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ISSN: 2319 - 9873
+ 44 7456 0355801化学、生物学、物理学和工程,多恩大学,克里特岛、内布拉斯加
收到的日期:12/09/2017;接受日期:14/10/2017;发布日期:24/10/2017
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生物膜表面附有微生物群落和嵌入在一个胞外聚合物物质提供保护,稳定和营养的各种细菌物种永存。这些社区可以在各种不同的环境中建立,从工业设备、医疗器械造成的损失,损失的生产力和疾病。他们也有巨大的经济和社会效益潜力作为生物修复剂和可再生能源。生物膜的潜在益处和威胁鼓励跨学科研究人员研究生物膜特征和antibiofilm策略导致化学家、物理学家、材料科学家和工程师,开发有益的生物膜应用程序和预防方法。最终的结果是大量的知识和创新技术。然而,没有广泛的正规训练在微生物和生物膜的研究中,这些科学家找到一个令人畏惧的增长,建立技术量化和描述生物膜在设计实验和开发创新实验室协议。这个小侧重于丰富跨学科的努力和理解的各种定量和定性概况生物膜的表征方法协助新手研究员分析选择。本文由四个部分组成。第1部分简要概述生物膜和独特的属性,要求高度跨学科的方法。第2部分描述了古典量化技术包括集落形成单位(CFU)计数和结晶紫染色,还介绍了一些现代方法包括ATP生物发光和石英晶体微量天平。 Part 3 focuses on the characterization of biofilm morphology and chemistry including scanning electron microscopy and spectroscopic methods. Finally, Part 4 illustrates the use of software, including ImageJ and predictive modeling platforms, for biofilm analysis. Each section highlights the most common methods, including literature references, to help novice biofilm researchers make choices which commensurate with their study goals, budget and available equipment.
生物膜、跨学科研究、定量生物膜特征,定性生物膜特性
生物膜是一个复杂的三维微生物群落,生长在一个接口和与周围的环境相互作用1,2]。生物膜有很大的潜力有待开发的可再生帮助应用程序浪费,水土修复通过潜在的有毒化合物的吸收和转换3- - - - - -5]。此外,生物膜有可能彻底改变能源和化工生产可再生来源的生物催化和电化学电池(6,7]。不幸的是,生物膜的主要医疗问题导致的60 - 80%微生物感染和提供一个独特的挑战对于疾病的诊断和治疗(8,9]。生物膜也构成社会和工业问题通过设备污染导致的生产力损失,产品召回和潜在流行病[10,11]。正是这些创新和挑战,燃料的跨学科研究生物膜和最佳实践的需要更好地理解生物膜的研究。
生物膜通常由多个微生物物种表现出复杂的社区组织和合作导致紧急属性,有助于生物生存在恶劣的条件。在生物膜内,细胞与小分子以沟通协调活动导致的生存的社区会影响生物膜的组成和结构。生物膜结构通常由生活和死亡的细菌细胞,胞外聚合物物质和其他材料由细胞分泌的(12]。虽然结构和空间组织主要是由细菌和细菌物种的比例,细菌适应的物理结构和材料特性矩阵基于微生物种群的变化和剪切应力等环境条件,营养可用性和竞争生物体作为生存的措施。作为奖励这些适应性,生物膜演示增加耐寒性与化学条件艰苦、饥饿和抗菌药物。事实上,生物膜的适应性矩阵被认为是生物膜的重要组成部分的持久性在严酷的环境下由于减少抗菌药物通过扩散能力的结构从而只允许剂量照射细胞这些代理。此外,细胞的近距离允许增加潜在的细菌传播抗菌素耐药性,限制未来的材料和方法可用于anti-biofilm治疗。最后,环境要素纳入矩阵可以作为营养物质在饥饿条件下(13]。虽然已经取得了许多进步在理解这些复杂的生物膜的特性还有很多工作。带来挑战的复杂性是最好的了一个多学科的方法不仅能够解决传统生物学性质的电影,而且他们的动态化学、物理和材料属性。
生物膜动力学和复杂体系结构创建挑战基本测量关于可行的细胞的数量,质量积累,生物膜形态、和其他重要属性。这些挑战不测量本身,但在缺乏标准化的协议描述和统一培训可用性为个人想导致生物膜相关项目没有正式的培训在生物膜研究辨别最优表征方法的研究。例如,生物膜累积测量可以专注于总干质量、总有机碳、活细胞的数量,或细胞总数(生活和死亡)。电影形态学研究可能涉及二维表面结构照明通过染色技术和光学显微镜或三维特性揭示了激光共焦扫描显微镜(CSLM) [14,15]。适当的选择基于信息技术,设备可用性、成本和易用性将通过本指南。在以下部分中最常用的方法,生物膜特征将详细讨论的资源来帮助规划生物膜特性实验。
的一个最基本和最常见的类型的细菌测量,在浮游生物膜或文化中,是否存在多少的决心。各种直接和间接的方法被用来量化细胞生物膜。直接计数方法允许枚举可以培养的细胞,包括板计数、微观细胞计数,Coulter细胞计数、流式细胞仪和荧光显微镜。干质量,间接测量方法包括测定总有机碳,微量滴定板化验,ATP生物荧光,总蛋白和石英晶体微量天平。应该注意的是,许多方法,直接或间接,涉及化的液体介质中的分散细胞生物膜通过商用之前分析均质器和涡混合16- - - - - -18]。
直接的量化方法
直接生物膜的方法量化是那些依赖于直接观察为量化所需的参数(数量的细胞,生物膜的总额,等等)。成像和自动细胞计数是最常见的生物膜的量化方法。此外,污渍或荧光标记的使用,为了更准确地识别感兴趣的细胞和区分文化碎片,允许更容易和增加细胞计数和数据解释的准确性。光和共焦显微镜成像方法,包括提供手册平台计算细胞和确定生物膜总额。仪器将流,如自动细胞计数器和流血细胞计数器,提供机械化方法。这些不同的直接方法将在后续章节中描述。
通过平皿计数测定活细胞数(集落形成单位/毫升或cfu)
活细胞计数,又名CFU /毫升化验或有氧板数,是一个标准的量化方法,用于确定可行的细胞的数量(19- - - - - -21]。这个试验的基本概念是独立的琼脂板上的单个细胞从细胞和成长的殖民地,因此区分生活从死细胞和量化活细胞没有的帮助染料或仪器。过程开始于液体浮游文化或成熟生物膜悬浮和均相液体介质通过刮、涡流或用。镀方法包括无菌去除悬浮生物膜的整除,其次是连续稀释和镀上营养琼脂。孵化完成后(通常是24 - 72小时),菌落数在盘子,和细胞的数量每毫升(cfu /毫升)在原始文化使用平均菌落数计算,文化的卷镀,稀释系数从悬浮生物膜板。如果生物膜量小,可以收集从96孔培养板,细胞的数量可能不足以确定显著差异在殖民地使用这种方法。为了增加菌落计数细胞的数量,每个样本的生物膜可以暂停到一个指定的无菌液体培养基和成长在一个合适的温度(例如,37°C 180 rpm)。重要的是要注意培养时间和保持统一,扩大相同数量的每种文化。建议有一个实验控制,不接受任何治疗进行文化扩张时为最后一个枚举将是相对的,也可能受益于正常化最后计数。当处理一个混合文化,最好注意细菌复制以不同的速率。 Therefore, the culture expansion may not be appropriate as it will disrupt the ratio of cells from the original biofilm. Furthermore, the consideration to the colony forming incubation time may need to be extended to accommodate for slow colony forming bacteria [20.]。枚举是一个特别有用的量化方法在纯文化作为光密度(OD)可以测量镀前获得校准曲线用于关联手机号和吸光度。从而在以后的实验中,样品的吸光度未知的细胞数量可以测量来确定细胞浓度(22,23]。
CFU技术通常不需要高度专业化的和先进的设备,可以在大多数实验室执行情况由训练有素的个人。获得一致的结果需要一些实践与电镀和媒体准备。选择这种方法的一个重要的考虑因素是,只有活细胞,能够形成一个殖民地,将计算。然而,这种技术可能不是最好在所有情况下,因为它是时间和劳动密集型的,有时需要天执行足够的复制(获得可重复的结果24]。此外,由于生物膜需要暂停,错误可能发生由于细菌聚集,如果使用抗菌素治疗,会发生延滞。这种技术也容易计算错误和用户偏好,尤其是当给定数量的殖民地和/或高计数是手工完成的,但是这个错误可以减轻通过使用手动菌落计数器(比如ImageJ)。
特定细胞计数
更自动化的方式计数细胞的方法是一对细胞液体培养流过狭窄的孔径和测量通过。库尔特计数和流式细胞术需要均质生物膜和悬浮在液体培养。虽然库尔特计数器是便宜,流式细胞仪在测量细胞潜在收益的更多信息。
库尔特的方法包括电解质溶液中带电粒子穿过一个孔,是电路的一部分25,26]。粒子的存在改变了电路的阻抗,并注册为电压的变化。电压的变化是与粒子大小,使技术区分单个细菌细胞。电压脉冲然后计算在一段时间内,与细胞的数量。这个方法需要一个库尔特计数器仪器,往往花费数千美元。这种技术很简单,但不幸的是不能区分死细胞和生活。
另一个流计算方法利用流式细胞分析仪(16,27]。在这种技术中,细胞通过狭小通道流动,使他们通过单一文件。激光是用来检测细胞通过散射时,吸光度或内在和外在荧光测量。流式细胞术的主要优点是速度、简单性和精度与测量。大量的关于细胞的附加信息,包括细胞尺寸以及表面性质、代谢活性和细胞的分化状态,使用这种方法可能同时聚集与其他细胞染色或内源性荧光标记(如GFP) (28]。这种方法的主要缺点是相当大的初始费用在许多实验室仪器不常见和典型的成本在50000 - 100000美元之间。同样重要的是要注意,并非所有流血细胞计数器记录体积,但关注的事件,因此不是所有的工具都能产生细胞计数单位体积。
光和荧光显微镜
细胞计数和生物膜3 d特征可以通过使用几种显微镜方法从简单的光学显微镜的悬浮生物膜附着生物膜的体积和形态学测量使用共焦激光扫描显微镜(样品形貌)。在本节中,我们将描述的各种方法量化生物膜,生物膜总额从细胞计数,使用显微镜。此外,我们有一个简短的指南的常用工具介绍荧光样品进行分析。
复合光和荧光显微镜
结构,如细菌细胞小,可以可视化的复合光学显微镜。解决典型的细菌细胞,2 - 8μm的长度,需要总放大200倍或更高。对比度增强方法,如微分干涉相衬或对比(DIC)可以提高全面质量的图像,使细胞更加明显。复合光学显微镜的成本范围从几百到几万美元。荧光显微镜光学显微镜的光学功能扩展到内在或添加荧光发射,大大扩展了可以从这种方法收集信息29日]。荧光显微镜配有高强度灯激发荧光分子,和荧光过滤器允许特定波段的激发和发射光到达样品和观察者,分别。传统荧光显微镜的成本是在数万到数十万美元取决于模型的复杂性和额外的功能,如连接照相机和荧光过滤器,在可用的基础模型。荧光染色和耗材的成本在数十到数百美元的范围。
细胞计数使用显微镜可能做的非常不成熟生物膜在地方或均质/悬浮生物膜室数下滑。这可能是用无污点的细胞或细胞染色,光学显微镜和荧光显微镜。铜绿假单胞菌生物膜沾的图像水晶紫色在不同孵化*所示图1。与未成熟生物膜(图1),单个细胞可以区分和计算。这很费时间,需要许多图像的再现性和用户与colony-counting偏见如前所述。此外,在成熟的生物膜(图1)形成三维结构使得计算通过成像更加复杂和困难。
图1:生物膜的光学显微镜。显微镜的图像铜绿假单胞菌(PA01)生物膜生长。光学显微镜图像显示PA01生物膜增长的形态与完整的细胞培养板工厂媒体与结晶紫染色1 (a), 3 (B)、6 (C)和24 (D)小时后播种在静态文化。虽然光学显微镜允许可视化生物膜的增长阶段已经限制计算能力随着影片的3 d结构开始形成在后期可以观察到这些图像。2016年威尔逊克里斯蒂娜·多恩大学未发表的图片。
过去一次生物膜生长的早期阶段,第三个维度,手动在光学显微镜下计数需要与Petroff-Hausser同质化和暂停计数室数下滑。这些专业显微镜玻片与精确定义样品体积和一个蚀刻二维网格在底部可以用来确定细胞密度(细胞/毫升)的悬浮生物膜(30.- - - - - -32]。均化/暂停后,细胞在每个网格可视化和手工计算部分。一般从几个网格数可以用来计算原始悬浮细胞的数量与已知的液体体积网格。这种技术可能的并发症是能动的潜力在测量细胞进入不同的网格部分。然而这很容易克服通过图像网格和计算的图像。这种技术可以通过非代表性样本及其固有的有限无法区分活细胞死亡。然而,使用各种代谢或选择性渗透污渍可以增加的可见性细胞和区分生活和死细胞,使计算更准确。这种技术很简单,容易实现,便宜的,因为它只需要一个光学显微镜、细胞培养实验室的标准仪器,Petroff-Hausser售价约800美元。
而且一旦形成了成熟的薄膜,分析生物膜总量和形态可以提供重要的信息关于生物膜结构和形态在不影响电影的物理结构。显微镜可以用于确定或估计生物膜的表面覆盖率和总额,包括胞外聚合物基体。例如,生物膜的总表面面积覆盖率可能决定(图1)。此外,通过校准显微镜焦高度,生物膜层的深度可能发现通过确定的高度最高的生物膜,生物膜的表面的高度连接(33,34]。使用荧光显微镜测量总生物膜的另一个例子所示图2,的形象PA14殖民拟南芥根是用来确定(图2)根的生物膜层的厚度。
图2:生物膜的荧光显微镜。生物膜的荧光图像。(一)合并阶段和荧光图像拟南芥根与EGFP表达PA14殖民。覆盖的荧光(绿色)和相衬(灰色)的图像答:芥根感染PA14显示。未发表的2014年猫多恩大学培养形象。(B)共焦显微镜图像的铜绿假单胞菌生物膜(PA14)。PA14增长体外流动条件下接种后2 ~ 6小时。可行的细胞坏死细胞是绿色的(EGFP)和红色(与propidium碘染色)。共焦允许监视x和y平面(中央面板)和z轴(底部和右面板)描述生物膜的增长。未发表的芭芭拉·克莱门特形象的亥姆霍兹传染病研究所Susanne Haussler实验室2014。
共焦激光扫描显微镜
共焦激光扫描显微镜(样品形貌)是一种特殊的显微镜,生产高分辨率、大幅的图片在三维空间中生物膜(35- - - - - -38]。3 d成像成为可能,因为共焦光学可以专注于一个很小的体积在样本排除光从其他位置。领域的重点是扫描整个样本产生高分辨率二维组装“片”在不同高度产生最终的三维图像(图2)。此外,共焦显微镜可以利用单个或多个多个荧光激发激光视图标记顺序或同时37]。共焦显微镜不同的成本取决于系统配置,但通常在成千上万的美元在启动。这些工具还需要经验丰富、训练有素的用户进行精确的测量和分析。此外,荧光染料与采购相关的成本以及共焦兼容的媒体和容器可以在数百美元的范围内。
荧光染料和蛋白质
虽然内在生物分子,如NADH和NAD (P) H或叶绿素荧光的特性可用于荧光显微镜,荧光染料和蛋白质通常用于引入荧光样品进行分析。荧光染料通常荧光分子,称为荧光团,或生物分子与荧光体,吸收和发射光的同时融入生物结构。发射光检测到的图像生成分析生物膜的特性,如空间细胞生存能力,形状和功能在整个增长/治疗期。另一个选择获取细胞荧光基因修改表达荧光蛋白的生物。而这些选项增加准备时间在方法级别(生产荧光细胞)或样品水平(生物膜染色),额外的信息往往有助于更好地理解生物膜内的细胞增长和生活(14,39]。在这里,我们介绍一些常用的荧光染料和蛋白质类生物膜的分析。
有许多商业上可用荧光染色用于任何应用程序,包括荧光显微镜,共焦显微镜和流血细胞计数。这些包括与生俱来的荧光分子,荧光体连接生物分子或分子荧光衍生品。污渍可用在各种发射颜色(红、绿、橙、紫),允许多个染料在单一的分析样本。污渍/在细胞内的定位取决于分子的化学结构或性质的荧光团。表1包括常用的染料的摘要信息关于细胞定位,染料是否表明可行性和参考的实验计划。例如,DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindole dilactate)是一种高度选择性染料核酸DNA附近将本地化而亲脂性的染料,如FM 4 - 64,仍在细胞膜。许多染料提供可行性的信息根据细胞膜渗透率等SYTO 9和Propidium碘(PI)都用荧光核酸的存在但π不是细胞膜的渗透性,和不会活细胞染色,而SYTO 9自由进入活细胞。不同标记活细胞的机制是细胞膜的钙黄绿素污渍渗透和nonfluorescent直到转化为细胞内的荧光衍生品通过acetoxymethyl酯水解的酯酶活细胞(40]。这种机制的优势,因为hydrolysis-dependent荧光允许钙黄绿素存在于细胞外液的生物膜不会引起干涉图像/量化过程不再需要额外的清洗步骤,提高准确性。
表1。汇总表的生物膜染色常用荧光染色。
| 的名字 | 细胞的位置 | 膜透性 | 生存(生活/死亡/) | 参考 |
|---|---|---|---|---|
| DAPI (4’, 6-Diamidino-2-phenylindole dilactate) | 核酸 | 是的 | 这两个 | [14] |
| 调频染料 | 细胞膜脂质 | 是的 | 这两个 | [170] |
| SYPRO Ruby生物膜基质染色 | 矩阵的蛋白质 | 没有 | 这两个 | [171] |
| Propidium碘化 | 核酸 | 没有 | 死 | [27171172] |
| SYTO | 核酸 | 是的 | 生活 | [27116172] |
| 钙黄绿素 | 细胞内的空间 | 是的 | 生活 | (140、172) |
的另一种方法诱导细胞荧光基因工程师外源DNA荧光基因的细菌导致生产产品。这通常是由一个质粒,外源DNA的一小部分,虽然外源DNA整合到细菌基因组基因表达可能是有用的跟踪(41]。绿色荧光蛋白(GFP)和变异等GFP的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)时产生的细胞,使细胞产生绿、排放在400年和600纳米之间,当兴奋到紫外线,350和450 nm之间健康的细胞条件(41,42]。由此产生的排放可以用来计数细胞和跟踪实时生物膜的积累(39]。生物膜表达GFP可以评估绿色单独或结合其他荧光染色,如π所示图2。在这些照片中,两个小时和6个小时后流细胞接种的铜绿假单胞菌(PA)生物膜包含EGFP因此活细胞呈现出绿色,π,文化传媒,积累死细胞中出现红色。基因改良可以染色相比有很多优势,包括相对稳定与光漂白和质粒上的能力通过女儿的文化从而维护修改成许多文化而污渍必须重新在每个实验。然而,鉴于向量和劳动力的成本与克隆细胞,创建生物大多是可取的,如果经常使用荧光分析。有很多优势GFP荧光生物膜的记者,因为它是一种方便的研究中,这似乎并不影响细胞生长和功能。现在可以使用各种颜色的荧光蛋白如青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)允许单独的标记细胞共培养或多个标记一个细胞(42,43]。生物膜与GFP可以可视化体外细胞如流(图2)或原位如拟南芥根的PA(图2)。可能的缺点很多,但并不是所有的荧光染料和蛋白质是细胞过程潜在的干扰导致毒性或细胞的变化可能限制特征的类型。客户服务供应商和先前的文献可以提供有用的咨询了解染料是否适合所需的数据收集,并将允许使用后不受阻碍增长。
显微镜的优点和缺点
一般来说,显微镜迷人的图片生产的优势,可以直接使用在出版物或量化使用成像软件。图像通常改善可读性的出版物和让读者解释观察显微镜工作者。显微镜的主要优势是能够定量分析生物膜不需要收集和再悬浮从而使自然结构维护(35,36,44]。染料和荧光可以增加信息的使用对空间和时间获得细胞生存和功能而不破坏生物膜虽然引入荧光也增加准备时间在方法级别(生产荧光细胞)或样品水平(生物膜染色)14,39]。图像选择受到偏见,不幸的是,虽然可以采取措施缓解这一事实。随机选择的图像或图像位置的一致选择多个样本之间是两个常用的技术。此外,为了获得统计学意义的分析,一个大型图书馆的图片需要耗费时间。的荧光图像,必须注意在实验计划确保细胞成像一致。一个必须避免荧光团淬火或照片漂白,结果从化学和曝光导致减少或消除荧光团的荧光,这可能导致非代表性的结果。如果数据收集包括量化的荧光强度,也必须小心,以确保所有设置统一整个图书馆的图像。收集和分析图像与图像分析软件,如开源ImageJ,是一种常用的定性和定量表征方法(45,46]。
间接的量化方法
生物膜的生长通常可以确定间接推断生物膜量的使用代理标记。这些标记的例子包括干燥质量,总蛋白质含量,DNA, RNA,多糖或代谢物。所有涉及间接量化方法的基本假设量化的物质或财产的数量相关细胞,或者蛋白质/ DNA的数量/质量从细胞到细胞是一致的。这个假设已经验证了生物膜使这些方法非常有用47]。最佳实践是验证间接方法用直接的方法,因为他们只是代理基于代谢功能和生物分子的量化生产,可以依赖于生物体,培养条件和年龄。
干燥的质量
干燥质量,通常表示为单位面积上的质量,或生物膜密度是一个广泛使用的标记,会导致量化快速增长。发现干质量,生长基质的生物膜是放置在烤箱在一个恒定的温度,直到水被移除,达到恒重(48,49]。另外,如果衬底热敏感,表面的生物膜可以刮,悬浮在生理盐水,用冷乙醇沉淀,沉淀收集进行分析(17]。干燥温度依赖研究员偏好和底物耐热性。例如,尽管一些研究人员使用60°C他人已经使用100 - 105°C,同时温度与各自的干燥时间达到完全干燥的样品,但选择基于偏好基于特定方面的实验研究员手(47,48]。的主要目的是利用一个恒定的温度和相应的时间和最小的干扰达到完全干燥样品的生物膜或衬底。干燥后,样品重量,生物质是刮底物和基质是重的。干重重量的区别是生物质在基质和基质之间没有生物。干重是归一化湿生物膜的增长领域的计算单位面积生物量的电影或湿为生物膜密度[生物膜卷48,49]。
干燥质量测量的缺点是不区分细胞群和细胞外基质等不同的膜组件。使用这种方法也依赖于生长基质必须耐热的干燥温度或容易与生物膜分离不包括在生物量的计算。该方法的另一个缺点是样本不能用于任何其他干燥后表征方法。该方法的主要优点是相对容易和成本效益,因为它需要相对“低技术”实验室设备,如干燥箱和平衡,这是标准的实验室设备。
总有机碳
总有机碳(TOC)是一种间接测量的样品中碳与有机化合物或碳化合物来源于生物(蛋白质、脂质、尿素等)。这是反对元素碳(EC),如石墨、煤炭、和无机碳(IC),组成的简单的化合物,包括简单的碳氧化物(CO和有限公司2)、碳酸盐、碳化物和氰化物。这三种碳源的差异可以区分条件所需退化成有限公司2不同的碳化合物(50,51]。TOC测量通常用于确定环境测试仪器清洁的水质和制药行业,以及量化积累形成的生物膜(52- - - - - -54]。
TOC量化执行的生物膜通常是作为一个两步的过程中总碳(TC)和集成电路测量和用于确定TOC (55,56]。生物膜分解,集成电路转换成有限公司2,通常是通过加热酸化和红外光谱探测到。接下来,所有样品中碳转化成有限公司2,通常是通过加热氧化,TC是测量。TOC然后推断这两个值之间的差别(TOC = TC - IC) [55]。样品制备的方法和量化确定使用海洋国际碳分析仪等仪器,德国耶拿分析仪器公司2100年代多N / C,或UIC CM5012合并模型有限公司2电量计。不过,最后计算TOC是普遍的,而不是依赖仪器(54- - - - - -56]。因此,主要费用和该方法的缺点是专门的TOC专用仪器的成本,售价约$ 20 k。另一个缺点是缺乏特异性的碳含量在TOC量化措施整个包括细菌和生物膜胞外聚合物(EPS)的物质。评估协议存在区分碳从细胞和从每股收益从而减轻这个缺点55]。
虽然TOC提供了一个量化标志的生物膜量呈现这个值必须使用直接关联分析方法(cfu、细胞计数等)来生成一个method-independent价值。此外,它已被证明,碳的数量在给定体积的细胞是依赖细菌的健康状况(53]。因此,必须做出额外的相关性在每一组的情况下,和一个新的标准化协议,执行或控制,执行每一次实验。
结晶紫测定
革兰氏染色法是一种最常用和优化方法在微生物鉴定和可视化的细菌(57]。革兰氏染色法的主要组件和常用染料结晶紫,一个基本的trianiline染料细胞膜渗透在革兰氏阳性和阴性细胞(58]。传统上,在革兰氏染色过程中,媒染剂,通常一个iodine-iodide混合,添加复合物结晶紫的细胞内细胞质。这个复杂的膜防渗在革兰氏阳性细胞,由于更大的细胞的膜厚度的复杂,但突破革兰氏阴性细胞的薄膜。这使得革兰氏阳性细胞紫色的颜色与乙醇溶液de-colorization后允许区分革兰氏阳性和阴性细菌通过显微镜(58]。然而,如果克类型之间的区别并不是目标,媒染剂可以省略,革兰氏阳性和阴性细胞将结晶紫染料将自由从细胞在de-decolorization一步通过光谱学使结晶紫的量化。这个量化已经被证明非常有用的细胞生物膜的增长估计(23,59- - - - - -61年]。
的示意图图3解释了一个基本的生物膜积累试验执行multi-welled板。媒体和浮游细胞增长从盘子和洗去离子的水(DI)只留下附着生物膜(图3)。1%的溶液结晶紫在去离子水添加和生物膜染料在室温孵育一段时间,通常5到30分钟。孵化后,染料溶液被移除,生物膜与去离子水洗几次删除免费的染料(图3)。脱色的解决方案可以被添加,体积大于或等于原始培养基体积,与生物膜孵化10 - 30分钟。脱色的解决方案通常包括90 - 95%的乙醇溶液,但其他脱色解决方案如纯乙醇和丙酮或乙醇或乙酸也可以用作目标是溶解的简历(23,61年,62年]。最后,简历中脱色溶液转移到一个干净的96板用适当的空格的脱色溶液为吸光度评估在530 - 600海里,根据仪器的滤波器可用性、多井板紫外可见光谱仪(23,60,61年]。
图3:示意图结晶紫在生物膜上测定微量滴定板。结晶紫的示意图PA01生物膜上测定微量滴定板在接种后5小时。生物膜形成用肉眼是很难区分然而简历(A)是一种非特定的染料与细菌colocalizes (B)使其可见。特别是密集地区的生物膜形成的外边缘好板,媒体,和空气相交。这可以被薄暗紫色戒指(侧板视图)。吸收的结晶紫细菌生物膜的细胞的数量成正比。因此,当从96年由乙醇和生物膜转移到一个干净的盘子(C)可以被量化的紫外可见板读者(D)。未出版的数据获得的克里斯蒂娜·威尔逊2016年多恩大学。
而结晶紫微量滴定板试验包括几个步骤,它比较容易执行,可再生的,并允许研究人员迅速同时分析多个样品。它是相对便宜的,因为它不需要购买专用设备,染料是廉价的保质期年如果免受污染。此外,结晶紫测定可以修改为生物膜生长在各种各样的反应堆。图4展示了一个示意性的测量光密度(OD)的加班时间数据增长的铜绿假单胞菌(PA)生物膜在疾病控制中心(CDC)反应堆的指数增长阶段(“日志”)。这个试验的主要缺点是特异性的性质,因为它并不区分死细胞和生活。这个试验的另一个缺点是许多变量(孵化,孵化温度、脱色污点,等等)可以批量变化引入到分析结果(62年]。然而,采用标准化的就业协议在文学和规范化的控制可以消除方法的变化。
图4:Schmatic结晶紫测定生物膜的疾病预防控制中心反应堆。结晶紫(CV)测定PA01生物膜在疾控中心反应堆。(A)示意图分析重复在每个时间点的生长曲线的发展。首先,生物膜生长在CDC反应堆优惠券。删除后,生物膜是附着在细菌表面处理简历,直到用乙醇洗净。吸光度(光密度)乙醇洗以600海里的生物膜增长的代理。未发表的图像获得的克里斯蒂娜·威尔逊和海伦娜Valquier-Flynn 2016多恩大学。(B)光密度(OD) -时间数据的增长PA01在玻璃表面的生物膜细胞培养。指数增长的细胞(“日志”)阶段。OD测量的不确定性是小于或等于圆的大小。 The solid line is a fit to an exponential function. The inset shows the same data and fit using a semi-log plot demonstrating how the exponential growth curve becomes linear when the log of optical density is plotted against time. The Pseudomonas aeruginosa (PA) biofilm was grown in 0.25% glucose (GL) and minimal media (MM). Unpublished data obtained by Chris Wentworth and Jeniffer Caballero at Doane University 2015.
四唑盐
四唑盐是使用最广泛的工具之一在生物监测的新陈代谢在体外(63年]。各种各样的盐,总结表2,成功地用于生物膜评价开发允许量化和可视化的细胞生存能力和代谢通过紫外吸收和荧光光谱。而减少的确切机制仍在审查和不同生物体和盐类型,整体以以下方式可以广义的概念。
表2。汇总表的常用的四唑盐与水溶性生物膜体外研究和检测波长。
| 的名字 | 水溶度 | 检测波长(nm) |
|---|---|---|
| 麻省理工 2 - (4 5-dimethyl-2-thiazolyl) 3, 5-diphenyl-2H-tetrazolium溴离子 |
不溶性 | 前言:550 - 570 |
| CTC 5-Cyano-2,新型双- (p-tolyl)四唑氯 |
不溶性 | 例:540 新兴市场:630 |
| INT (2)- 4-iodophenyl 3 - (4-nitrophenyl) 5-phenyl-2h-tetrazolium氯 |
不溶性 | Abs: 470 |
| TTC 2、3、氯化作用 |
可溶性 | Abs: 480 |
| XTT(2,3 -二- (2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl) 2 h-tetrazolium-5-carboxanilide) | 可溶性 | Abs: 490 |
选择的四唑盐稀释成生理相关的解决方案,如媒体或生理盐水,生物膜可以孵化温度或室温1 - 3小时文化。在此期间无色盐是减少细胞代数余子式和酶从细胞新陈代谢,表明细胞生存能力成正比,在相应的甲瓒分子由视觉检测荧光光谱仪或显微镜(63年,64年]。减少会导致水溶性或水不溶性甲瓒口述的最终检查和分析步骤。水溶性甲瓒溶解治疗缓冲区,因此可以通过光谱分析[立即检测到21,31日,65年- - - - - -67年]。这些通常是用于实时评估细胞的生存能力和新陈代谢。水不溶性甲瓒结晶,成为被困在还原过程中细胞内的膜。因此,晶体可以通过流式细胞仪和显微镜,评估在每个细胞的基础上,在细胞或溶解在溶剂中,如DMSO溶液或盐酸酒精同0.1 N,整体量化(68年- - - - - -70年]。图5演示了PA01生物膜生长的可视化滴流动反应器沾染了不溶性甲瓒CTC使用荧光显微镜。甲瓒晶体具有荧光特性允许能见度与荧光显微镜所示图5。
图5:图像的生物膜沾四唑盐。代表图像的生物膜生长可视化与不溶性甲瓒来自四唑盐,CTC。增长载玻片上形成的生物膜(一)肉眼可见生物膜形成后48小时增长滴流生物膜反应器和CTC(红色)和DAPI染色(黄色)。生物膜可以与荧光显微镜进一步观察定性描述生物膜形状和量化区域覆盖的载玻片(B)低倍镜下和生存能力量化CTC衍生荧光甲瓒只有染色活细胞(C)和DAPI染色细胞(D)高倍镜下。C和D = 200μm规模酒吧。未发表的图片得到茉莉花桑多瓦尔市2016多恩大学。
ATP生物荧光
ATP生物荧光测试是一个完善的微生物测试在食品和生物医学社区存在微生物污染的表面(71年,72年]。三磷酸腺苷(ATP)是一种核苷三磷酸作为所有生物的主要能量来源,从而生存能力的主要标志。生物发光是指生物体转化为化学能的过程。最常见的ATP生物荧光测定采用酶荧光素酶,负责光生产的萤火虫。ATP浓度较低荧光素酶反应产生光的ATP含量线性相关的出现在解决方案(73年]。因此,可以用来推断生物膜的光量可行性和生物量71年,73年]。两个步骤的基本反应所得;第一个被络合的荧光素酶、荧光素和ATP创建luciferyl腺苷酸复杂。第二步是氧化luciferyl腺苷酸与氧气进入“氧化荧光素”的有机物导致光子的发射检测到大约550到570海里(71年,74年]。
生物荧光的协议量化是相对简单的,可以进行暂停或附加细胞。首先,文化传媒和生物膜是用水洗或删除缓冲区删除细胞外ATP。其次,生物膜悬浮细胞细胞溶解释放细胞内ATP luciferin-luciferase可用。在第三步中,细胞内ATP释放增加,反之亦然,反应试剂的荧光素,荧光素酶,镁离子,缓冲pH值维护等在luminometer-appropriate试管或多井板。发光复杂的半衰期约为30分钟。因此,发出的光线应该尽快被发现后的生物样本/试剂(23]。最佳实践是量化的辐射光在有限的时间内每10 - 30秒,这样可以平均读数ATP估计。这相比,平均一个ATP标准量化由同一协议在同一条件ATP的数量添加到步骤3。概述的过程是stepby -步骤序列的测定。然而,商用工具可以购买包括一个优化的比例溶解洗涤剂、荧光素酶、荧光素、缓冲区,和离子作为冻干粉出售只要求去离子水的加入降低了协议的一个生物样品试剂,孵化和量化的辐射光通过光度计(75年,76年]。
这个试验非常可靠,可以迅速执行,只有需要光度计进行分析。基本光度计,一次读一个试管,花费大约1000美元,而高技术仪器能够阅读的96孔板和/或自动试剂,可以花费10 k美元或更多。分析是高度准确的ATP水平较低。然而,许多变量,如ATP提取差,波动的温度和pH值,荧光素荧光素酶比不足会导致数据方差。因此,它通常是建议装备而不是自制试剂用于测定(74年,77年]。商业分析花费几百美元,包括试剂和标准,可用于执行200 - 1000化验。除了成本相对较高的化验仪器,这种方法有不同的限制,必须定期校准仪器确认精度(23]。
另外,一些研究人员努力使生物膜一个无损生物荧光试验观察随着时间的推移,高通量筛选或针对特定的细菌在不同的生物膜(78年,79年]。此方法需要的生产重组细菌,通过介绍绿色荧光蛋白的质粒与前面讨论的修改、内源性荧光素酶的生产和通过光度计[发光量化78年- - - - - -81年]。如果ATP生物荧光检测常用于高通量实验中,创建一个重组的成本和精力细菌可能是必要的。否则,前面概述了一般商用试验是充分的使用。
血清总蛋白测定
一个被广泛接受的代理总生物膜增长总蛋白质含量。假设细胞间蛋白质含量大约是类似的,发现了蛋白质含量与湿地生物膜的细胞生物膜的微观(54]。然而,变化的蛋白质生产跨物种、年龄和文化条件可能导致偏离与手机号直接关联这一个方法结合使用严格的实验控制和验证更直接的量化方法82年,83年]。评估,生物膜除去他们的衬底和均质液体悬浮。细胞细胞溶解的方式与使用的蛋白质测定方法一致。例如,一些协议需要孵化的强碱55°C或解决方案与洗涤剂和蛋白质沉淀三氯乙酸(TCA)。这个裂解缓冲应该蛋白酶自由存在的蛋白酶,酶分解蛋白质,会降低样品的质量。裂解后,蛋白质含量可以通过测量所引起的变色dye-protein交互通过紫外可见光谱仪。吸光度的变化颜色的物种在一个特定的波长,依赖dye-protein互动产品,Beers-Lambert蛋白质的浓度成正比的法律。
有许多建立总蛋白质含量测定的方法。其中最常用的是布拉德福德,洛瑞,bicinchoninic酸(BCA)方法。布拉德福德的方法很简单,组成的一个已知的蛋白质样品酸性布拉德福德试剂包含考马斯亮蓝g - 250染料(84年]。细胞溶解样品或标准蛋白质添加到布拉德福德试剂和短时间内孵化,即。,10 - 30分钟,在室温或37°C(减少所需的反应时间)。孵化期间,蛋白质与染料结合导致光谱从布朗(吸光度约465海里)蓝色(最佳吸光度大约595海里)85年,86年]。蛋白质绑定依赖的存在带正电氨基酸在蛋白质结构相互作用的净负电荷通过范德瓦耳斯染料,离子和疏水相互作用87年]。因此,吸光度的变化在595纳米测量并转换为通过组织总蛋白浓度标准曲线。第二个常见的方法是酚试剂法测定。最初的洛瑞蛋白质测定,或其更现代的修改,是基于氧化还原化学在两个步骤88年- - - - - -91年]。首先,蛋白质样本与硫酸铜反应和酒石酸一百一十分钟在室温下培养时间形成四配位基的铜复杂的四肽债券和一个铜原子。在第二步中,添加一个Folin酚试剂,淡蓝色的四配位基的铜复杂加剧了电子的转移的磷钼/磷钨酸复杂Folin孵化期间酚试剂在室温下30分钟或更大,和最终的颜色吸收最佳约750海里。确切的机制已经被调查,但迄今尚未完全阐明。蛋白质暂停缓冲是一个关键考虑洗涤剂,因为洛瑞分析敏感钾离子,大多数表面活性剂,螯合剂(即。,Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA), some sugars routinely present in culture media and reducing agents interfere with the assay and can result in erroneous color changes [84年]。第三个常用的蛋白质定量方法是BCA化验。BCA蛋白质测定的化学机制非常类似于洛瑞分析利用铜离子的减少导致蛋白质谱的转变。然而,洛瑞的Folin试剂方法取代bicinchoninic酸(BCA),可以在一个步骤,而不是执行两(54,92年]。蛋白质样本和BCA设备试剂,包含BCA碳酸盐缓冲试剂和硫酸铜溶液,在室温下是孵化30分钟和562海里的吸光度进行优化分析。BCA蛋白质测定的主要优势是兼容大多数表面活性剂使其适合使用最常见的细胞裂解试剂虽然仍容易受到螯合剂。BCA试验被广泛使用,方法简单,因为它通常是指出在文学是由“制造商的指示”,通常包括试剂A和B的结合和附加的样本稀释溶解缓冲带内的样本浓度标准曲线(93年,94年]。除了这些传统的方法,各种各样的其他比色和荧光蛋白分析描述,包括专业化验组氨酸标签、抗体等,许多商用作为分析工具(95年- - - - - -97年]。
蛋白质量化是一个快速,常见的分析使生物膜增长的相对评估。分析工具通常花费100 - 300美元根据包的大小。这些通常包括化验试剂对100 - 1000年的样本,在1 - 2000 ul蛋白质每毫升样品根据所选择的敏感性试验,和瓶BSA的标准。当分析非常少量的蛋白质是明智的运行标准,通常BSA,每板或化验组由于缺乏系统性吸量的变化(即。,poor/inexperienced technique), variations in room temperature or incubation time, etc. Although several of the kits are sensitive to numerous interfering agents, it is possible to plan lysis buffers and choose kits to avoid any interference. In the case that interference is unavoidable, minor cases can be accounted for by running a background blank of just the suspension buffer. Otherwise, samples can be treated via gel filtration, dialysis or protein precipitation to remove interfering substances [54,90年,95年]。这种分析的主要不满是区分细胞和细胞外蛋白质的能力在跨物种生物膜比较可能会导致错误和治疗减少EPS蛋白质而不伤害细胞。这可以避免通过细胞的方法提取的细胞外蛋白质从细胞中移除,或利用蛋白量化与细胞生存能力分析可能是明智的。
石英晶体微量天平
石英晶体微量天平(药物)允许的无损测量生物膜的积累作为时间的函数(98年]。仪器由一个小圆盘砹(AT)降低单晶石英(图6),这是一个推动的压电材料在共振频率应用振动盘的电位差。圆盘可能涂层,例如,通过黄金(Au)或氧化硅(二氧化硅),和作为生长基质。这个圆盘驻留在生物反应器的流动通道,这样在磁盘表面形成生物膜。系统的共振频率是一个函数的质量,所以微克改变质量比例谐振频率的变化,从而使生物膜测量积累是形成(99年]。Tam等人说明了有效使用药物技术的展示环境条件的影响和遗传操作对变异链球菌生物膜的增长速度One hundred.]。在这项研究中,一个湿膜的质量和药物之间的直接相关性,显示频移给定量测量药物质量的设备。
图6:石英晶体微量天平生物膜反应器。与附加的openQCM©试验箱流入和流出管媒体。的照片(A), (B)前视图和(C)内流室包括石英晶体和持有人openQCM©测试室。室包含所需的电子产品的基础。(D)卡通生物膜的流动单元配置将存款的水晶生物膜量化[100]。
关于粘弹性性质的附加信息时可以获得应用潜力是关闭的指数衰减振荡可以监控。这种类型的测量称为石英晶体微量天平与耗散监测(QCM-D)。耗散因子以这种技术敏感的表面质量密度电影和电影的机械耦合到晶体表面和周围介质(101年]。QCM-D允许动态测量在液体环境中,是一种非破坏性技术。因此,生物膜质量的依赖和形成动力学环境条件,如pH值或添加剂的浓度,可以被认为是(102年- - - - - -106年]。QCM-D需要模型解释数据和估计膜厚度,剪切应力和生物膜的粘度101年,107年- - - - - -109年]。这些参数是特别感兴趣的机械的努力去除生物膜。QCM-D仍然是一个未得到充分利用的技术,生物膜特征主要是物理学家和工程师使用的但是微生物学家并没有广泛地探索这个选项是一个跨学科的方法。
这种技术的主要优点是质量监控积累实时ng / cm2精度不牺牲的示例帮助更好地理解生物膜的附件和允许有多个分析技术的调查,比如量化分析可行性和基因/蛋白表达,在单个样本。这种方法的主要缺点是成本的专业设备、电子产品、软件和耗材的范围可以从一个简单的、单通道设备,如可以通过openQCM©,以600美元的价格完全自动化,高通量设备从Q-Sense数千美元。图6显示了一个示例的openQCM©药物晶体的设备安装在一个小流室。电子产品是基于微观Arduino单片机板。所有的硬件和软件都是开源的,所以他们可以很容易地适应用户的需求。该系统的另一个缺点是,共振频率对温度和压力的变化高度敏感的维护或占这些变量的波动在数据收集重要。
替代定量表征方法
文学账户显示,生物膜也可以使用DNA分析,核糖核酸和多糖量化91年,110年- - - - - -117年]。虽然这些经常被用作直接技术假设每个单元将有相似的DNA、RNA和多糖每细胞数量,建议提供这些量化和更直接的方法,如CFU或细胞计数的每股收益矩阵包含DNA, RNA和多糖成分从之前细胞溶解细胞给这些技术类似的不满与无法辨别细胞总蛋白从EPS组件12]。此外,特定的RNA和多糖的表达量指出改变了生物体或生长环境(118年,119年]。因此,文学优先级量化这些化合物的特殊有机体是高度建议。
荧光光谱是一种研究但不常使用的间接的量化方法。该方法假定相似的荧光发射强度是每个细胞渗出的体液激发,因此利用强度作为一个代理手机号,可以量化值进行悬浮生物膜(120年]。这个方法可以利用自体荧光的代谢分子(NAD / NADH、时尚,色氨酸,等等),和细胞转染产生荧光蛋白GFP正如前面讨论的,或者可以与荧光染色细胞染色(69年,120年- - - - - -122年]。蛋白质的代谢分子和荧光强度受到额外的-和胞内环境的影响。因此实验应该运行负控制,没有处理剂的样本具有相同培养条件(122年]。虽然没有一个量化的方法,可以使用二维荧光光谱无损,time-resolvable方法引起生物膜的生理状态的信息(122年]。这种方法需要一些专门的设备但是当结合其他技术可以提供信息物理生物膜和周围介质之间的相互作用。狼等人使用这种技术与人工神经网络相结合来研究原位生物膜的形成和分析生物膜增长对工艺参数(123年]。
放射性标记也被用来量化生物膜通过附加一个同位素的生物分子,如胸苷或葡萄糖,并通过显微镜观察,闪烁/伽马射线计数(124年- - - - - -126年]。专用设备和培训是必要的,因为过多的辐射暴露的潜在有害影响。
生物膜特性的定量方法与定性方法常常陪伴和协助下表示成像等生理生物膜表面,表面粗糙度的结构评价、形态、空间组织和与环境相互作用的生物膜。之前我们已经讨论了光和荧光显微镜方法越来越多地用于定量和表面结构分析由于易用性和想象生活生物膜的能力。在本节中,我们描述了扫描电子显微镜(SEM),因为它是最常用的方法,通过高分辨率成像结构分析。
扫描电子显微镜
SEM可以用来开发一个高分辨率、放大图像的表面形貌。整体放大的范围可以从大约10 - 500000倍,使这种技术无价的微观结构的分析,其中包括生物膜(19,127年]。SEM允许收集评价高分辨率图像有用的细菌相互作用,EPS组织和生物膜的形态,有助于更好的理解形成和持久性(128年- - - - - -130年]。
SEM运作方式类似于普通荧光显微镜。然而,而不是使用一束光子样品观察,SEM利用集中的电子束。通过一系列电磁透镜后,电子束发生罢工的样本和两个主要场景:电子(1)吸收的表面分子激发表面分子,导致较低的能量,二次电子喷射或(2)分散的表面,即。,能量高,背散射电子。前者是由二次电子传感器和转换成数字图像,在概念上类似光子荧光显微镜检测。由于低能量的二次电子,这些图像往往只显示样品的表面(19,127年,131年]。
扫描电镜成像技术可分为两大类根据检测到电子的起源:二次电子或背散射电子。而二次电子分析是主要的SEM成像技术,大多数SEM仪器能够读背散射电子。背散射电子是由高能电子的入射电子束表面散射。这些背散射电子可以用来生成一个低分辨率图像显示位置的化学变化的频率尺度散射事件探测原子的原子量从而测量化学成分的差异。
电子显微镜的一个优点是容易获得的串联光谱技术定量元素分析。能量色散x射线能谱(EDX)生成一个光谱,表明表面元素组成比例的样品通过检测x射线原子发出时,事件导致表面原子失去一个电子核壳电子,二次电子,原子处于兴奋状态。随后表面原子回到基态,在x射线的形式释放能量,然后检测。
SEM分析的一个主要缺点是,它无法进行生活样本,测试是在高真空下,和广泛的生物样品分析前准备是必需的。样品制备包括固定,去除水分,和涂层样品薄层的导电金属。固定样本通常是通过一个醛的解决方案来实现,共价债券蛋白质保护二级和三级蛋白质结构(132年]。样品然后通过一系列梯度酒精脱水治疗。样品的水分会干扰的能力SEM达到足够的真空条件下总脱水的样本是非常重要的最佳分辨率的成像。由于生物膜是由大约97%的水,脱水成像会导致不可避免的扭曲样本的规模和结构(133年,134年]。最后,样品也必须有利于允许耗散的静电荷会导致构件或结构,阻碍图像。这通常是通过溅射涂层与金属,如金、铂、需要购买额外的设备和化学品。另外,生物样本可以用锇、浸渍通过osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO)染色法结合重金属盐脂质膜有效地消除标本充电(135年- - - - - -137年]。一个拥有巨大潜力的新兴技术显著减少生物样品制备时间是离子液体的使用。这些熔盐在室温下保持液体抗蒸发,即使在高真空下,并提供导电涂层不需要样本固定和干燥。此外,他们已经成功地用于多种生物样品包括生物膜(133年,138年]。
样品制备的克服困难,环境扫描电子显微镜(整体)的方法可以将未经处理的样品成像不需要完整的脱水或真空(129年,139年,140年]。整体使用SEM图像生成技术(即。,background scattering, secondary electron, transmission, etc.). However, the technique has limitations due to the distance the electron beam travels through gas molecules which compromises resolution. Furthermore, although the samples can remain wet it is still not advisable to use viable samples because the electron beam can harm the sample. Finally, the most notable disadvantage of ESEM is that the instrument is still in development, and a commercial version is not available for purchase yet. Therefore, use of this technique is done by modifying currently available SEMs requiring researchers to frequently shift between modes or the designation of an instrument for ESEM.
尽管使用扫描电镜的一些缺点,这种技术非常有利的高分辨率表面图像可以揭示生物膜结构和地形的细节无法比拟的许多其他显微技术(19,127年]。
选择定性描述的方法
生物膜表面的拓扑结构和化学性质可以评估使用扫描电化学显微镜(SECM) [141年,142年]。这种技术采用微电极,在微米范围内,在一个合适的氧化还原试剂扫描一个表面时,诱导氧化还原反应之间的潜在的应用技巧和表面143年]。这种通用的技术可以提供一个额外的层面,3 d模型基于分布的生物膜的活性组用于确定胞外聚合物(EPS)的物质成分是如何分布在生物膜表面。SECM需要专门的设备使得仪器的可用性和访问限制因素。
虽然不常利用目前,文学存在优先级和原子力显微镜(AFM)分析生物膜。AFM可以描述的组件在底层基础以及基础相互作用[144年]。AFM将有助于理解生物膜特征如粗糙度、地形、和刚度,但类似于其他技术,需要专门的设备花费超过100美元,训练有素的操作员。
光谱分析生物膜作用越来越认识到作为非破坏性方法更好地了解生物膜聚合、附着力和EPS组成。红外和拉曼光谱表征利用吸收(IR)和非弹性散射光(拉曼)来确定化学特征通过调查免费,原位分析。红外光谱学提供振动信息通过使用红外光线,而拉曼通常使用更有活力,通常由近红外、可见,或紫外激光器,提供类似的信息。生物膜是一个3 d结构,红外光谱和拉曼光谱spatial-chemical仅限于表面生物膜的变化从而更好地了解生物膜结构和细胞间的沟通。红外信号通常更强但产生明显恶化由于绝大水信号信噪比。拉曼信号弱而不受到水和可以用更便宜的探测器探测到。表面增强拉曼光谱(ser)利用金属表面的表面特性来增强微弱的拉曼信号的因素-108年106。虽然ser增强开辟了新的可能性的热生成功率的激光和金属表面的抗菌性实验生物膜研究的问题。尽管有一些困难,红外和拉曼是好方法结合使用,以共焦扫描光学显微镜(CSLM),或与专业红外兼容的表面(145年- - - - - -148年]。
小角x射线散射(粉煤灰)可用于研究EPS组件,结构和潜在的分子间相互作用。尽管传统上用于分析蛋白质晶体或暂停,使用x射线散射探测显示了使用粉煤灰承诺为研究标本内相互作用[149年- - - - - -151年]。尽管低估了由于“低分辨率”一枝是有很大潜力的,提供有价值的洞察生物结构和分子组成的生物膜(152年]。
表面等离子体共振成像(撒)和电化学表面等离子体共振(EC-SPR)新兴技术用于研究细菌生理和电化学活动实时无标签(153年,154年]。类似于光谱方法,这种分析方法存在需要专门的设备和衬底涂有导电材料通常黄金。
生物膜形成和毒性可以通过比色检测方法用刚果红琼脂法,微生物的培养在染料注入琼脂。这种方法的结果是殖民地的颜色变化可用于确定是否微生物生物膜生产(黑)(红色)。这个方法是常用的多糖丰富、粘液产生革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌(82年,155年]。
数学模型和计算机程序(COMSTAT ImageJ,等等)可以用来分析图像和加强在现有数据的新视角,可以利用描述性/预测模型和生物膜发展的量化。
ImageJ
ImageJ被应用到生物膜分析在实验室情况下自动计数等殖民地从图像156年]。这部分是因为程序的开放框架,它允许插件和宏为特定的应用程序编写和共享。这个系统的协同性质是什么让它如此有用的研究总的来说,和在生物膜分析(157年,158年]。
ImageJ,最初叫NIH的形象,是一个免费,开源,基于java的成像程序,可用于Windows, Mac或Linux操作系统。可以阅读许多图像格式(JPEG、TIFF、GIF、DITCOM合适,和BPM)和操纵,分析或处理的图像在很多不同的方式。例如,殖民地粒子与桌面扫描仪可以拍照或扫描和细菌集群可以自动统计。图7演示了一个典型的例子在我们实验室获得显示ImageJ如何实现蚁群粒子计数。
图7:图像J量化生物膜的细菌菌落(a)生物膜的示意图收集从载玻片上滴流动反应器悬浮在媒体和镀菌落计数。(B)与细菌菌落琼脂板的照片。与ImageJ照片进行了分析,以便殖民地是黑色的,背景是白色的为了达到最大的对比背景和殖民地(左)。在这种情况下,程序确定一个殖民地的平均大小是108.16像素。最大的单一的殖民地是135像素。如果集群除以平均大小的殖民地,91年殖民地。ImageJ成立,殖民地是黑色,背景是灰色的为了实现最小反射率和背景之间的一致性和殖民地(右)。在这种情况下,如果殖民地集群除以平均大小的殖民地,93年殖民地。
也许ImageJ在生物膜研究的最有用的功能是能够生成图像栈。堆积不仅允许图像有不同的荧光染色覆盖,但是可以创建三维图像(z栈)从技术,如共焦显微镜使用数据。这些三维图像不仅能够揭示生物膜结构的细节,但可以结合荧光染色技术来显示不同的细菌的分布,蛋白质,或整个生物膜内离子浓度159年,160年]。
数学模型来量化生物膜的积累
生物膜系统的数学模型允许我们前面所讨论的许多测量技术的信息合并到一个连贯和统一的画面。信息的形式和功能的微生物膜可以定量相关生化生长动力学参数等因素和物理因素,如运输机制,剪切力和粘弹性性质的电影161年]。
生物膜是非常复杂的,由于各种形式的附件,超然,成长,和运输营养物质从表面到最深的层次,以及inter-bacterial当生物膜积累力量。因此,生物膜结构的治疗需要使用生物膜的数学模型积累和活动,所以生物膜结构之间的关系,生物膜的速度积累、生物膜可以量化和微生物活动在同一个框架(162年]。已经完成了大量的工作使用计算机程序(COMSTAT)计算bio-volume,面积覆盖,生物膜厚度分布,是生物膜的厚度、体积小菌落,分形维数,粗糙度系数、平均和最大距离,从生物膜图像的三维堆栈和表面体积比39,116年,163年,164年]。
机械的数学模型与计算系统生物学增强基本的了解生物系统与复杂的物理参数,如生物膜(55,165年]。两种建模技术通常使用:动力系统的动力学方法,细胞代谢物浓度与微分方程和一个基于单独的仿真建模方法,结合多尺度动力学是特别有效,从分子事件三维蜂窝组织(166年,167年]。
动力系统模型的生物膜反应器发挥重要作用在设计污水处理设施,因为他们允许现实的大规模运输和底物转化率预测这些系统(161年]。
基于单独的仿真模型分别对每个细菌细胞代谢物的当地环境互动,其他细胞,每股收益,根据自己的代谢行为和流体。的时间演化系统可以模拟从几个连接细胞发育完全的三维电影结构可以进行分离167年]。这种类型的模型允许生物膜的几何结构等解决问题取决于基质浓度(168年- - - - - -172年]。
生物膜的特性包括许多技术从年长的建立方法,如细菌菌落计数更现代的技术,如荧光标记的生物膜结合数学COMSTAT等预测建模(表3)。今天的联邦资助气候很有竞争力和成功的提案越来越依赖于协作跨学科工作。因此,重要的是,调查人员来扩大他们的知识为了更好的批判和跨学科的项目计划。本文提供了一个快速概述面向新的研究人员在生物膜的表征方法。
表3。总结主要的直接和间接方法生物膜的特性。
| 时间来完成 | 专用设备要求 | 生物膜的制备 | 笔记 | 引用 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 板计数活细胞枚举 | 1 - 3天 | 孵化器:耗材:一次性盘子中,培养瓶,合适的琼脂培养基 | 细胞从基质中删除,均质,re-suspended在液体培养基中,稀释,镀和整除、孵化和统计。 | 最容易适应液体/浮游的文化。这种方法只有量化活细胞,一个假设是,每个殖民地源自一个原始细胞。活细胞的不同代谢状态的生物膜可能复杂化确定准确数量的细胞生物膜。必须经细胞群或表面积。 | [25]21日23日 |
| 光学显微镜 | 分钟 | 化合物,brightfield显微镜 | 生物膜可以直接种植在一个透明的衬底,如幻灯片或盖玻片,染色和直接观察到。 | 计数或观察成熟生物膜是有限的,积累的丰富的生物膜质量防止观察单个细胞。可以使用与干燥质量测量获得生物膜厚度和量化具体的视觉特征的生物膜。 | (19日,52) |
| 手册使用显微镜细胞计数 | 几分钟至几小时 | 血细胞计数器:Brightfield或荧光显微镜、细胞染色 | 生物膜必须从衬底和均质中删除。 | 相对廉价的、可重用的和容易学习,但乏味。它不区分活和死细胞,能动的细胞极难计数准确,除非固定(死亡)。 | (16日27日28日) |
| 自动细胞计数,库尔特计数器 | 一个到几个小时 | 库尔特计数器 | 生物膜必须从衬底和均质中删除 | 库尔特计数器量化细胞和颗粒,大小可以区分实体。非常小的细胞可能很难准确计数。 | (31、32) |
| 自动细胞计数;流式细胞术 | 几个小时——更多的标记和分离可能需要更长的时间。 | 流式细胞分析仪:抗体或荧光染色 | 生物膜必须从衬底和均质中删除。流式细胞术需要贴上一个单独的荧光团的细胞群为每个孤立的细胞类型。可能不是有效的如果你只是想计数细胞。 | 流式细胞术可以区分不同的细胞类型。这可以是昂贵的,需要专业技术。 | (33、34) |
| 荧光显微镜和染色 | 20 - 30分钟。 | Brightfield /荧光显微镜:荧光染色,或内源性荧光蛋白的抗体 | 生物膜可以直接种植在一个幻灯片或盖玻片,染色,观察原位。生物膜是沾染了期望的结果。 | 有些污点是潜在诱变剂。污点应该谨慎选择,并不是所有的污渍穿透细胞膜,并不是所有兼容维护一个活着的生物膜。 | [37140140]14日,27日 |
| 共焦荧光显微镜 | 一个到几个小时。 | 共焦荧光显微镜:荧光染色,或内源性荧光蛋白的抗体 | 可以想象在生物膜(盖玻片,例如)。必须标记细胞。荧光团可以选择根据不同的目的,如区分活和死细胞,染色细胞核/ DNA,等等。 | Biovolume可以用适当的计算软件和计算能力。通常需要一个专门的技术人员来运行和维护工具。可以形象的任何细胞或粒子能被探测到的荧光标签的显微镜。最好是用于结构和三维结构比计数细胞。可以想象在生物膜的厚度和组装z-stacks。 | [20,35岁,38,41岁,44126170) |
| 测定干燥质量 | 3 - 4个小时。 | 分析天平:实验室烤箱能够达到100°C | 电影衬底上干,集结,然后清洗。衬底再次集结。 | 电影领域应该测量;厚度可以测量给干质量单位体积湿。 | [42、43、48、63、88) |
| 总有机碳 | 15分钟/样品。 | TOC仪 | 均化和再悬浮。 | 一个标准协议可以区分碳EPS和细胞碳。 | [54]17日,24日 |
| 结晶紫测定 | 2 - 4小时/ 2天。 | 板读者或UV / VIS分光光度计:革兰氏染色剂 | 生物膜增长的间接测量。细胞与结晶紫染色、洗和简历的吸收测量。高吸收与生物膜的质量。 | 个别井有些变量,所以控制,标准和复制是很重要的。96孔板适配器是必需的。还需要标准96 -孔板与平坦的底部。 | (25 58 59、66、88) |
| 四唑盐试验 | 2 - 4小时。 | 四唑盐:评价方法:显微镜、流式细胞仪、光谱等。 | 生物膜增长的直接或间接测量。细胞培养与四唑盐代谢转化为甲瓒导数。评估通过光谱学、显微镜和流式细胞仪根据甲瓒的溶解度。 | 不溶性甲瓒盐将困在细胞膜允许直接单个细胞分析。可溶性甲瓒可能来自媒体和量化的间接量化。只有活细胞会把盐甲瓒提供可行性的措施。 | [63年23日,27日,65 - 68年) |
| ATP生物荧光 | 几个小时。 | 分析工具:光度计 | 孵化的生物膜对大豆肉汤长达5天。 | 试剂稳定在15到25°C或一天一周当存储在0到4°C。 | (73、75、77、78) |
| 血清总蛋白 | 几个小时 | 分析工具:紫外可见分光光度计 | 生物膜是刮的基质和均相液体悬浮,通常使用一个商业均质器。 | 蛋白质测定方法受制于其他物质可能存在,比如某种离子,洗涤剂,减少代理或其他物种。 | (88、90、91、94) |
| 药物& QCMD | 分钟 | 石英晶体microbalanceBioreactor | 累积测量,频率之间的校准和手机号必须完成。 | 从QCMD材料属性信息需要一个合适的理论模型。 | (96年,99 - 101104106年) |
| 扫描电镜 | 几个小时到几天 | 扫描电子显微镜:溅射涂布机 | 生物膜生长在盖玻片(或其他基质)和直接成像显微镜。样品必须是固定的,干,涂有金属(Pt-Pd)。 | 有毒化学物质可能参与一些固定的技巧。通常需要一个维护合同和特殊的住房条件。 | 39(21日,88年,124 - 126131135137年) |
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国家综合医学科学研究所(美国)(5 p20gm103427),一个组件的国立卫生研究院(NIH)国家科学基金会、LSAMP二期,格兰特号码420 - 18 - 09 - b。
作者没有利益冲突披露有关这项工作的内容感兴趣。