研究和评论:药物分析杂雷竞技苹果下载志》上
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Chunsu梁1,2,冲苏2,刘迎泽2,天明(任2顾,京开2,3*
2生命科学部门,研究中心药物代谢中国,吉林大学、长春、公关
3北京理工大学现代药物代谢,北京,中国
收到了:09 - 3月- 2022年手稿。jpa - 22 - 56295;编辑器分配:11 - 3月- 2022,PreQC不。jpa - 22 - 56295 (PQ);综述了:23 - 3月- 2022,QC不。jpa - 22 - 56295;修改后的:25 - 3月- 2022年手稿。jpa - 22 - 56295 (R);发表:01 - 4月- 2022年,DOI: 10.4172 / 2320 - 0812.11.02.003
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生物分析法中齐墩果酸的老鼠使用微分迁移等离子体光谱法(DMS)串联质谱结合多个离子监测(MIM)方法的开发和验证。齐墩果酸是一种五环三萜化合物来源于植物,有各种各样的生物活性。很难确定使用质/因为它可怜的女士Collision-Induced离解(CID)效率分析在多反应监测(MRM)模式。为了增加灵敏度和简化生物样品制备,我们探索了UPLC-DMS-MIM方法。较好的准确度和精密度达到范围在3 - 300 ng / mL的运行时间只有3分钟。异丙醇作为有机改性剂促进良好的灵敏度和分离。分析的方法是一个概念验证报告的化合物不能产生稳定和丰富的片段由于太多的碎片或贫穷CID效率。
微分迁移谱;质谱;多个离子监测;齐墩果酸;生物分析法。
齐墩果酸(OA)是一种植物的五环三萜化合物与不同的生物活性,广泛存在于水果和蔬菜(1]。野生的临床应用,包括抑制癌症的2- - - - - -4],anti-osteoporosis [5),防止胃肠疾病(6),提高食源性肥胖(7),降脂(8,抗炎9),抗氧化和免疫调节10],epatoprotective作用[11]OA平板电脑已经应用于临床辅助治疗急性和慢性肝炎在柜台药品在中国几十年。最近研究OA主要集中在探索新的药理作用,在活的有机体内药效学机制,不同的OA剂型的发展。此外,OA可以提供一个框架的发展新的合成常用药用。以上需要PK的支持研究体内。
目前,液相色谱-光谱法结合多反应监测(MRM)已成为使用最广泛的方法来分析在生物样本矩阵(12]。MRM模式的三重四极质谱仪,第一个四极(Q1)扫描前体离子,第二个四极(Q2)产生一个或多个主要碎片离子通过碰撞诱导解离(CID)和第三四极离子(Q3)扫描产品。因此,MRM的敏感性不仅取决于前体离子和产品的丰富,而且在CID的效率。低效的CID碎片问题挑战MRM的敏感性。因为OA属于五环三萜,很难分散,为MRM生成丰富的碎片离子检测四极3。数质或质/ MS方法确定OA已报告在生物液体。郑等人设计并合成了一种衍生化试剂从老鼠血液中提取OA使用磁质前分散固相萃取/女士(13]。金等人开发了一个质/ MS方法与乙酸乙酯液液萃取后和聚乙烯确定3-O-acetyl-OA和OA在大鼠血浆14]。除了样品制备时间长,分析时间7分钟运行而OA的保留时间为4.44分钟,赵等人开发了一个13分钟质方法量化oleanolic和乌索酸在大鼠血浆使用HPLC-MS液体萃取(15]。史,等人做了OA的药代动力学研究老鼠使用液体chromatography-tandem质谱(质/ MS)在选择离子监测(SIM)模式(16]。
使用质或质/ MS不可避免的弊端是:1)电离效率低,导致低灵敏度,所以衍生化步骤必须被用来提高离子化效率;2)裂解效率低使用多个离子监测(MIM) [17]。尽管MIM SIM的基础上加以改进,但它比SIM在相同的色谱条件下,但干扰仍然存在。在MIM模式下,选择相同的m / z Q1和Q3。Q1选择最丰富的前体离子和Q3让完整的前体离子通过检测器。在Q2,碰撞能量的优先选择是获得最低分析物强度损失和最低等压基体效应。由于潜在的等压相同的离子m / z矩阵产生的生物可能coelute分析物,它可能导致试验特异性低,强大内生干扰和高色谱基线。要解决这些问题,可以采取两种策略:1)提高样品的分离和浓缩过程处理过程,使样品进入质谱更清晰;2)选择填料粒径较小的列或更长时间列长度达到更好的分离色谱分离和延长时间尽可能地消除干扰。
可以有一个新的质谱解分析这些化合物的挑战吗?微分迁移谱(DMS)是一种新的分离技术2007年商用(18]。DMS仪器基本上是一个漂移细胞由两个平行平面板放置在电离源四极0。它可以在几分钟内安装或删除,没有需要打破真空或使用任何工具。随着离子迁移对DMS的壁细胞在不同的利率,他们会分开。当射频电压(分离电压、SV)应用于各个板块,第二电压补偿(补偿电压,浸)的目标离子可以纠正DMS的沿轴向孔细胞。其他物种与不正确的x和迁移距离直线流动的差异。因此,只有目标离子可以进入女士当其他离子不能达到微分迁移细胞的退出。
DMS的分离是基于电场漂移时代的不同,相关的大小、形状、电荷状态,和化学相互作用的化合物18]。它提供了一个额外的维度分析分离的选择性增加力量,即使离子m / z和色谱保留时间相同。post-ionization技术,DMS可能优于其他分析技术在克服co-eluting基质干扰,降低背景噪音,尤其是在一些复杂的生物矩阵可以提高数据质量。
在这里,我们报告一个成功应用modifier-assisted LC-DMS-MIM方法确定OA在大鼠血浆,促进新的战略在活的有机体内天然化合物的定量差的CID效率或太多的碎片。
试剂和化学物质
OA (C30 h48o3,中科院508-02-1,纯度> 98.0%)和辛伐他汀酸铵盐(C25 h43no6,中科院139893-43-9,纯度> 99.0%)作为内部标准(是)从国家获得的控制药品和生物制品研究所(北京,中国)。OA,所示的结构图1。乙腈(HPLC-grade)购买的费舍尔科学(公平的草坪,新泽西,美国)。蒸馏水制备软化水。固相萃取(SPE)墨盒购买的水域为绿洲HLB(美国)。
图1:OA和结构。
标准和质量控制(QC)的解决方案
股票的解决方案的OA(100µg /毫升)与乙腈稀释(90%)产生一系列的标准解决方案(3、5、10、30、50、100和300 ng / mL)和质量控制解决方案(5、30和240 ng / mL)。
样品制备
血浆样品(校准标准,QC样品或测试样本)50µL涨跌互现25µL正在解决方案和1毫升水,离心机和转移到固相萃取(SPE)列之前的洗脱条件1毫升甲醇其次是1毫升水SPE列1毫升水清洗两次分析物和后被筛选了1毫升异丙醇:水(挺;v / v)。50µL洗提液混合1毫升水,最后一卷10µL准备样品注入UPLC-DMS-MS / MS系统。
UPLC和DMS-MS / MS条件
UPLC进行一个H类超高性能LC系统(珀金埃尔默,Waldbronn,德国)。C18警卫列(Phenomenex,荷兰乌得勒支)是能够帮助减少峰值分散,防止污染物和microparticulates女士进入列温度维持在40°C。溶剂的流动相由B(0.35%甲酸)和溶剂(乙腈)交货0.5毫升/分钟根据以下线性渐变:0 - 3分钟,90% B。
从AB Sciex DMS-MS / MS系统。6500年QTRAP配备了SelexIon®DMS细胞(加拿大安大略省康科德)安装后电离源。电喷雾电离(ESI)在负离子模式下执行的Turbo-V ESI源设定在-4500 V和500°C。氮作为喷雾器气体(40单位),加热气体(40单位)、窗帘气体(30单位)和碰撞气体(媒介)。Declustering潜在的OA是-80 V和-50 V,而碰撞能量被设置为-50 eV - -22 eV OA,分别为(图2)。检测OA的MIM过渡的m / z 455.5→455.5,并在435.2→319.1 m / z。数据采集和集成控制分析软件1.6.2 (AB Sciex,安大略省,加拿大)。DMS电池温度(DT)和偏移量分别设置为150°C和3.00。SV OA 3000 V,浸4 V。异丙醇作为有机修饰符和引入运输天然气的流量250µL /分钟。DMS分辨率增强(DR)气体(氮气)被设定为20 psi。
图2:DMS-MS / MS系统和条件。
试验验证
特异性估计通过分析无毒血浆样品从六个老鼠在与分析物并没有飙升。内部和inter-day精度(相对标准偏差、相对标准偏差)和准确性(相对误差、再保险)进行评估分析,六个复制LLOQ和QC样品在三个独立的日子。线性范围在3 - 300 ng / mL的分析物被线性最小二乘回归计算的加权指数(1 / x2)根据峰面积校正曲线比准备一式三份,从三个不同的批次。复苏评估比较分析物的峰面积,并在六个复制的QC样品与post-extracted空白血浆样本在相应的浓度上升。基体效应比较分析物的平均峰面积测定和六个复制post-extraction飙升的样本在同一浓度与相应的解决方案。OA的稳定性研究股票的解决方案在4ºC 6 h和QC样品在下列条件:室温下6 h(短期稳定);−80ºC为7天(长期稳定);和三个冻融循环后−80ºC到室温(冻融稳定性)。稳定在处理样本存储在自动取样器瓶4ºC 6 h也被评估。
药代动力学研究分析
六大鼠(体重200±20 g)购买来自吉林大学动物实验中心。动物福利和实验程序依法进行指导的实验室动物保健和使用美国国家研究委员会(1996)和《吉林大学的有关伦理法规。老鼠禁食24 h(免费水)之前实验。然后他们每个人管理OA的口服剂量100毫克/公斤。收集血液样本(50µL)到肝素化管前剂量在5分钟,15分钟,1 h, 1.5 h, 2小时,3小时,4 h, 6 h, 8 h, 10 h和给药后24小时。立即,等离子体被离心分离在15000 rpm 10分钟和由此产生的等离子体是储存在-20ºC。
Non-compartmental PK模型大鼠血浆了。3.0 PK数据计算使用药物和统计(DAS、中国药科大学、南京,中国),包括等离子体的最大浓度(Cmax),对应的时间(达峰时间),血浆浓度时间曲线下面积(AUC),终端半衰期(t1/2)和平均停留时间(捷运)。
UPLC条件的优化
针对这一事实反相色谱法是一种常用的分离系统在质/ MS分析中,结合OA的电离特性,选择乙腈作为有机相。电离效率,质谱响应强度和色谱分析物的行为在不同的pH值。当甲酸浓度调整到0.35%,敏感性,峰值形状和保留时间可以调整到最好。
DMS条件的优化
MIM法往往受到很大的挑战高背景噪声等缺点,因为基本上是女士的CID功能关掉把损失减小到最低限度的前体离子19]。DMS提供了一个新维度的选择性和任何应用程序的性能要求的隔离挑战co-eluting污染物和减少高背景噪音。DMS的参数进行了优化,增加浸在不同条件下,包括SV、DMS决议(DR)增强和DMS温度(DT)。
SV射频波形的振幅,改变离子的微分迁移,因此其轨迹。SV改变时,一个新的x需要正确的轨迹。一般来说,更高的SV分离中获益。但是不推荐值超过3800 V。因为过高的电压将导致局部放电电极之间的狭缝。x是一种测量离子的微分在特定实验条件下流动。这是一个直流潜在用来抵消离子的迁移对电极响应SV。它的大小正比于离子的微分迁移。在这个实验中,SV OA的3000 V的张开面积和张开体积和4 V,分别。博士的压力气体流入反对运输气体(氮气)。 There are five DR enhancement modes in the Sciex DMS system, including open, off, low, medium, and high. Usually, a higher transport gas flow rate will reduce the intensity but increase the power of the separation of isobaric species. Here low DR enhancement, 20 psi, was applied. It has been proved that DT had little influence on separation. Here, the value of 150°C was found to be acceptable.
据报道,化学修饰符添加一个新维度的引入提高分辨能力和峰容量19]。可以引入传输多个化学试剂气体流量的修改与窗帘气体离子交互DMS漂移细胞。不同的物种有不同的亲和力与这些有机修饰符形成集群。当集群之间的离子迁移的高场和低场部分应用射频,他们会有不同的集群和分块。离子将de-cluster由于更高的能量高的领域。相反,集群将形成在低场部分。这种交互可以显著提高DMS细胞的分离能力。
结果表明,异丙醇可以提高降噪效果。通过引入更多的修饰符,将形成更多的集群,最初的分离行为的更大的变化发生了。但是过多的修饰符将分析物的浓度降低到女士,以便降低强度。这里,介绍了异丙醇运输天然气250µL /分钟。
MS / MS的优化条件
在一个三重四极质谱仪,CID,一些称为碰撞离解(CAD)激活,发生在Q2。细胞的碰撞中,离子与中性的气体相撞,这将导致债券破损的碎片离子成更小的碎片。OA,五环三萜皂苷,可以打破RDA(复古一昼夜的桤木反应)在DMS电离质谱,产生两个主要碎片离子,一个是片段与a和B环骨架(m / z= 208),另一个是片段D和E环骨架(m / z= 248)。特殊结构的软电离质谱,五环的常用药用不能被打破,形成稳定的碎片离子碰撞能量的增加。因此,它只能检测到MIM模式,即离子检测到Q1和Q3是相同的吗?当使用MIM模式时,可以添加一定量的碰撞能量碰撞池Q2减少和消除一些背景干扰。考虑到分析物和内标都包含一个得羧酸集团等不含杂原子N, S,等,和羧基可以电离,使脱氢生成准分子离子峰(mh)——负离子检测模式下,负离子检测模式被选中。
确定检测离子反应后,我们进一步优化质谱参数。在优化过程中,发现的价值declustering电压对OA的信号有很大的影响:与declustering电压的增加,OA的信号反应逐渐减少,这可能是由于CID效率低和缺乏稳定的碎片。最后,OA的declustering电压选择as-50V OA,和其他参数调整在同一时间。结果表明,离子反应m / z455.5→455.5是最好的。
试验验证
测定的线性范围在3 - 300 ng / mL的典型回归方程y = x 0.0086 - 0.0122 (r20.0088 = 0.9969),y = x - 0.0090 (r2= 0.9953),x和y = 0.0093 - 0.0111 (r2 = 0.9953) OA在三个不同的天。LLOQ 3 ng / mL。内部,inter-day OA在大鼠血浆测定的精密度和准确度的六个复制QC样品在三个不同的日子是令人满意(表1)。OA在大鼠血浆稳定在-80ºC, 7天6小时在室温下,后3冻结/解冻周期。处理过的样品稳定在4ºC 6 h (表2)。
| 浓缩的上升。(ng / mL) | 浓缩的计算。(ng / mL)(平均数±标准差) | 盘中相对标准偏差(%) | Inter-day相对标准偏差(%) | 准确性再保险(%) |
|---|---|---|---|---|
| 3 (LLOQ) | 3.04±0.20 | 9.9 | 6.01 | 1.46 |
| 5 | 4.90±0.43 | 8.29 | 8.79 | -2.07 |
| 30. | 31.6±1.59 | 3.63 | 5.19 | 5.44 |
| 240年 | 237±9.76 | 2.62 | 4.25 | -0.53 |
表1。准确度和精密度的测定大鼠血浆中齐墩果酸(数据是基于分析六个复制QC样品在三个不同的日子)。
| 浓缩的上升。(ng / mL) | 存储在-80ºC | 储存在室温下6小时 | 冻结/解冻稳定 | 处理样品的稳定性(4ºC 6 h) | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 为7天 | (3周期) | |||||||
| 平均数±标准差 | 再保险(%) | 平均数±标准差 | 再保险(%) | 平均数±标准差 | 再保险(%) | 平均数±标准差 | 再保险(%) | |
| 5 | 4.86±0.21 | -2.8 | 4.74±0.41 | -5.2 | 4.75±0.25 | -4.93 | 4.76±0.32 | -4.8 |
| 30. | 28.8±1.49 | 4 | 27.5±0.93 | -8.22 | 28.8±2.05 | -3.89 | 28.8±2,69年 | 4 |
| 240年 | 216±5.69 | -9.86 | 222±3.79 | -7.64 | 220±6.43 | -8.47 | 225±8.14 | -6.11 |
表2。齐墩果酸的稳定性在不同储存条件下大鼠血浆和准备样品。
LC-DMS-MIM与LC-MRM和LC-MIM相比
最初,LC-MRM法和LC-MIM法相比,LC-DMS-MIM方法。LC-MRM色谱表明,OA几乎被淹没在高背景噪声(图3一),在LC-MIM co-eluted干扰(图3 b)。相比之下,调查显示更提高特异性和信噪比在使用LC-DMS-MIM (图3 c),这表明DMS可以显著减少干扰和背景噪音。
图3:LC-MRM LC-MIM和LC-DMS-MIM方法。
药代动力学的研究使用UPLC-DMS-MIM OA
意味着OA和calenduloside E大鼠血浆浓度时间曲线所示图4与相应的PK参数中列出表3。OA口服后,在等离子体的平均Cmax OA只有78.07 ng / L,表明OA可能转化成其他代谢物。监测OA的葡萄糖醛酸结合化合物后,calenduloside E,发现calenduloside E的AUC是OA和C的50倍马克斯OA的约30倍。OA的血浆浓度时间曲线显示了两个吸收峰,第一个高峰是在60分钟,第二个高峰是在360分钟。这可能是由于OA的肝肠循环的吸收,然后运送到肝脏,它转化为葡糖苷酸绑定复合calenduloside E,在胆汁排出后,再运到回肠,最后水解OA。
| 参数 | 单位 | 对OA平均数±标准差 | 平均数±标准差CE |
|---|---|---|---|
| AUC0-t | ng * h / L | 386.14±148.80 | 21025.51±5779.20 |
| AUC0 -∞ | ng * h / L | 413.06±155.03 | 43322.62±35801.41 |
| 捷运0-t | h | 7.34±1.66 | 9.32±1.82 |
| 捷运0 -∞ | h | 9.21±2.64 | 22.19±10.85 |
| t1/2 | h | 5.58±3.24 | 11.96±7.08 |
| T马克斯 | h | 4.25±2.44 | 3.92±3.58 |
| C马克斯 | ng / L | 78.07±59.25 | 2231.67±1219.83 |
表3。齐墩果酸的药代动力学参数和calenduloside E后,大鼠口服100毫克公斤/毫升齐墩果酸(数据均值±s.d n = 6)。
图4:意思是血浆浓度时间曲线OA和calenduloside E的老鼠。注意:
齐墩果酸;
Calenduloside E
电离效率低的问题或强干扰分析的化合物在活的有机体内只能通过复杂的样品处理和分析时间长,和一些可能不会解决。我们把OA作为一个例子来证明LC-DMS-MIM方面具有特别的优势可能会解决一些棘手的问题不能解决LC-MRM或LC-MIM,例如,五环的triterpenoid-like分子。我们选择了最丰富的离子对四极1和四极3实现良好的灵敏度。有机改性剂,异丙醇,是促进良好的分离和结合的敏感度。与MIM或MRM, DMS - MIM矩阵可以减少干扰和化学背景。因此,DMS可能成为小说分析仪器加上色谱和质谱分析。最近,LC-DMS——MIM尚未广泛应用于生物分析法区域,这份报告提供了更大范围的支持数据应用女士在CID效率差的测定分析物或太多的碎片在生物矩阵。
这项工作得到了国家自然科学基金(批准号81872831、82030107、82030107)和国家科技重大项目重大新药创建13五年计划(2017年zx09101001和2018 zx09721002007,中国)。