用的糖胺聚糖(GAG)。肝素的质量是非常重要的，因此有必要在生产过程中建立一种快速的分析方法来分析所生产的肝素的质量。在本研究中，使用近红外光谱和化学计量学方法分析了从五个批次收集的80个样品在沉淀过程中的肝素含量。这样做是为了提高效率，直接和准确地理解过程，并减少在制造过程中产品质量的变化。首先，采用主成分分析(PCA)方法对各批次乙醇沉淀肝素的稳定性和特征轨迹进行定性研究。然后，采用偏最小二乘回归，结合多种光谱预处理方法和变量选择方法，定量预测乙醇沉淀过程中肝素含量。结果表明:决定系数(R2)、预测均方根误差(RMSEP)和剩余预测偏差(RPD)分别为0.974、1.105 g/l和6.37。这种方法在在线监测每个乙醇沉淀过程中的肝素含量方面具有相当大的潜力。此外，近红外技术的应用还将引起医药行业生产模式的巨大转变光谱学在未来。
近红外光谱，肝素，乙醇沉淀，主成分分析，偏最小二乘。
制药工艺通常由一系列单元操作组成，其中每一个操作通常对产品的质量属性有很大的影响。因此，监控关键质量属性(CQA)和关键工艺参数(CPP)是很重要的，它们反过来又会影响CQA [1］．传统的药品生产通常通过离线测试来评估质量。因此，通过实验室测试获得的质量参数通常滞后于生产。不利于及时调整工艺参数，甚至可能导致中间产品或最终产品返工或拒收，导致生产成本增加[2］．考虑到生产质量和成本，在生产过程中使用快速有效的过程分析技术(PAT)对解决上述问题至关重要。
PAT用于设计、分析和控制制造，通过及时测量(即在加工过程中)原材料和过程中的材料和工艺的关键质量和性能属性，以确保最终产品质量[3.］．PAT自美国食品及药物管理局(FDA)发起以来，已广泛应用于制药业[4]系统地了解影响工艺的不同变量，如原材料、设备、温度和ph值。实时和近实时影响配方的变量之间的相互作用为开发稳健的加工条件提供了范围[5］．近年来，对PAT的研究进展和兴趣已成为制药行业的一大趋势。近红外(Near-infrared, NIR)光谱是应用广泛的PAT工具之一，它使用的电磁波范围为800-2500 nm (12500-4000 cm-1)。近红外区主要由含有氢原子的官能团组成的带组成，如C-H、O-H和N-H [6］．由于其快速、无损和低成本的特性，近红外光谱已被证明是制药行业的有效分析工具[7］．此外，将有一个很大的转变，在制药行业的生产模式的应用近红外光谱。
肝素是一种糖胺聚糖(GAGs)，由α- d -葡萄糖胺和o -硫酸醛酸(α- l -硬糖醛酸或β- d -葡萄糖醛酸)的交替衍生物的聚合物组成[8］．它影响和调节新陈代谢和生理功能[9］．肝素的生产过程从原材料的评估到产品的储存。乙醇沉淀是肝素生产中的关键单元操作。从水溶液中提纯和浓缩肝素是一种广泛使用的技术。添加乙醇作为抗溶剂，因为乙醇简单、容量大，在盐的存在下能有效地从水相中析出肝素。CPPs有许多种，包括提取物的初始成分、乙醇浓度和沉淀温度，其波动可导致产品不稳定，也可引起批次与批次之间的变化[10］．传统上，监测肝素乙醇沉淀的方法主要基于经验或文献数据。对其内部演化的研究甚少，难以准确地控制其演化过程乙醇沉淀，导致产品质量的变化。这是GAGs生产中常见的问题。本工作讨论了近红外光谱技术在肝素乙醇沉淀过程定性和定量监测中的应用。对于近红外光谱工艺分析，定性方法一般涉及主成分分析(PCA) [11]，多元统计过程控制(MSPC) [12]，移动标准差块(MBSD) [13]和二维相关光谱[14]，而偏最小二乘(PLS)回归多用于定量分析。目前，乙醇沉淀过程的近红外光谱分析多用于中药(中药)的生产，如金针剂[15]，忍冬[16，17]、丹参注射液[10]和丹红注射液[18］．然而，近红外光谱法监测肝素乙醇沉淀的研究尚未见报道。
本研究的目的是评估近红外光谱是否具有提供乙醇中肝素沉淀的过程信息和监测的潜力。本文采用PCA和PLS回归方法对近红外光谱进行定性和定量分析。首先，采用主成分分析(PCA)对乙醇沉淀肝素各批次的特征轨迹进行识别。然后，采用PLS回归，结合多种光谱预处理方法和变量选择方法，预测肝素含量乙醇沉淀。
材料及化学品
肝素钠及其参考标准品分别由枣庄市赛诺康生化有限公司(中国枣庄)和国家药品生物制品检验检疫所(中国北京)提供。浓硫酸购自北京化工厂(中国北京)。无水乙醇来自天津福宇化工有限公司(中国天津)。所有使用的化学品均为分析级或更高纯度。去离子水是从Millipore millil - elix /RiOs超纯水系统(Bedford, MA, USA)中获得的。
方法
乙醇沉淀
用0.1 M盐酸将500毫升肝素钠水溶液(固液比7:100,w/v)调至pH 6.5。然后，将600毫升充分搅拌的无水乙醇以9毫升/分钟的流速连续泵入肝素钠水溶液。加入无水乙醇完成后，停止搅拌，让悬浮液静置。整个过程持续80分钟，然后将1 ml悬液收集在管子中。每5 min采集一次样品，每批采集16个样品。因此，5个批次产生了80个样品。所有采集的样品都进行离心，然后上层清液被储存起来作进一步研究。
参考方法
用紫外-可见光谱法测定上清液中的肝素含量，如本工作所述，进行了微小的修改。配制了含有已知浓度肝素钠的溶液，并用作参考标准。用水稀释上清液，使肝素浓度近似等于标准溶液中的浓度。然后，在试管中收集0.4 ml的样品溶液和5个含0 ~ 160 μg肝素的标准溶液(400 μg/ml)。接下来，小心地向每个试管中加入含有0.025 M四硼酸钠的3毫升硫酸(90% (v/v))。然后将混合物在90°C的水浴中加热10分钟，然后立即冷却到室温。使用Cary 100 Bio UV/Vis分光光度计(Varian Inc.， Walnut Creek, CA)在298 nm处测量吸光度。对照用同样的方法用水制备。
近红外光谱分析仪
用美国Thermo Fisher Scientific公司的Antaris ÃⅱÂ Â ×傅里叶变换近红外分光光度计、InGaAs检测器和result 3软件获取上清液的透射光谱。所有样品都装入6 × 50毫米的玻璃管(金布尔蔡斯，德国)，然后在10000到4000厘米的范围内扫描－1在实验室环境(室温，相对湿度30-50%)下采用传动方式。共添加扫描次数和分辨率分别为32和4 cm－1,分别。
数据处理
主成分分析(PCA)采用偏最小二乘(PLS)回归方法进行数据处理。所有计算均使用Matlab 2010a (Mathwork Inc.， USA)进行。采用主成分分析得到的分数散点图来识别所有批次的特征轨迹。通过PLS回归建立乙醇沉淀过程中肝素含量的定量分析模型。将4批样品随机分成一个校准集，剩余一批样品用于验证集。采用多种预处理和变量选择方法对透射光谱进行预处理，以得到更简单的模型和更好的预测。采用百叶帘交叉验证法确定潜在变量的最佳数量。决定系数(R2)、预测均方根误差(RMSEP)和预测结果交叉验证的均方根误差(RMSECV)对模型质量进行评价。此外，剩余预测偏差(RPD)被定义为验证集的标准偏差与验证的标准误差之比，用于进一步评估校准模型对成分数据的预测能力。
肝素含量测定
参考方法结果
测定肝素浓度的标准曲线为水平x轴，垂直y轴为吸光度曲线(y=0.0077 x-0.0398, r2=0.9999)。乙醇沉淀过程中肝素样品的含量分布，分为校准集和验证集，如图所示表1，而随时间收集的每个样本中的肝素浓度见图1．肝素含量在19.25 ~ 0.038 g/l之间(表1)．此外，所有批次的肝素含量随时间变化的轨迹相似(图1)．
图1:乙醇沉淀过程中肝素含量的时间变化规律。
| 样本集 | n一个 | 范围(g / l) | 意思是(g / l) | SDb(克/升) |
|---|---|---|---|---|
| 校准设置 | 64 | 19.25 - -0.038 | 6.08 | 7.12 |
| 验证设置 | 16 | 17.32 - -0.052 | 6.26 | 7.04 |
一个N =样本数，bSD =标准差。
表1:校准和验证集的信息表。
光谱的解释
乙醇沉淀上清液的原始近红外光谱如图所示图2一个．最高约6900厘米－1对应于HOH对称和不对称拉伸振动组合产生的强吸光度，峰值在5150 cm左右－1对应于来自HOH不对称拉伸和弯曲振动组合的强吸收[19］．然而，与不含乙醇的肝素溶液的光谱不同[20.]，在约6000-5400 cm处有明显的山峰－1在上清液的光谱中，可归因于乙醇的吸收。这些峰在加入乙醇后出现，且随着乙醇加入量的增加吸光度增加。因此，光谱进一步进行预处理，以线性化变量的响应，并去除对分析不感兴趣的无关的变化源[21］．如图2 b时，采用滤波宽度为15个数点的一阶Savitzky-Golay导数方法对谱进行预处理，提高了谱的灵敏度，并能区分原始谱中的重叠峰。这有利于从光谱中提取特定信息，并已用于后续的多变量分析。
图2:乙醇沉淀上清液的近红外光谱。(a)原始光谱。(b)滤波宽度为15个数点的一阶Savitzky-Golay导数对光谱进行预处理。
PCA定性分析
主成分分析是化学计量学中广泛使用的工具数据压缩以及信息提取。PCA可以找到描述数据主要趋势的变量组合。本文采用主成分分析方法对5个批次的预处理近红外光谱进行分析，通过分数和载荷检验各批次的特征轨迹。肝素乙醇沉淀体系主要由水、乙醇和肝素组成。肝素随着乙醇的加入不断沉淀;因此，三组分在上清液中的比例不断变化。图3显示了前两个主成分的分数散点图，它解释了总方差的98.88%。第一主成分(PC1)得分占解释方差的92.73%，随着乙醇沉淀过程的进行，得分稳步上升;第二主成分(PC2)得分占解释总方差的6.15%，在40 min后先上升后下降。从图中可以看出，5个批次得分轨迹相似，均从左下角开始，到右下角结束。如图1，加入乙醇后，肝素最初快速沉淀，但在40 min后，上清液中仍有少量肝素残留，沉淀缓慢。80分钟后，收集的样品中可以检测到很少的肝素。因此,图3结果表明，主成分分数在40 min时达到拐点。这一结果表明，分数散点图具有反映乙醇内部沉淀系统稳定性的潜力。首先，一定质量的肝素随着乙醇的加入而析出，从而破坏了系统的平衡。随后，肝素含量曲线和主成分评分均在40 min时达到拐点肝素钠残留在上清液中的杂质逐渐沉淀，系统稳定。
图3:对五批析出的肝素进行近红外光谱散点图评分。
PLS定量分析
在本节中，通过PLS回归来建立预测乙醇沉淀过程中肝素浓度的定量分析模型。首先，一个PLS定量分析模型采用完全预处理后的光谱，RMSECV和RMSEP分别为1.499 g/l和1.114 g/l。然而，这些变量对模型的重要性并不相等，其中一些变量的噪声大到足以干扰分析。变量选择是建模中的一个关键步骤，因为已经证明，选择明智的变量选择方法可以增强预测能力，并降低模型的复杂性[22］．为此，采用相关系数、遗传算法(GA)、前向区间偏最小二乘(FiPLS)和后向区间偏最小二乘(BiPLS)四种不同的变量选择方法，在预处理谱的基础上建立了具有良好预测能力的校正模型。根据百叶交叉验证法计算的RMSECV选择潜在变量的数量。数据集随机重新排序5次，以达到一个优化的解决方案[23］．变量选择后PLS回归得到的结果如所示表2．
| 方法 | RMSECV (g / l) | R2 | RMSEP (g / l) | 个人电脑 | RPD |
|---|---|---|---|---|---|
| - | 1.4998 | 0.972 | 1.1139 | 3. | 6.32 |
| 相关系数 | 1.4105 | 0.973 | 1.3688 | 5 | 5.14 |
| 遗传算法 | 1.2920 | 0.974 | 1.7592 | 4 | 4.00 |
| FiPLS | 1.4089 | 0.972 | 1.1054 | 3. | 6.37 |
| BiPLS | 1.3096 | 0.978 | 1.3242 | 4 | 5.32 |
表2:乙醇沉淀过程变量选择算法结果。
与之前用全光谱建立的PLS模型相比，不同变量选择方法的校正模型得到的RMSECV值更小。但是，只有FiPLS方法生成的RMSEP值小于全谱的RMSEP值，这表明FiPLS方法增强了模型的预测能力。此外，相对较高的RPD表明模型是稳健的，在预测化学成分方面非常有效。此外，使用FiPLS方法计算的RPD值大于5，证明了校准模型的鲁棒性和强大性[24］．当显示FiPLS算法选取的近红外变量的准确位置时，它们与9034.87-8940.37 cm的区域非常接近－1， 8649.17-8554.68厘米－1， 7974.21-7686.87厘米－1， 7395.67-7301.18厘米－1和5949.32-5758.4厘米－1．前三个潜在变量的负载显示在图4．
图4:从主成分分析中得到的近红外光谱在乙醇沉淀过程中的负载。
负荷1的峰值在5600 - 6000 cm之间－1可以归因于OH键。然而，由于近红外光谱的复杂性，它不能最终确定吸收是否是乙醇在体系中存在的结果。因此，如图所示图5，基于预处理光谱和FiPLS变量选择方法建立的校准模型与其他模型相比具有更好的结果。R2、RMSECV和RMSEP分别为0.974、1.409和1.105 g/l，潜在值为3个，避免了过拟合多元校正．但RMSECV高于FiPLS模型计算的RMSEP。这可能是由于某些样品的存在对校准产生了重大影响。当这些样本被剔除后，可预测性就受到了影响。这也导致了RMSECV的增加。这一现象的具体原因仍在调查中。
图5:紫外分析测量的参考值与基于预处理光谱和FiPLS变量选择方法建立的PLS模型预测值的比较。
基于本研究的结果，近红外光谱结合化学计量学方法可以对肝素乙醇沉淀过程进行定性和定量监测。首先，通过主成分分析法得到的前两个主成分的得分散点图可以定性表征肝素乙醇沉淀过程的稳定性和特征轨迹。在此基础上，建立了PLS标定模型预处理的光谱并对上清液中肝素含量进行了定量分析的变量选择方法。本研究为快速、实时监测肝素乙醇沉淀过程提供了一种解决方案。事实上，本研究有可能为在线监测GAGs的乙醇沉淀提供可行性参考。
感谢合同号2012AA021505的863计划(中国高新技术研究与发展计划)和山东省科技发展计划(2009GG10002081)的资金支持。
