SBBR同时硝化反硝化硝化细菌组成及丰度的定量分析

宏伟荣^＊，王静银，张超声，高冠华
广州大学珠江三角洲水质安全与保护教育部和广东省重点实验室，广州510006

通讯作者:荣宏伟，广州大学珠江三角洲水质安全与保护教育部和广东省重点实验室，广州510006电子邮件:(电子邮件保护)

收到:01/07/2015接受:21/09/2015发表:09/11/2015

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摘要

揭示…的效果溶解氧(DO)对同期微生物群落结构的影响硝化作用而且反硝化作用(SND)在测序生物膜间歇反应器(SBBR)，分子生物学技术变性梯度凝胶电泳(DGGE)、克隆和实时荧光定量PCR技术。DGGE序列分析表明，某些群体一直具有高度优势，克隆和克隆种系发生树AOB基因序列显示硝化螺旋体为优势种。实时PCR分析表明，AOB和NOB的数量均以下表面的拷贝数最多，3个样品之间的AOB和NOB群体数量关系为“下surfaceï¼\上surfaceï¼\内层”。结果表明，DO浓度直接影响生物膜中好氧部分和缺氧部分的比例，从而影响SND的效率。

关键字

氨氧化细菌(AOB);亚硝酸盐氧化菌(NOB);溶解氧(DO);同时硝化反硝化(SND);序贯生物膜反应器(SBBR)

介绍

本研究采用序贯生物膜间歇反应器(SBBR)实现同时硝化反硝化(SND)。使用SBBR，微生物被固定在填料上作为生物膜，这导致高生物量保持，并使该过程能够在高液体吞吐量和有机负载率下运行[1］．与基于污泥的系统相比，SBBR通常更少的能源密集型和更耐冲击负荷废水处理系统经常受到[2］．此外，SBBR在发生高水力负荷变化时特别有用，在具有特殊代谢能力的缓慢生长的微生物可以免受冲蚀[3.］．然而，多项研究证实，同时硝化和反硝化(SND)可以在一个结构中完成生物硝化和反硝化耦合[4-6］．氨氧化菌(AOB)先将氨氧化为亚硝酸盐，再由亚硝酸盐氧化菌(NOB)将亚硝酸盐氧化为硝酸盐[7］．最后，反硝化包括通过亚硝酸盐和一氧化氮将硝酸盐还原为一氧化二氮或二氮气体[8］．

为了在SBBR中实现同时硝化反硝化(SND)，生物膜需要稳定的好氧区和厌氧区，并设置合适的操作参数，如溶解氧、温度、pH、抑制剂和中间体［9-11］．袁与Blackall [12]强调微生物群落结构和功能的优化应该是处理系统设计和运行的主要目标。尽管反应堆设计的发展与常规的化学监测(如NH₄⁺- n,在北半球_3.-N，溶解氧，pH值)和物理(如流速，温度)变量可以使工程师在短时间内提高工艺安全性并优化生物反应，只有当生物膜内的微生物群落优化其功能时，才能执行一致的长期性能。为此，必须通过分子监测工具来回答有关群落结构、活性和种群动力学的问题[12]，可以识别和量化污水处理厂中存在的微生物。

高效和健壮的关键生物废水治疗依赖于了解所涉及的微生物，以及它们对不同操作条件的反应[13］．基于16Sr RNA基因文库的活性污泥和生物膜微生物多样性研究在过去十年中已被报道。用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离扩增的16S rRNA基因，并测定其效果氨以及溶解氧浓度对硝化菌群落组成的影响[14-16］．但常用的16S rRNA引物用于AOB研究特异性有限，且AOB 16S rRNA基因之间的高度相似性使得无法解析和鉴定亲缘关系密切的AOB种。另外，功能基因编码氨单加氧酶(AMO)的α亚基，负责氨转化为羟胺在使用DGGE对AOB进行环境研究时，已作为一种特异性分子标记[17-20.]及实时PCR [21］．

为了揭示SBBR SND过程中DO对微生物群落结构的影响，需要分析不同操作条件下微生物的变化情况。本研究的主要目的是检验利用PCR-DGGE分析评估细菌多样性的可靠性，并在测序生物膜间歇反应器(SBBR)中量化氨氧化细菌和亚硝酸盐氧化细菌。DGGE基于变性剂浓度不断增加的丙烯酰胺凝胶基质中的不同迁移率，提供了关于相同长度PCR片段混合物的序列变化的信息[15];它可以方便地用来推断微生物群落组成的差异[22，23］．结合序列分析，将主要的环境波段切除，re-ampliÃ¯Â¬Â ed，并对其进行测序，进一步研究其身份。采用实时荧光定量PCR技术对同时硝化反硝化(SND)过程中硝化菌的定量进行分析比较。

材料与方法

实验设置和样品制备

给出了序批式生物膜反应器(SBBR)的原理图图1所示。在本研究中，从当地城市污水处理厂的二沉池收集的污泥中加入59.6%的NH₄-N去除效率。采用人工模拟污水作为SBBR系统的进水，COD约为300 mg/L, NH为25 mg/L₄-N和4.5 mg/L总磷适应环境和运营周期，分别为[24］．曝气过程中，溶解氧保持在2.5 ~ 4.0 mg/L。混合酒悬浮物sbbr中混合液挥发性悬浮物(不含生物膜)分别约为1.0和0.6 g/L。pH维持在7.0，水力停留时间(HRT)为7 h，温度为20±2℃。

搭建了SBBR实验装置，生物膜的形成过程约为25天。在成功完成生物膜形成的同时，在一个循环中随机选择每小时收集一次污泥样本。

DNA提取

从生物膜的上表面、内层和下表面三个深度分别采集了0.5 g的污泥样品。样品原理图显示在图2．根据制造商的描述，使用3S DNA分离试剂盒V2.2提取环境样品(上海申能生物色素有限公司)。提取的DNA溶于50 μl TE缓冲液(10 mMTris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5) [25]和quantiÃ¯Â¬Â通过在260 nm处用a测量其吸光度分光光度计．提取的DNA质量用电泳在1.0%的琼脂糖凝胶上。

PCR和DGGE

所使用的引物和PCR条件均列于表1。细菌种群分析采用引物直接扩增上述样品，将提取的DNA 1 μl加入25 μl PCR master-mix(北京天根生物技术有限公司)中。分别在恒温循环仪(S1000, Bio-Rad, USA)中，在一定条件下进行PCR循环。PCR扩增后，取3 μl PCR产物在1.2% (w/v)琼脂糖凝胶上电泳，然后用溴化乙乙染色检查。

PCR产物的DGGE在含有8% (w/v)的聚丙烯酰胺凝胶中进行变性梯度(尿素和甲酰胺)35%至65%，使用D-code DGGE系统(BIORAD实验室，美国)。用1x TAE黄油在75 V和60°C下进行电泳14小时。电泳结束后，用GelRed染色30分钟，然后用milliq水冲洗。凝胶在紫外透照度台上(Bio-Rad的宝丽来凝胶记录系统)扫描，获取DGGE波段图像，并使用Quantity One软件进行分析[26］．

序列分析

从DGGE凝胶中取出所选条带，用20 μl组织培养水在4℃下洗脱过夜。按照上述程序，用PCR重新扩增3微升洗脱的DNA。还对各反应混合物进行了DGGE分析，以确认回收带的熔融行为。随后，北京基因组研究所(BGI)获得了特异性序列。最后，通过BLAST GenBank数据库搜索确定序列身份[32］．的nucleotide alignments were used to create a phylogenetic tree using Clustalx 1-83 software program [33］．

实时PCR检测

实时聚合酶链反应使用Applied Biosystems Step One™实时PCR系统进行定量。的引物为AOB和NOB(表1)由上海生工生物工程技术服务公司(上海，中国)生产，从样品中提取的DNA每稀释10倍。

采用Q3000型Bioanalyzer紫外分光光度计(Quawell Technology Inc.， San Jose, CA, USA)实时荧光定量PCR法测定SBBR样品中AOB和NOB细菌16S rRNA基因的拷贝数。每个PCR混合物(25 ml)由12.5 μl 1 × SYBR Green PCR主混合物(Applied bio systems)、1 μl正向和反向引物、1 μl模板DNA或10倍稀释提取质粒DNA组成[34］．在ampliÃ¯Â¬Â ation后对SYBR Green检测进行熔解曲线分析，以区分目标PCR产物和非目标PCR产物。

为制备细菌标准物，将AOB和NOB的16S rRNA基因用speciÃ¯Â¬Â c引物从提取的DNA中提取PCR-ampliÃ¯Â¬Â(表1), PCR产品puriA¯A¬ed的puriA¯A¬阳离子工具包(Biodev-Tech有限公司,北京,中国),紧随其后的是克隆使用pGEM-T简单向量(豆类生物技术、日本)。质粒从适当的插入克隆目标基因提取并作为标定曲线的标准。

结果

反应器的性能

SND (η)速率_TN)可能是同时硝化反硝化(SND)的指标。SND速率的估计是基于硝酸盐、亚硝酸盐或NH的浓度₄-N分别为进水和出水。

式中，为碱基对的数目，ρ(NO_x^-- n)_废水和ρ(不_x^--N)进水为出水和进水中硝酸盐和亚硝酸盐浓度之和。和ρ(不₄⁺- n)_废水和ρ(不₄⁺- n)_影响NH的浓度是多少₄出水和进水分别为-N。

图3说明了NH₄随着曝气时间的延长，出水-N浓度迅速下降，8 h后系统对铵的去除率可达85%。SND速率为图3的系统已经超过90%在3^{理查德·道金斯}保持稳定的SND率(90%~100%)，直至循环结束。出水稳定，SND率高(≥90%)，表明SND系统成功实现。

生物膜中细菌群落的DGGE分析

3个样品的DGGE配置ampliÃ¯Â¬Â，不同的V6-rDNA, AOB, NOB和反硝化细菌的特殊引物(列于表1)已在图4。从不同深度采集的三个样品(见图2)，而SND在稳定的运行条件下达到。可以看出，上表面、内层和下表面的细菌群落结构非常相似，几乎没有任何差异。Shannon多样性指数变化较小(结果未显示)。我们之前的研究发现SBBR中SND是由缺氧引起的微环境在好氧条件下存在于生物膜中。DO浓度直接影响生物膜中好氧部分和缺氧部分的比例，从而影响硝化和反硝化的效率[36］．因此好氧细菌可以在上下表面大量生长，而厌氧细菌只能生活在内层。DGGE对不同细菌间的遗传多样性高度敏感，结果与预期不符。一个生物膜中不同深度的DO浓度可能只是数量，而不是微生物群落组成[23］．DGGE不能反映群落结构的变化，采用实时荧光定量PCR分析比较了生物膜不同深度硝化菌的定量情况。

DGGE波段的比较序列分析

从丙烯酰胺凝胶中分离出几个我们感兴趣的条带，用专用引物重新扩增，得到了条带的序列。使用BLAST搜索算法，一般细菌之间相似性值较低。通过序列分析将这些克隆聚为3个不同的类群。对来自AOB基因片段的DGGE条带进行测序，结果表明，位于较近位点的DGGE条带具有较高的相似度(图5)。一些克隆序列可能只存在几个碱基的差异[37］．通过对AOB系统发育树结果分析，A组和B组均与amoA基因相关，且几乎都与未培养菌具有较高的序列相似性。在C组中，OUT12的序列相似性为98%Nitrosospira， OUT13的序列与细菌和有关Nitrsospira，相似度分别为80%和92%。从AOB系统发生树的结果显示存在一些优势种，如Nitrsospira，其中克隆数量最多，在整个色谱柱中均有出现[38，39］．

实时荧光定量法定量AOB和NOB

在实时PCR分析中，定量是基于阈值周期(Ct)，它与初始基因拷贝数的对数成反比。为每个样本获得的阈值周期值应与标准曲线进行比较，以确定目标基因的初始拷贝数。由于实时PCR检测的基本原理是将一系列不同引物组获得的定量数据与只有一组引物组的一个标准系列进行比较，因此需要不同反应之间相似的PCR效率，以便比较不同引物组获得的实时结果[40，41］．

采用Real-time PCR技术定量测定了稳定SND条件下生物膜不同深度内氨氧化菌(AOB)和亚硝酸盐氧化菌(NOB)的拷贝数，结果列于图5。实时PCR检测结果显示，AOB和NOB的拷贝数均位于下表面，AOB和NOB的拷贝数分别为4.79 × 109 copies/ng和7.43 × 104 copies/ng(图6)。在AOB和NOB种群拷贝数的基础上，数量关系为“下surfaceÃ¯Â¼Â \上surfaceÃ¯Â¼Â \内层”。缺氧导致生物膜内层AOB和NOB含量低。

讨论

本研究开发并结合real-time PCR和PCR- dgge分析，在同一生物膜的不同深度采集样品，分析微生物群落组成的差异。

结合克隆文库，从AOB系统发育树中得到的结论表明存在一些优势种，如Nitrsospira，其中克隆数量最多，并且存在于整个色谱柱中。

但结果与我们之前DGGE凝胶纯培养的研究不一致[42]，发现各污水处理厂的DGGE条带大多与之密切相关亚硝化单胞菌Spp .，不是toNitrosospiraspp。23］．斯蒂芬等人。[43]利用选择性PCR和DNA制备的16S-rRNA基因文库，对氨氧化β-变形菌进行了初步的系统发育调查，结果显示，大多数富集的β-变形菌含有新的亚硝化单胞菌类序列，而新奇Nitrosospira类序列在基因库中更为常见。结论有助于解释我们两项研究之间的矛盾。

在反应器中必须控制的最重要的因素是稳定的微生物群落组成。AOB的序列分析为监测一般微生物群落变化提供了可靠的方法。我们可以尽可能地控制与微生物表征相对应的参数，以增强SND的效果。例如，选择合适的碳源或氮源将在以后的研究中提供。同时，序列分析表明Nitrosospira细菌并不是反应器中唯一的群落成员，而且还存在一些其他的假单胞菌，这些假单胞菌可能会干扰亚硝酸盐细菌的生长，影响SND。因此，我们可以加入一些试剂来抑制这些无用的细菌。该方法有助于实现SND，改善出水水质。

针对AOB和NOB的实时PCR检测显示SND过程中生物膜中不同深度的拷贝数。三个样本间AOB和NOB种群数量关系为“下surfaceÃ¯Â¼Â、上surfaceÃ¯Â¼Â、内层”。说明生物膜内层已形成厌氧环境，对AOB、NOB等需氧细菌具有抑制作用。基于生物膜内DO扩散模型，分析了SBBR中SND的机理。研究发现，SBBR中SND是由好氧条件下生物膜中存在的缺氧微环境引起的。DO浓度直接影响生物膜中好氧部分和缺氧部分的比例，从而影响硝化和反硝化的效率[44，45］．随着DO浓度的增加，氧的速度转移效率提高，使微环境由缺氧环境转变为好氧环境。随着DO浓度的降低，微环境有由好氧环境向缺氧或厌氧环境转变的趋势[36，46］．

上表面AOB含量接近下表面，下表面NOB含量为上表面的两倍。此外，上表面NOB的数量接近于内层的拷贝数。根据SBBR的结构，曝气器位于反应的底部，因此下表面首先暴露在氧气中。曝气起着重要作用，气泡在水中上升的速度导致下表面DO高于上表面。NOB的氧饱和系数为1.2~1.5 mg/L, AOB为0.2~0.4 mg/L [44］．由于上述原因，低浓度DO抑制了NOB的活性，但不影响AOB在上表面的生长速度。结果与理论一致，下表面NOB的拷贝数是上表面的2倍，但AOB的拷贝数几乎相同。同时也揭示了SBBR中存在的溶解氧(DO)是实现较高SND程度的重要因素。

确认

国家自然科学基金(No. 51278133,51178125)、广东省国家自然科学基金(No. 51278133,51178125)资助。S2013010013943，广东省科技计划项目(No. 2012B030800005)，广州市教育系统创新团队。

表格一览

表1

数字一览


图1	图2	图3

图4	图5	图6

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