研究与评论:工程与技术雷竞技苹果下载杂志
菜单ISSN: 2319 - 9873
ISSN: 2319 - 9873
+44 7456 0355801化学，生物，物理和工程系，多恩大学，克里特岛，内布拉斯加州
收到的日期: 12/09/2017;接受日期:14/10/2017;发布日期: 24/10/2017
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生物膜S是附着在表面上并嵌入在细胞外聚合物物质中的微生物群落，该物质提供了保护，稳定性和各种细菌物种的留置营养。从工业设备到医疗设备，这些群落可以在各种不同的环境中形成，导致破坏、生产力损失和疾病。作为生物修复剂和可再生能源，它们也具有巨大的经济和社会效益潜力。生物膜的巨大潜在好处和威胁鼓励了各学科的研究人员研究生物膜的特性和抗生素膜策略，导致化学家、物理学家、材料科学家和工程师开发有益的生物膜应用和预防方法。最终的结果是丰富的知识和创新技术。然而，在微生物和生物膜研究方面没有广泛的正式培训，这些科学家在试图设计实验和开发创新的实验室协议时，发现了一系列令人生畏的生长、量化和表征生物膜的既定技术。这篇微型综述的重点是通过概述各种定量和定性生物膜表征方法来丰富跨学科的努力和理解，以帮助新手研究人员进行分析选择。本文共分为四部分。第1部分简要概述了生物膜和需要高度跨学科方法的独特性质。第二部分介绍了菌落形成单元(colony forming unit, CFU)计数和结晶紫染色等经典定量技术，并介绍了ATP生物发光和石英晶体微量天平等现代定量技术。 Part 3 focuses on the characterization of biofilm morphology and chemistry including scanning electron microscopy and spectroscopic methods. Finally, Part 4 illustrates the use of software, including ImageJ and predictive modeling platforms, for biofilm analysis. Each section highlights the most common methods, including literature references, to help novice biofilm researchers make choices which commensurate with their study goals, budget and available equipment.
生物膜，跨学科研究，生物膜定量表征，生物膜定性表征
生物膜是一种复杂的三维微生物群落，它生长在一个界面上，并与周围环境相互作用[1，2］．生物膜通过隔离和转化潜在有毒化合物，在废物、土壤和水修复应用中作为可再生辅助材料具有巨大潜力[3.-5］．此外，生物膜作为生物催化和电化学电池的可再生资源，有可能彻底改变能源和化学生产[6，7］．不幸的是，生物膜也是一个主要的医疗问题，导致60-80%的死亡微生物感染并在疾病诊断和治疗方面提出了独特的挑战[8，9］．生物膜还引起社会和工业关注，因为设备污染会导致生产力损失、产品召回和潜在的流行病[10，11］．正是这些创新和挑战推动了生物膜的跨学科研究，并需要更好地理解生物膜研究的最佳实践。
生物膜通常由多种微生物物种组成，它们表现出复杂的群落组织和合作，从而产生有助于生物体在恶劣条件下生存的涌现特性。在生物膜内，细胞与小分子交流，以协调有助于群落生存的活动，这些活动可以影响生物膜的组成和结构。生物膜结构通常由活的和死的细菌细胞、细胞外聚合物质和细胞分泌的其他物质组成[12］．虽然结构和空间组织主要由细菌种类和细菌种类的比例决定，但细菌根据微生物种群和环境条件的变化(如剪切应力、养分可用性和竞争生物)来适应基质的物理结构和材料特性，并将其作为生存指标。作为这些适应的额外奖励，生物膜表现出对恶劣化学条件、饥饿和抗菌剂的耐寒性增强。事实上，生物膜基质的适应性已被认为是生物膜在恶劣环境中持久性的一个关键组成部分，因为抗菌素通过结构扩散的能力下降，从而只允许亚致死的细胞暴露于这些药物。此外，细胞的近距离接触增加了细菌传播抗微生物药物耐药性的可能性，这限制了未来可用于抗生物膜治疗的材料和方法。最后，纳入基质的环境元素可在饥饿条件下用作营养物质[13］．尽管在了解生物膜的这些复杂特征方面已经取得了很大进展，但仍有许多工作要做。目前挑战的复杂性最好通过多学科方法来解决，不仅能够解决薄膜的传统生物特性，而且能够解决其动态化学、物理和材料特性。
生物膜动力学和复杂的结构为有关活细胞数量、质量积累、生物膜形态和其他关键特性的基本测量带来了挑战。这些挑战不在于测量本身，而在于缺乏标准化的描述协议和统一的培训，对于那些想要为生物膜相关项目做出贡献的人来说，他们没有接受过生物膜研究方面的正式培训，无法为他们的研究识别最佳的描述方法。例如，生物膜积累测量可以集中在总干质量、总有机碳、活细胞数量或细胞总数(活细胞和死细胞)。薄膜形态研究可涉及通过染色技术和光学显微镜照射的二维表面结构，或通过共聚焦扫描激光显微镜(CSLM)揭示的三维特征[14，15］．本指南将根据所需信息、设备可用性、成本和易用性进行适当的技术选择。在接下来的章节中，将详细讨论生物膜表征的最常用方法，作为帮助规划生物膜表征实验的资源。
无论是在浮游培养还是生物膜培养中，最基本和最常见的细菌测量类型之一是确定存在多少细菌。各种直接和间接的方法已被用于定量生物膜中的细胞。直接计数方法允许枚举可培养的细胞，包括平板计数、显微细胞计数、Coulter细胞计数、流式细胞术和荧光显微镜。间接测定方法包括干质量测定、总有机碳测定、微量滴定板测定、ATP生物发光测定、总蛋白测定和石英晶体微量天平测定。应该注意的是，许多直接和间接的方法都涉及到在分析之前通过市上可用的均质器和涡流混合对生物膜进行均质，使细胞分散在液体介质中[16-18］．
直接定量方法
生物膜定量的直接方法是那些依靠直接观察来定量所需参数(细胞数量，生物膜总体积等)的方法。成像和自动细胞计数是生物膜定量最常用的方法。此外，为了更准确地识别感兴趣的细胞并与培养碎片区分，使用染色剂或荧光标记剂可以更容易和提高细胞计数和数据解释的准确性。成像方法，包括光和共聚焦显微镜提供手动平台来计数细胞和确定总生物膜体积。包含流式的仪器，如自动细胞计数器和流式细胞仪，提供了机械化的方法。这些不同的直接方法将在后面的章节中描述。
用平板计数法测定活细胞数量(菌落形成单位/ml或cfu)
活细胞计数法，又名CFU/ml测定法或好氧平板计数法，是一种用于确定活细胞数量的标准定量方法[19-21］．该方法的基本概念是在琼脂板上分离单个细胞，并从细胞中培养菌落，从而在没有染料或仪器的帮助下区分活细胞和死细胞并定量活细胞。该过程从浮游液体培养或成熟的生物膜开始，通过刮痧、涡流或声波使其悬浮在液体介质中并均质。镀膜方法包括无菌去除悬浮生物膜的等份，然后依次稀释并镀膜到含有营养的琼脂上。在培养完成后(通常为24-72小时)，在培养皿上计数菌落，用平均菌落计数、培养皿的体积和从悬浮生物膜到培养皿的稀释系数来计算原培养中的每毫升细胞数(cfu/mL)。如果生物膜数量很少，就像可能从96孔培养板中收集的那样，细胞数量可能不足以用这种方法确定菌落数量的显著差异。为了增加用于菌落计数的细胞数量，可以将生物膜从每个样品中悬浮到指定体积的无菌液体培养基中，并在合适的温度下摇晃生长(例如，37°C, 180 rpm)。重要的是要注意培养时间，并保持均匀，以扩大每个培养相同的量。当进行培养扩展时，建议有一个未接受任何处理的实验对照，因为最终计数将是相对的，并可能受益于最终计数的正常化。当使用混合培养时，要注意细菌以不同的速度复制。 Therefore, the culture expansion may not be appropriate as it will disrupt the ratio of cells from the original biofilm. Furthermore, the consideration to the colony forming incubation time may need to be extended to accommodate for slow colony forming bacteria [20.］．枚举法在纯培养物中是一种特别有用的定量方法，因为光密度(OD)可以在镀前测量，以获得用于关联细胞数和吸光度的校准曲线。因此，在未来的实验中，可以测量未知细胞数量的样品的吸光度，以确定细胞浓度[22，23］．
CFU技术通常不需要高度专业化或先进的设备，可以由训练有素的人员在大多数实验室情况下进行。要获得一致的结果，需要在电镀和介质制备方面进行一些实践。选择这种方法的一个重要考虑是，只计算能够形成菌落的活细胞。然而，这项技术并非在所有情况下都是可取的，因为它费时费力，有时需要数天才能进行足够多的重复以获得可重复的结果[24］．此外，由于生物膜需要悬浮，由于细菌结块可能会发生错误，如果使用抗菌治疗，可能会发生结转。这种技术也容易受到计数错误和用户偏见的影响，特别是当给定的菌落数量很高和/或计数是手动完成的时候，但这种错误可以通过使用手动菌落计数器(如ImageJ)来减轻。
基于流的单元格计数
一种更自动化的计数细胞的方法是两种方法，即液体培养中的细胞通过狭窄的孔流动，并在它们通过时进行测量。Coulter计数和流式细胞术都需要将生物膜均质并悬浮在液体培养中。虽然Coulter计数器更便宜，但流式细胞仪在测量过程中可能会产生更多关于细胞的信息。
Coulter方法是将电解质溶液中的带电粒子通过一个作为电路一部分的孔[25，26］．粒子的存在改变了电路的阻抗，并被记录为电压的变化。电压的变化与颗粒大小相关，使该技术能够区分单个细菌细胞。电压脉冲然后在一段时间内计数，并与单元数相关。这种方法需要一个Coulter Counter仪器，这往往要花费数千美元。这项技术非常简单，但不幸的是无法区分活细胞和死细胞。
另一种流式计数方法利用流式细胞仪[16，27］．在这种技术中，细胞通过一个狭窄的开口，使它们单排通过。激光被用来检测细胞，因为他们通过散射，吸收或内在和外在荧光测量。流式细胞仪的主要优点是快速、简单和测量的准确性。使用这种方法，加上额外的细胞染色或内源性荧光标记(如GFP)，可以同时收集大量关于细胞的附加信息，包括细胞尺寸、表面特性、代谢活性和细胞的分化状态[28］．这种方法的主要缺点是仪器的初始费用相当高，这在许多实验室中并不常见，通常在5万至10万美元之间。同样重要的是要注意，并非所有流式细胞仪都记录体积，而是关注事件的数量，因此并非所有仪器都能产生单位体积的细胞计数。
光与荧光显微术
细胞计数和生物膜三维表征可以使用多种显微镜方法完成，从悬浮生物膜的简单光学显微镜到使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)测量附着生物膜的体积和形态。在本小节中，我们将描述各种方法定量生物膜，从细胞计数到生物膜总体积，使用显微镜。此外，我们还简要介绍了用于将荧光引入样品进行分析的常用工具。
复合光和荧光显微镜
小到细菌细胞的结构可以用复合光学显微镜观察到。典型的细菌细胞长度为2-8 μm，分辨率要求总放大倍数为200倍或更大。对比增强方法，如相位对比或差分干涉对比(DIC)，可以提高图像的整体质量，使细胞更明显。复合光学显微镜的价格从数百美元到数万美元不等。荧光显微镜将光学显微镜的光学能力扩展到固有的或添加的荧光发射，这极大地扩展了可以从这种方法收集的信息[29］．荧光显微镜配备了高强度灯来激发荧光分子，荧光过滤器允许特定波段的激发光和发射光分别到达样品和观察者。传统荧光显微镜的成本在数万到数十万美元，这取决于模型的复杂程度和附加功能，如附加相机和荧光过滤器，高于基本可用模型。荧光染料和消耗品的成本在数十到数百美元之间。
使用显微镜进行细胞计数可以在非常不成熟的生物膜中进行，也可以在均质/悬浮生物膜上使用腔室计数滑片进行。这可以用未染色细胞或染色细胞，用光学显微镜或荧光显微镜来完成。铜绿假单胞菌生物膜染色图像水晶不同孵育时间的紫图1．不成熟的生物膜(图1)，可以区分和计数单个细胞。这可能是耗时的，需要许多图像的再现，并受到用户的偏见，如提到的集落计数。此外，在成熟的生物膜中(图1)三维结构的形成使得通过成像计数更加复杂和困难。
图1:生物膜光镜。铜绿假单胞菌(PA01)生物膜随时间生长的显微镜图像。光学显微镜图像显示，在静态培养中播种1 (a)、3 (B)、6 (C)和24 (D)小时后，PA01生物膜在含有结晶紫染色的完整FAB培养基的组织培养板中生长的形态。尽管光学显微镜允许生物膜在所有生长阶段的可视化，但在计数能力方面有局限性，因为在这些图像中可以观察到，膜的3D结构在后期开始形成。克里斯蒂娜·威尔逊2016年在多恩大学拍摄的未公开图片。
一旦生物膜生长过了早期阶段，呈现出第三维度，用光学显微镜进行人工计数需要均质化和悬浮，用Petroff-Hausser室计数载玻片进行计数。这些是专门的玻璃显微镜载玻片，具有精确定义的样品体积和底部蚀刻的二维网格，可用于确定悬浮生物膜的细胞密度(细胞/mL) [30.-32］．均质/悬浮后，细胞然后可视化和手动计数在每个网格部分。从几个网格的平均计数可以用来计算原始悬浮液中的细胞数量，网格上的液体体积已知。这种技术的一个可能的复杂之处在于，在测量过程中，运动细胞有可能穿过不同的网格部分。但是，这很容易通过获取网格的图像并依赖于图像来克服。这种技术可能受到样本不具代表性以及无法区分活细胞和死细胞的先天缺陷的限制。然而，使用各种代谢或选择性渗透染色剂可以增加细胞的可见性，区分活细胞和死亡细胞，使计数更准确。这项技术简单，易于实施，而且价格便宜，因为它只需要一个光学显微镜，一个细胞培养实验室的标准仪器，以及约800美元的Petroff-Hausser载玻片。
此外，一旦形成成熟的膜，分析生物膜的总体积和形态可以在不破坏膜的物理结构的情况下提供关于生物膜结构和形态的重要信息。显微镜可用于确定或估计生物膜的总表面覆盖度和体积，包括细胞外聚合物基质。例如，生物膜的总表面积覆盖可在中确定(图1)．此外，通过校准显微镜焦距，可以通过测定生物膜顶部的高度和生物膜附着表面的高度来确定生物膜层的深度[33，34］．使用荧光显微镜测量总生物膜的另一个例子显示在图2，其中PA14定植拟南芥根的图像被用来确定(图2)根上生物膜层的厚度。
图2:生物膜的荧光显微镜。生物膜的荧光图像。(A)表达PA14的EGFP定殖拟南芥根的合并相位和荧光图像。显示了感染PA14的拟南芥根的荧光(绿色)和相位对比(灰色)图像的叠加。多恩大学凯特·福斯特2014年的未发表图片。(B)铜绿假单胞菌(PA14)生物膜的共聚焦显微镜图像。在流动条件下，接种后2和6小时，PA14在体外生长。活细胞为绿色(EGFP)，死亡细胞为红色(用碘化丙啶染色)。共聚焦允许监测x和y平面(中央面板)和z轴(底部和右侧面板)来表征生物膜的生长。未发表图片由Barbara Clement在Helmholtz传染病研究所，Susanne Häussler实验室2014。
共聚焦扫描激光显微术
共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)是一种特殊形式的显微镜，可产生三维生物膜的高分辨率、清晰图像[35-38］．3d成像之所以成为可能，是因为共聚焦光学可以聚焦在样品中非常小的体积上，同时排除来自其他位置的光。对整个样本的焦点区域进行扫描，以在不同高度生成高分辨率的2-D“切片”，这些“切片”被组装成最终的3D图像(图2)．此外，共聚焦显微镜可以利用单个或多个激发激光来观察多个荧光标记依次地或同时地[37］．与共聚焦显微镜相关的成本根据系统配置的不同而有很大差异，但通常在启动时起价数十万美元。这些仪器还需要有经验和高度训练的用户进行准确的测量和分析。此外，与购买荧光染料以及共焦兼容介质和容器有关的费用可达数百美元。
荧光染料和蛋白质
虽然具有荧光性质的固有生物分子，如NADH和NAD(P)H或叶绿素，可用于荧光显微镜，但荧光染料和蛋白质经常用于将荧光引入待分析的样品中。荧光染料通常是荧光分子，称为荧光团，或连接到荧光团的生物分子，吸收和发射光，同时纳入生物结构。发射的光被检测到用于图像生成，以分析生物膜的特征，例如整个生长/处理期间的空间细胞活力、形状和功能。获得细胞荧光的另一种选择是对生物体进行基因修饰以表达荧光蛋白。虽然这些选项增加了方法水平(产生荧光细胞)或样品水平(生物膜染色)的制备时间，但额外的信息通常有助于更好地了解生物膜内的细胞生长和生命[14，39］．在这里，我们介绍了一些常用的荧光染料和蛋白质用于生物膜的分析。
有许多市售的荧光染色剂是有用的任何应用，包括荧光显微镜，共聚焦显微镜，和流动血细胞计数．这些包括天生的荧光分子，连接到生物分子或具有荧光衍生物的分子的荧光团。该染料有多种发射颜色(红色，绿色，橙色和紫色)，可以在单一样品上分析多种染料。染色在细胞内或细胞上的定位取决于荧光团所附着的分子的化学结构或性质。表1包括有关细胞定位的常用染料的摘要，染料是否表明可行性和实验计划的参考。例如，DAPI(4'，6-二氨基氨基-2-苯基吲哚dilactate)是一种对核酸高度选择性的染料，它将定位在DNA附近，而亲脂性染料，如fm4 -64，则保留在细胞膜中。许多染料提供了取决于细胞膜渗透性的活性信息，如SYTO 9和碘化丙啶(PI)，它们在核酸存在时都能发出荧光，但PI不具有细胞膜渗透性，不会染色活细胞，而SYTO 9则可以自由进入活细胞。另一种标记活细胞的机制是钙黄素染色剂，钙黄素染色剂是细胞膜可渗透的，在被活细胞的细胞内酯酶水解后转化为荧光衍生物[40］．这种机制具有优势，因为依赖水解的荧光允许钙黄素持续存在于生物膜的细胞外液中，而不会对图像/定量过程造成干扰，从而消除了额外的洗涤步骤并提高了准确性。
表1。生物膜染色常用荧光染料汇总表。
| 名字 | 细胞的位置 | 膜透性 | 生存(生活/死亡/) | 参考 |
|---|---|---|---|---|
| DAPI(4'，6-二氨基-2-苯吲哚二酯) | 核酸 | 是的 | 这两个 | [14] |
| 调频染料 | 细胞膜脂 | 是的 | 这两个 | [170] |
| SYPRO红宝石生物膜基质染色 | 矩阵的蛋白质 | 没有 | 这两个 | [171] |
| Propidium碘化 | 核酸 | 没有 | 死 | [27171172] |
| SYTO | 核酸 | 是的 | 生活 | [27116172] |
| 钙黄绿素 | 细胞内的空间 | 是的 | 生活 | (140、172) |
诱导细胞荧光的另一种方法是通过基因工程将外源DNA导入细菌，从而产生荧光基因产物。这通常是通过引入质粒(外源DNA的一小部分)来实现的，尽管将外源DNA纳入细菌基因组可能有助于跟踪基因表达[41］．由细胞产生的绿色荧光蛋白(GFP)及其变体，如增强型绿色荧光蛋白(EGFP)，可使细胞发出绿色荧光，荧光波长在400至600 nm之间;在健康细胞条件下，紫外光激发时，荧光波长在350至450 nm之间[41，42］．由此产生的发射可用于计数细胞和跟踪实时生物膜积累[39］．表达GFP的生物膜可以单独评估绿色，也可以与其他荧光染色剂(如PI)联合评估，如图所示图2．在流式细胞接种2小时和6小时后拍摄的这些图像中，铜绿假单胞菌(PA)生物膜中含有EGFP，因此活细胞呈现绿色，而来自培养基的PI在死细胞中积聚，呈现红色。与染色相比，基因修饰具有许多优点，包括抗光漂白的相对稳定性和将质粒传递到子培养物的能力，从而在每次实验中必须重新引入染色剂时将修饰保持在许多培养物中。然而，考虑到与克隆细胞相关的载体和人工成本，如果经常使用荧光分析，创建生物体是最好的。GFP有很多优点，它是生物膜研究的一种方便的荧光报告剂，而且它似乎不会干扰细胞的生长和功能。现在有多种彩色荧光蛋白，如青色荧光蛋白(CFP)和黄色荧光蛋白(YFP)，可在共培养中单独标记细胞或在单个细胞中进行多个标记[42，43］．带有GFP的生物膜可以在体外如流式细胞中观察到(图2)或在拟南芥根上的PA等原位(图2)．许多但不是所有荧光染料和蛋白质的一个可能的缺点是可能干扰细胞过程，导致毒性或细胞变化，这可能限制可能的表征类型。供应商的客户服务和以前的文献可以提供有用的咨询，以了解染料是否适合所需的数据收集，并允许使用后不受阻碍的增长。
显微镜的优点和缺点
一般来说,显微镜具有生产迷人的图像，可以直接用于出版物或使用成像软件量化的优势。图像经常提高出版物的可读性，并允许读者解释显微镜所做的观察。显微镜的一个主要优点是能够定量分析生物膜，而不需要收集和重新悬浮，从而使自然结构得以保持[35，36，44］．使用染料和荧光可以在不破坏生物膜的情况下获得更多关于细胞活力和功能的空间和时间信息，尽管引入荧光也增加了方法水平(产生荧光细胞)或样品水平(生物膜染色)的制备时间[14，39］．不幸的是，图像选择是有偏见的，尽管可以采取措施来减轻这一事实。随机选择图像或在多个样本之间一致选择图像位置是两种常用的技术。此外，为了从分析中获得统计显著性，将需要一个大的图像库，这可能是耗时的。在荧光成像的情况下，在实验计划中必须小心，以确保细胞成像一致。必须避免荧光团猝灭或光漂白，这是由于化学和光照照射导致荧光团荧光减少或消除，这可能导致不具有代表性的结果。如果数据收集包括荧光强度的量化，还必须注意确保整个图像库的所有设置都是一致的。图像采集和分析使用图像分析软件，如开源ImageJ，是一种常用的定性和定量表征方法[45，46］．
间接定量法
生物膜生长通常可以通过代理标记来间接测定，该标记可以推断生物膜的数量。这些标记的例子包括干质量、总蛋白质含量、DNA、RNA、多糖或代谢物。间接量化方法都涉及到一个基本假设，即被量化的物质或性质与数量相关细胞，或者每个细胞的蛋白质/DNA/质量是一致的。这一假设已在生物膜中得到验证，使得这些方法非常有用[47］．最好的方法是用直接方法来验证间接方法，因为间接方法只是基于代谢功能和生物分子生成的代理量化，这可能取决于生物体、培养条件和年龄。
干燥的质量
干质量，通常表示为单位面积的质量，或生物膜密度是一种广泛使用的标记，可以导致快速生长量化。为了找到干质量，将具有生长底物的生物膜放置在恒温烘箱中，直到除去水并达到恒定的重量[48，49］．或者，如果底物是热敏的，可以从表面刮下生物膜，悬浮在生理盐水中，用冷乙醇沉淀，沉淀物收集用于分析[17］．干燥温度取决于研究人员的喜好和基材的耐热性。例如，一些研究人员使用了60°C，另一些则使用了100-105°C，这两种温度及其各自的干燥时间都可以实现样品的完全干燥，但这是根据研究人员基于手头实验的特定方面的偏好而选择的[47，48］．主要目标是利用恒定的温度和相应的时间来实现完全干燥的样品，同时对生物膜或底物的扰动最小。干燥后，对样品进行称重，从底物中刮取生物量，并对底物进行称重。干生物量是在基质上的生物量和没有生物量的基质之间的重量差。将干生物量归一化为湿生物膜的生长面积，计算单位面积膜的生物量，或将湿生物膜体积归一化为生物膜密度[48，49］．
干质量测量的缺点是，它们不能从不同的膜成分(如细胞外基质)中区分细胞质量。这种方法的使用也依赖于生长基质，因为它必须在干燥温度下耐热或易于从生物膜中分离，因此它不包括在生物量计算中。这种方法的另一个缺点是样品干燥后不能用于任何其他表征方法。这种方法的主要优点是相对容易和成本效益，因为它需要相对“低技术含量”的实验室设备，如干燥箱和天平，这些都是标准的实验室设备。
有机碳总量
总有机碳(TOC)是间接测量样品中与有机化合物或来自生物(蛋白质、脂类、尿素等)的碳化合物相关的碳量。这与元素碳(EC)，如石墨或煤，和无机碳(IC)相反，无机碳由简单化合物组成，包括简单碳氧化物(CO和CO2)、碳酸盐、碳化物和氰化物。由于降解成CO所需的条件不同，这三种碳源可以被区分开来2在各种碳化合物中[50，51］．TOC测量常用于确定环境水质和制药工业中仪器清洁度的测试，以及生物膜积累的定量[52- - - - - -54］．
生物膜的TOC定量通常分为两步，其中测量总碳(TC)和IC，并用于确定TOC [55，56］．生物膜被分解，IC转化为CO2，通常通过加热酸化，并通过红外光谱检测。接下来，样品中的所有碳都转化为CO2，通常通过加热氧化，并测量TC。然后根据这两个值的差值(TOC = TC - IC)推断出TOC [55］．样品制备和定量的准确方法是使用海洋国际碳分析仪、耶拿Analytik Multi N/C 2100S或UIC集成CM5012 CO等仪器确定的2电量计。然而，TOC的最终计算是通用的，与仪器无关[54-56］．因此，这种方法的主要费用和缺点是一个专门的TOC专用仪器的成本，成本约为2万美元。另一个缺点是缺乏定量的特异性，因为TOC测量的是整个生物膜的碳含量，包括细菌和细胞外聚合物物质(EPS)。存在用于从细胞中区分碳和从EPS中区分碳的估计协议，从而减轻了这一缺陷[55］．
虽然TOC提供了一个量化生物膜数量的标记，但必须使用直接分析方法(cfu，细胞计数等)将该值关联起来，以生成一个与方法无关的值。此外，已有研究表明，在一定体积的细胞中，碳的含量取决于细菌的健康状况[53］．因此，在每一组条件下都必须进行额外的关联，并且每次实验都必须执行新的标准化协议或控制。
结晶紫法
革兰氏染色是微生物学中最常用和优化的方法之一，用于细菌的识别和可视化[57］．革兰氏染色的主要成分和常用染料是结晶紫，这是一种基本的三苯胺染料，在革兰氏阳性和阴性细胞中均可渗透细胞膜[58］．传统上，在革兰氏染色过程中，媒染剂，典型的碘-碘化物混合物，被添加，使晶体紫在细胞质内。这种复合物在革兰氏阳性细胞中是膜不渗透的，因为更大的细胞膜厚度将复合物锁在细胞内，但在革兰氏阴性细胞中可以突破薄膜。这使得革兰氏阳性细胞在用乙醇溶液脱色后呈紫色，允许通过显微镜区分革兰氏阳性和阴性细菌[58］．然而，如果革兰氏类型之间的区分不是目的，媒染剂可以省略，革兰氏阳性和阴性细胞都将占用晶体紫，并且在脱色步骤中染料将自由地从细胞中通过，允许通过光谱定量晶体紫。这种量化已被证明是非常有用的细胞估计生物膜生长[23，59-61］．
的原理图图3解释在多孔板中进行的基本生物膜积累试验。将生长介质和浮游细胞从培养皿中取出，用去离子水(DI)清洗，只留下附着的生物膜(图3)．在去离子水中加入1%的结晶紫溶液，并将生物膜与染料在室温下孵育一段时间，通常为5至30分钟。孵育后，除去染料溶液，用去离子水将生物膜冲洗几次以除去游离染料(图3)．然后将脱色溶液添加到大于或等于原始培养基体积的体积中，与生物膜一起孵育10-30分钟。脱色溶液通常由90-95%的乙醇溶液组成，但也可以使用其他脱色溶液，如纯乙醇或乙醇与丙酮或乙酸，因为目标是使CV溶解[23，61，62］．最后，将CV注入的脱色溶液转移到带有适当脱色溶液空白的96孔板上，根据仪器的过滤器可用性，用多孔板UV-Vis光谱仪评估530-600 nm的吸光度[23，60，61］．
图3:微量滴定板中生物膜的晶体紫测定示意图。接种后5小时，在微量滴度板上对PA01生物膜进行结晶紫测定的示意图。生物膜的配方很难用肉眼区分(A)，然而CV是一种非特异性染料，它与细菌共定位，使其可见(B)。在每个孔的外边缘，在平板、介质和空气相交的地方，生物膜会形成一个特别密集的区域。这可以通过一个薄的深紫色环(侧板视图)看到。细菌吸收的结晶紫与生物膜中的细胞数量成正比。因此，当用乙醇从生物膜中去除并转移到一个干净的96孔板(C)时，可以用UV-Vis板阅读器(D)进行量化。克里斯蒂娜·威尔逊(Christina Wilson)于2016年在多恩大学获得的未发表数据。
虽然晶紫微量滴度板检测由几个步骤组成，但它相对容易执行，可重复，并允许研究人员同时快速分析多个样品。它相对便宜，因为它不需要购买专门的设备，而且如果不受污染，染料的保质期可达数年。此外，晶体紫测定法可以用于在各种反应器中生长的生物膜。图4显示了疾病控制中心(CDC)反应器中铜绿假单胞菌(PA)生物膜在指数增长(“对数”)阶段开始时的光密度(OD)随时间数据的测量示意图。这种方法的主要缺点是不具有特异性，不能区分活细胞和死细胞。该方法的另一个缺点是有很多变量(孵育时间、孵育温度、脱色染色等)，这些变量会给检测结果引入批次的可变性[62］．然而，采用文献中可用的标准化协议和采用标准化控制可以消除方法的可变性。
图4:CDC反应器中生物膜的晶晶紫测定。结晶紫(CV)法在CDC反应器中测定PA01生物膜。(A)在生长曲线发展的每个时间点重复试验的示意图。首先，生物膜在CDC反应器的优惠券上生长。去除后，用附着在细菌表面的CV处理生物膜，直至用乙醇清洗。在600 nm处测量乙醇洗涤的吸光度(光密度)，作为生物膜生长的替代品。2016年，克里斯蒂娜·威尔逊和海伦娜·瓦尔基耶-弗林在多恩大学获得了未发表的图片。(B) PA01生物膜细胞培养物在玻璃表面生长的光密度(OD)时间数据。细胞处于指数生长(“对数”)阶段。外径测量的不确定度小于或等于圆尺寸。 The solid line is a fit to an exponential function. The inset shows the same data and fit using a semi-log plot demonstrating how the exponential growth curve becomes linear when the log of optical density is plotted against time. The Pseudomonas aeruginosa (PA) biofilm was grown in 0.25% glucose (GL) and minimal media (MM). Unpublished data obtained by Chris Wentworth and Jeniffer Caballero at Doane University 2015.
四唑盐
四唑盐是生物学中最广泛使用的监测代谢的工具之一在体外［63］．各种盐类，总结于表2，成功地用于生物膜评价已经开发，允许量化和可视化细胞活力和代谢通过紫外可见和荧光光谱。虽然确切的减少机制仍在审查中，并因生物和盐类型而异，但总体概念可以以以下方式概括。
表2。用于体外生物膜研究的常用四唑盐的水溶性和检测波长汇总表。
| 名字 | 水溶度 | 检测波长(nm) |
|---|---|---|
| 麻省理工 2 - (4 5-dimethyl-2-thiazolyl) 3, 5-diphenyl-2H-tetrazolium溴离子 |
不溶性 | 前言:550 - 570 |
| CTC 5-Cyano-2,新型双- (p-tolyl)四唑氯 |
不溶性 | 例:540 新兴市场:630 |
| INT (2) - 4-iodophenyl 3 - (4-nitrophenyl) 5-phenyl-2h-tetrazolium氯 |
不溶性 | Abs: 470 |
| TTC 2、3、氯化作用 |
可溶性 | Abs: 480 |
| XTT(2,3 -二- (2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl) 2 h-tetrazolium-5-carboxanilide) | 可溶性 | Abs: 490 |
将所选的四唑盐稀释到与生理相关的溶液中，如培养基或盐水，并允许生物膜在培养温度或室温下孵育1-3小时。在此期间，无色盐被细胞辅助因子和酶从细胞代谢(指示细胞活力并与细胞活力成正比)还原为相应的甲醛分子，可由视觉或荧光光谱仪或显微镜检测到[63，64］．还原可导致水溶性或水不溶性甲醛决定最后的检查和分析步骤。水溶性甲醛在处理缓冲液中溶解，因此可立即通过光谱分析检测到[21，31，65-67］．这些通常用于实时评估细胞活力和代谢。在还原过程中，不溶于水的甲醛结晶并被困在细胞膜内。因此，可以通过流式细胞术和显微镜对每个细胞、细胞内或溶解在溶剂中(如DMSO或含0.1 N HCl的酒精)的晶体进行评估，以进行总体定量[68-70］．图5展示了在滴流反应器中生长的PA01生物膜的可视化，用不溶性甲醛CTC染色，使用荧光显微镜。甲醛晶体具有荧光特性，允许荧光显微镜下可见，如图所示图5．
图5:用四唑盐染色的生物膜图像。用来自四唑盐的不溶性甲马赞(CTC)观察生物膜生长的代表性图像。玻片上生物膜的生长(A)在滴流式生物膜反应器中生长48小时，用CTC(红色)和DAPI(黄色)染色，肉眼可见生物膜的形成。生物膜可以进一步用荧光显微镜观察，以定性表征生物膜的形状，并在低放大倍率下量化载玻片上的覆盖面积(B)，用CTC衍生的荧光甲醛只染色活细胞(C)和高倍放大倍率DAPI染色所有细胞(D)来定量活性。比例尺C、D=200 μm。多恩大学Jasmin Sandoval 2016年获得的未发表的图片。
ATP生物荧光
ATP生物发光测试是食品界和生物医学界公认的微生物检测方法，用于检测表面是否存在微生物污染[71，72］．三磷酸腺苷(ATP)是一种核苷三磷酸，作为所有生物的主要能量来源，因此是生存能力的主要标志。生物发光是指生物体将化学能转化为光的过程。最常见的ATP生物发光试验利用荧光素酶，负责萤火虫的光生产。在低ATP浓度下，荧光素酶是一种反应，其产生的光与溶液中存在的ATP量呈线性相关[73］．因此，光量可以用来推断生物膜的活力和生物量[71，73］．基本反应分两步进行;第一个是荧光素酶、荧光素和ATP的络合，形成荧光素腺苷酸复合物。第二步是荧光素腺苷酸与氧氧化成氧荧光素，这导致在大约550至570 nm处探测到光子的发射[71，74］．
生物发光的定量方法相对简单，可以在悬浮或附着的细胞上进行。首先，去除培养基，用水或缓冲液冲洗生物膜以去除细胞外ATP。其次，生物膜被悬浮，细胞被裂解以释放细胞内ATP，使其可用于荧光素-荧光素酶。在第三步中，将细胞内释放的ATP添加到由荧光素、荧光素酶、镁离子、用于维持pH值的缓冲液等组成的反应试剂中，反之亦然。发光复合物的半衰期约为30分钟。因此，在加入生物样品/试剂后，应尽快检测发出的光[23］．最好的做法是在有限的时间内每10-30秒量化一次发射的光，以便将读数平均为总ATP估计。在已知第3步中添加的ATP量的相同条件下，将此平均值与用相同协议量化的ATP标准进行比较。概述的程序是一步一步的分析顺序。然而，可以购买到市售试剂盒，其中包括裂解洗涤剂、荧光素酶、荧光素、缓冲液和所需离子的优化比例，以冻干粉形式出售，只需要添加去离子水，将方案减少到向生物样品中添加一种试剂，并通过光度计对发射光进行孵育和量化[75，76］．
这种分析方法非常可靠，可以快速进行，并且只需要一个光度计进行分析。一次读取一个比色皿的基本光度计的成本约为1000美元，而能够读取96个孔板和/或具有自动试剂添加功能的高科技仪器的成本可能为1万美元或更多。该方法在低ATP水平下具有很高的准确度。然而，许多变量，如ATP提取不良，温度和pH值波动，荧光素与荧光素酶的比例不足，都可能导致数据差异。因此，通常建议使用试剂盒而不是自制试剂进行检测[74，77］．商业检测只需几百美元，包括试剂和标准品，可用于进行200-1000次检测。除了分析和仪器的成本相对较高外，这种方法还有明显的局限性，即必须定期校准仪器以确认准确性[23］．
另一方面，一些研究人员努力建立一种非破坏性的生物发光试验，用于生物膜随时间的观察，高通量筛选或针对不同生物膜中的特定细菌[78，79］．该方法需要生产重组细菌，通过引入类似于前面讨论的GFP修饰的质粒，内源性产生荧光素酶，并通过发光计定量发光[78-81］．如果ATP生物发光分析经常用于高通量实验，那么创建重组细菌的成本和努力可能是合理的。否则，先前概述的市售检测方法对于一般使用是足够的。
总蛋白测定
一个被广泛接受的总生物膜生长的替代品是总蛋白质含量。假设细胞间蛋白质含量大致相似，在湿地微观生物膜中，蛋白质含量已被发现与生物膜中的细胞数量相关[54］．然而，蛋白质生产在不同物种、年龄和培养条件下的可变性可能导致与细胞数量的直接相关性偏离，因此该方法应与严格的实验控制结合使用，并使用更直接的量化方法进行验证[82，83］．为了评估这一点，将生物膜从底物中去除，并在液体悬浮液中均质。以与所使用的蛋白质测定方法一致的方式裂解细胞。例如，有些方案要求在55°C的强碱存在下或用三氯乙酸(TCA)在含有洗涤剂和蛋白质沉淀的溶液中进行孵育。这种裂解缓冲液应不含蛋白酶，因为蛋白酶(分解蛋白质的酶)的存在会降低样品质量。裂解后，可以通过紫外-可见光谱仪通过染料-蛋白质相互作用产生的颜色变化来测量蛋白质含量。根据比尔斯-兰伯特定律，在特定波长下，着色物种的吸光度变化取决于染料-蛋白质相互作用产物，与蛋白质浓度成正比。
测定总蛋白含量的方法有很多。其中最常用的是Bradford, Lowry，和双辛酸(BCA)方法。布拉德福德法很简单，只需将已知体积的蛋白质样品加入含有考马斯亮蓝G-250染料的酸性布拉德福德试剂[84］．将裂解样品或标准蛋白添加到布拉德福德试剂中，在室温或37℃下孵育短时间，即10-30分钟(以减少所需的反应时间)。在此孵育期间，蛋白质与染料结合，导致光谱从棕色(吸光度约为465 nm)转变为蓝色(最佳吸光度约为595 nm) [85，86］．蛋白质结合依赖于蛋白质结构中带正电的氨基酸通过范德华斯、离子和疏水相互作用与带负电的净染料相互作用[87］．因此，测量595 nm处的吸光度变化，并通过BSA标准曲线转换为总蛋白浓度。第二种常用方法是劳瑞法。最初的劳瑞蛋白测定法，或其更现代的改进，是基于氧化还原化学的两步[88-91］．首先，蛋白质样品与硫酸铜和酒石酸盐在室温下孵卵10分钟，由四个肽键和一个铜原子形成四齿铜络合物。在第二步中，加入福林酚试剂，在室温孵育30分钟或更长时间内，福林酚试剂中的磷钼/磷钨酸配合物通过电子转移而增强了四齿铜配合物的浅蓝色，最终颜色在约750 nm处吸收最佳。确切的机制已被研究，但迄今尚未完全澄清。蛋白质悬浮缓冲液是一个关键的考虑因素，因为Lowry测定对洗涤剂、钾离子、大多数表面活性剂、螯合剂(即乙二胺四乙酸，EDTA)、培养基中常规存在的一些糖和还原剂干扰测定，并可能导致错误的颜色变化[84］．第三种常用的蛋白质定量方法是BCA测定法。BCA蛋白测定的化学机制非常类似于利用蛋白质还原铜离子导致光谱漂移的Lowry测定。而Lowry法的Folin试剂被BCA (bicinchoninic acid)取代，一步即可完成，而不是两步即可完成[54，92］．蛋白质样品和BCA试剂盒试剂(含BCA试剂和硫酸铜溶液的碳酸盐缓冲液)在室温下孵育30分钟，在562 nm处进行最佳吸光度分析。BCA蛋白测定的主要优点是与大多数表面活性剂兼容，使其适用于大多数常见的细胞裂解试剂，尽管它仍然容易受到螯合剂的影响。BCA测定方法应用广泛，方法简单，因为在文献中通常指出，它是根据“制造商说明书”进行的，其中通常包括将试剂A和B结合，并加入用裂解缓冲液稀释的样品，使样品浓度在标准曲线内[93，94］．除了这些传统方法外，还描述了各种其他比色法和荧光蛋白测定法，包括组氨酸标记、抗体等的专业测定法，其中许多已作为检测试剂盒在市售[95-97］．
蛋白质定量是一种快速，常用的检测方法，允许生物膜生长的相对评估。根据试剂盒大小，检测试剂盒的价格通常为100-300美元。这些通常包括用于100-1000个样品的检测试剂，根据所选检测方法的敏感性，每毫升样品的范围为1-2000 ul蛋白质，以及小瓶的BSA标准。当检测非常少量的蛋白质时，由于移液的非系统变化(即技术差/缺乏经验)、室温或孵育时间的变化等，建议对每个板或检测设置运行标准，通常是BSA。尽管一些试剂盒对许多干扰剂敏感，但可以规划裂解缓冲液并选择试剂盒以避免任何干扰。在干扰不可避免的情况下，可以通过运行悬浮缓冲区的背景空白来解决较小的情况。另外，样品可通过凝胶过滤、透析或蛋白质沉淀去除干扰物质[54，90，95］．这种方法的主要缺陷是无法区分细胞和细胞外蛋白，这可能会导致跨物种生物膜比较和处理的错误，从而在不伤害细胞的情况下减少EPS蛋白。这可以通过从细胞中去除细胞外蛋白的细胞提取方法来避免，或者与细胞活力测定并行使用蛋白质定量可能是可取的。
石英晶体微量天平
石英晶体微量天平(QCMs)允许无损测量生物膜积累作为时间的函数[98］．仪器由Astatine (AT)切割的单晶石英小圆盘组成(图6)，这是一种压电材料，在圆盘的谐振频率驱动由应用振荡电位差。所述圆盘可涂覆金(Au)或氧化硅(SiO2)，并用作生长基底。该圆盘位于生物反应器的流道中，从而在圆盘表面形成生物膜。谐振频率是系统质量的函数，因此质量的微克变化与谐振频率的偏移成正比，因此可以在生物膜形成时测量其积累[99］．Tam等人举例说明了QCM技术的有效使用，以显示环境条件和遗传操作对变形链球菌生物膜生长速度的影响[One hundred.］．在本研究中，薄膜的湿质量与QCM频移之间的直接相关性得到了QCM装置质量的定量测量。
图6:石英晶体微平衡生物膜反应器。openQCM©测试室附流入和流出管的媒体。图片(A)顶部，(B)前视图和(C)内部的流室，包括石英晶体和持有人的openQCM©测试室。这个房间的底座装有所需的电子设备。(D)流池配置的卡通，生物膜沉积在晶体上进行生物膜定量[100]。
当应用电位关闭时，可以获得有关粘弹性性质的附加信息，因此可以监测振荡的指数衰减。这种类型的测量被称为石英晶体微天平耗散监测(QCM-D)。在这种技术中测量的耗散因子对薄膜的表面质量密度以及薄膜与晶体表面和周围介质的机械耦合很敏感[101］．QCM-D允许在液体环境中进行动态测量，是一种非破坏性技术。因此，可以考虑生物膜质量和形成动力学对环境条件(如pH值或添加剂浓度)的依赖性[102-106］．QCM-D需要模型来解释数据，并给出了膜厚度、剪应力和生物膜粘度的估价值[101，107-109］．这些参数对于机械去除生物膜的工作特别有意义。QCM-D仍然是一种未充分利用的生物膜表征技术，主要由物理学家和工程师使用，但微生物学家还没有作为一种跨学科方法广泛探索这一选择。
该技术的主要优点是在不牺牲样品的情况下实时监测质量积累到ng/cm2的精度，这有助于更好地了解生物膜附着，并允许使用多种分析技术进行调查，例如在单个样品上量化活力和基因/蛋白质表达的测定。这种方法的一个主要缺点是专用设备、电子产品、软件和消耗品的成本很高，从简单的单通道设备(例如openQCM©提供的设备，只需600美元)到Q-Sense的全自动高通量设备，只需数千美元。图6显示了openQCM©设备的一个例子，该QCM晶体安装在一个小的流室。电子器件是基于微Arduino微控制器板。所有的硬件和软件都是开源的，所以它们可以很容易地适应用户的需要。该系统的另一个缺点是谐振频率对温度和压力的变化高度敏感，因此在数据收集过程中维护或考虑这些变量的波动非常重要。
替代定量表征方法
文献记载表明，生物膜也可以用DNA、RNA和多糖定量分析[91，110-117］．虽然这些通常被用作直接技术，假设每个细胞都有相似的DNA、RNA和多糖数量，但建议与更直接的方法(如CFU或细胞计数)一起提供这些量化，因为EPS基质包含来自先前裂解细胞的DNA、RNA和多糖成分，使这些技术与总蛋白类似，无法区分细胞和EPS成分[12］．此外，已注意到特定的RNA和多糖表达量会因生物体或生长环境而改变[118，119］．因此，强烈建议文献优先在特定生物体中定量这些化合物。
荧光光谱法是一种尚未被广泛应用的间接定量方法。该方法假设每个细胞在激发时都散发出相似的荧光发射强度，因此利用强度作为细胞数量的替代量化值，并且可以在悬浮生物膜上进行[120］．这种方法可以利用代谢分子(NAD/NADH, FAD，色氨酸等)的自身荧光，并且可以像前面讨论的GFP那样转染细胞产生荧光蛋白，或者可以用荧光染色剂对细胞进行染色[69，120-122］．代谢分子的存在和蛋白质的荧光强度受细胞外和细胞内条件的影响。因此，实验应以阴性对照进行，即在相同培养条件下不加处理剂的样品[122］．虽然不是一种定量方法，但二维荧光光谱可以作为一种非破坏性的、时间可分辨的方法来引出生物膜的生理状态信息[122］．这种方法需要一些专门的设备，但当与其他技术相结合时，可以提供生物膜与周围介质之间物理相互作用的信息。Wolf等人将该技术与人工神经网络相结合，在原位研究生物膜的形成，并分析生物膜生长与工艺参数的关系[123］．
放射性标记还用于生物膜的定量，方法是将同位素附着在生物分子上，如胸腺嘧啶或葡萄糖，并通过显微镜、闪烁/伽马射线计数器进行观察[124-126］．由于过度的辐射暴露有潜在的有害影响，因此需要专门的设备和培训。
生物膜表征的定量方法通常伴随着定性方法的表示，如生理生物膜表面成像、表面粗糙度的结构评估、形态、空间组织以及生物膜与环境的相互作用。之前我们已经讨论了光和荧光显微方法，由于易于使用和可视化活生物膜的能力，这些方法越来越多地用于定量和表面结构分析。在本节中，我们将介绍扫描电子显微镜(SEM)，因为它是通过高分辨率成像进行结构分析最常用的方法。
扫描电子显微镜
扫描电镜可用于开发高分辨率、放大的表面形貌图像。总体放大倍数约为10-50万倍，使这项技术在分析微观结构，包括生物膜的微观结构方面非常宝贵[19，127］．扫描电镜可以收集高分辨率图像，用于评估细菌相互作用、EPS组织和生物膜形态，这有助于更好地了解形成和持久性[128-130］．
扫描电镜的工作原理类似于传统的荧光显微镜。然而，扫描电镜不是使用光子束来观察样品，而是利用集中的电子束。电子束穿过若干电磁透镜后，撞击样品，发生两种主要情况:(1)电子被表面分子吸收，激发表面分子，导致一个低能量的次级电子被喷射出去;(2)从表面散射出去，即一个高能量的背散射电子。前者由二次电子传感器接收并转换为数字图像，在概念上类似于荧光显微镜中检测到的光子。由于二次电子能量低，这些图像往往只显示样品的表面[19，127，131］．
SEM成像技术根据检测到的电子的来源分为两类:二次电子或背散射电子。虽然二次电子分析是主要的SEM成像技术，但大多数SEM仪器都能够读取散射电子。背散射电子是由入射电子束的高能电子在表面散射而产生的。这些反向散射电子可用于生成低分辨率图像，显示化学变化的位置。这种散射事件的频率与被探测原子的原子量成比例，从而测量化学成分的差异。
电子显微镜的一个优点是容易获得定量元素分析的串联光谱技术。能量色散x射线能谱(EDX)通过检测当入射电子导致表面原子失去一个核壳电子(次级电子)，使原子处于激发态时，原子发出的x射线，产生一个表明样品元素表面组成比例的光谱。表面原子随后通过释放x射线形式的能量回到基态，然后被检测到。
扫描电镜分析的一个主要缺点是它不能在活样品上进行，因为测试是在高真空下进行的，并且在分析生物样品之前需要大量的准备。样品制备包括固定，去除所有水分，并在样品上涂上一层导电金属薄层。样品固定通常通过醛溶液实现，醛溶液以共价键合蛋白质以保存二级和三级蛋白质结构[132］．然后，样品通过一系列分级酒精处理脱水。由于样品中的水分会干扰扫描电镜获得足够真空条件的能力，样品的完全脱水对于最佳成像分辨率非常重要。由于生物膜由约97%的水组成，成像时的完全脱水会导致样品中不可避免的大小和结构扭曲[133，134］．最后，样品还必须导电，以允许静电荷的耗散，这可能导致阻碍图像的“伪影”或结构。这通常是通过溅射涂层金属，如金或铂，需要购买额外的设备和化学品。此外，生物样品也可以通过锇-硫代碳酰肼-锇(OTO)染色方法浸渍锇，该方法将重金属盐加入脂膜中，有效地消除了样品的充注[135-137］．一项具有巨大潜力的新兴技术是离子液体的使用，可以显著缩短生物样品制备时间。这些熔盐在室温下保持液态，即使在高真空下也不易蒸发，并提供导电涂层，而不需要样品固定和干燥。此外，它们已成功地用于各种生物样品，包括生物膜[133，138］．
为了克服样品制备的困难，环境扫描电子显微镜(ESEM)的方法允许未经处理的样品成像，而不需要完全脱水或真空[129，139，140］．ESEM采用了扫描电镜的所有图像生成技术(即背景散射、二次电子、透射等)。然而，由于电子束穿过气体分子的距离会影响分辨率，该技术有局限性。此外，虽然样品可以保持湿润，但仍然不建议使用活性样品，因为电子束会伤害样品。最后，ESEM最显著的缺点是该仪器仍在开发中，商业版本还不能购买。因此，这项技术的使用是通过修改当前可用的sem来完成的，这需要研究人员频繁地在模式之间切换或为ESEM指定仪器。
尽管使用扫描电镜有一些缺点，但该技术具有很高的优势，因为表面图像的高分辨率可以揭示生物膜结构和地形的细节，这是许多其他显微镜技术所无法比拟的[19，127］．
替代性定性表征方法
生物膜表面的拓扑结构和化学性质可以通过扫描电化学显微镜(SECM)来评估[141，142］．该技术使用微米级的微电极，在适当的氧化还原试剂的存在下扫描表面，并在尖端和表面之间施加电位时诱导氧化还原反应[143］．这种多功能技术可以根据用于确定细胞外聚合物质(EPS)成分如何分布在生物膜表面的反应基团的分布，为生物膜的3D模型提供额外的维度。SECM需要专门的设备，这使得仪器的可用性和可访问性成为使用的限制因素。
原子力显微镜(AFM)分析生物膜虽然目前还不常用，但已有文献报道。原子力显微镜可以表征底层的组分以及底层的相互作用[144］．AFM将有助于了解生物膜的特征，如粗糙度、地形和刚度，但与其他技术类似，需要花费超过10万美元的专业设备和训练有素的操作人员。
生物膜的光谱分析越来越被认为是一种非破坏性的方法，可以更好地了解生物膜的聚集、粘附和EPS组成。红外(IR)和拉曼光谱表征利用光的吸收(IR)和非弹性散射(拉曼)，通过无探针的原位分析来识别化学特征。红外光谱通过使用IR光来提供振动信息，而拉曼光谱通常使用更高能的光，通常由近IR、可见光或紫外激光提供，以提供类似的信息。由于生物膜是三维结构，红外和拉曼光谱仅限于生物膜表面的空间化学变化，从而提供了对生物膜结构和细胞间通信的更好理解。红外信号通常要强得多，但由于压倒性的水信号，产生的信噪比明显更差。拉曼信号虽然较弱，但不会被水遮蔽，可以用更便宜的探测器探测到。表面增强拉曼光谱(SERS)利用金属表面的表面特性对微弱的拉曼信号进行增强，增强系数在106 -108之间。SERS增强为生物膜研究提供了新的可能性，但激光功率产生的热量和金属表面的抗菌性能为生物膜研究提出了实验问题。尽管存在一些困难，但红外和拉曼是很好的方法，可以与共聚焦扫描光学显微镜(CSLM)或专门的红外兼容表面结合使用[145-148］．
小角x射线散射(SAXS)可以用来研究EPS的组成、结构和潜在的分子相互作用。尽管传统上用于分析晶体或悬浮液中的蛋白质，x射线散射探针的使用显示了SAXS用于研究样品内部相互作用的前景[149-151］．尽管由于“低分辨率”而被低估，SAXS具有巨大的潜力，可以为生物结构和生物膜的分子组成提供有价值的见解[152］．
表面等离子体共振成像(SPRi)和电化学表面等离子体共振(EC-SPR)是用于实时研究细菌生理和电化学活性而无需标记的新兴技术[153，154］．与光谱方法类似，这种分析方法需要专门的设备和涂有导电材料(通常是金)的衬底。
生物膜的形成和毒性可以通过刚果红琼脂法的比色法检测，其中微生物在注入染料的琼脂上培养。该方法的结果是菌落颜色的变化，可用于确定微生物是否产生生物膜(黑色)或(红色)。这种方法通常用于富含多糖，粘液产生革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌[82，155］．
数学模型和计算机程序(COMSTAT, ImageJ等)可用于分析图像和增强现有数据的新视角，这些数据可用于开发描述性/预测模型和生物膜量化。
ImageJ
ImageJ已应用于实验室情况下的生物膜分析，例如从图像中自动计数菌落[156］．这部分是由于该程序的开放框架，它允许为特定的应用程序编写和共享插件和宏。该系统的协作性质使其在一般研究中如此有用，特别是在生物膜分析中[157，158］．
ImageJ最初被称为NIH Image，是一个免费的、开源的、基于java的成像程序，可以在Windows、Mac或Linux操作系统上使用。它能够读取许多图像格式(JPEG、TIFF、GIF、DITCOM、FITS和BPM)，并以许多不同的方式操作、分析或处理图像。例如，菌落颗粒可以用桌面扫描仪拍摄或扫描，细菌簇可以自动计数。图7演示了我们实验室中获得的一个典型示例，展示了ImageJ如何实现集落粒子计数。
图7:图像J生物膜菌落的定量(a)从滴流反应器中收集生物膜的示意图，该反应器位于悬浮在介质中的玻璃片上，并用于菌落计数。(B)带有菌落的琼脂板照片。这张照片用ImageJ分析，菌落为黑色，背景为白色，以达到最大的背景和菌落之间的对比(左)。在这种情况下，程序确定单个菌落的平均大小为108.16像素。最大的单个殖民地为135像素。如果按蜂群的平均大小来划分蜂群，可以计算出91个蜂群。ImageJ设置为菌落为黑色，背景为灰色，以便在背景和菌落之间实现最小的反射率和均匀性(右)。在这种情况下，如果将蜂群除以蜂群的平均大小，就会计算出93个蜂群。
也许ImageJ在生物膜研究中最有用的功能是生成图像堆栈的能力。叠加不仅允许不同荧光染色的图像被叠加，而且可以使用共聚焦显微镜等技术的数据创建三维图像(z堆栈)。这些三维图像不仅能够揭示生物膜结构的细节，而且可以与荧光染色技术相结合，以显示整个生物膜内不同细菌、蛋白质或离子浓度的分布[159，160］．
量化生物膜积累的数学模型
生物膜系统的数学模型使我们能够将先前讨论的许多测量技术的信息合并成一个连贯和统一的图像。关于膜中微生物的形式和功能的信息可以定量地与生物化学因素(如生长动力学参数)和物理因素(如运输机制、剪切力和膜的粘弹性性质)有关[161］．
生物膜是非常复杂的，由于各种形式的附着、分离、生长和营养物质从表面到最深层的运输，以及当生物膜积累时存在的细菌间力。因此，应使用生物膜积累和活性的数学模型来处理生物膜结构，以便在同一框架内量化生物膜结构、生物膜积累速度和生物膜中微生物活性之间的关系[162］．利用计算机程序(COMSTAT)计算生物体积、表面积覆盖、生物膜厚度分布、平均生物膜厚度、微菌落体积、分形维数、粗糙度系数、平均和最大距离以及三维生物膜图像的表面体积比已经完成了大量工作[39，116，163，164］．
与计算系统生物学相关的力学数学模型增强了对具有复杂物理参数的生物系统的基本理解，如生物膜[55，165］．通常使用两种建模技术:一种是动力系统方法，其中细胞和代谢物浓度的动力学用微分方程建模，另一种是基于个体的模拟方法，这种方法在结合从分子事件到三维细胞组织的多尺度动力学方面特别有效[166，167］．
生物膜反应器的动力系统模型现在在设计废水处理设施中发挥着重要作用，因为它们允许对这些系统中的质量输送和底物转化率进行现实的预测[161］．
基于个体的模拟模型根据每个细菌细胞自身的代谢行为分别处理其与代谢产物、其他细胞、EPS和液体的局部环境的相互作用。系统的时间演化可以从几个附着的细胞开始，模拟到完全发育的三维薄膜结构，可以进行分离[167］．这种类型的模型允许解决诸如生物膜几何结构如何依赖于底物浓度等问题[168-172］．
生物膜的表征涉及许多技术，从较旧的方法，如细菌菌落计数，到更现代的技术，如生物膜的荧光标记，并结合COMSTAT等数学预测建模(表3)．今天的联邦资助环境竞争非常激烈，成功的提案越来越多地依赖于跨学科合作。因此，对于研究人员来说，为了更好地批评和规划跨学科项目，扩展他们的知识是很重要的。本文综述了生物膜表征方法的新研究进展。
表3。生物膜表征的主要直接和间接方法综述。
| 完成时间 | 专业设备要求 | 生物膜的制备 | 笔记 | 参考文献 | |
|---|---|---|---|---|---|
| 平板计数，活细胞计数 | 1 - 3天 | 孵化器:耗材：一次性培养皿，培养瓶，合适的琼脂和培养基 | 从底物中取出细胞，均质，重新悬浮在液体介质中，稀释，并对等分进行电镀，孵育和计数。 | 最容易适应液体/浮游培养。这种方法只量化活细胞，并且假设每个菌落都来自一个原始细胞。生物膜中活细胞的不同代谢状态可能使生物膜中细胞的准确数量的确定复杂化。必须通过细胞体积或表面积来确认。 | [25] 21日23日 |
| 光学显微镜 | 分钟 | 复合，明场显微镜 | 生物膜可以直接生长在透明衬底上，如玻片或盖片，直接染色和观察。 | 计数或观察成熟的生物膜是有限的，因为广泛的生物膜堆积阻止了单个细胞的观察。可与干质量测量结合使用，以获得生物膜厚度和定量生物膜的特定视觉特征。 | (19日,52) |
| 人工细胞计数使用显微镜 | 几分钟到几小时 | 血细胞计:Brightfield或荧光显微镜，细胞染色 | 生物膜必须从基质中去除并均质。 | 相对便宜，可重用，易于学习，但繁琐。它不能区分活细胞和死亡细胞，除非固定(杀死)，否则活动细胞极难精确计数。 | (16日27日28日) |
| 自动细胞计数，Coulter计数器 | 一到几个小时 | 库尔特计数器 | 生物膜必须从基质中去除并均质 | Coulter计数器量化细胞和颗粒，可以区分实体的大小。非常小的细胞可能难以精确计数。 | (31、32) |
| 自动单元格计数;流式细胞术 | 几个小时-更多的标记和分离可能需要更长的时间。 | 流式细胞仪:抗体或荧光染色 | 生物膜必须从基质中去除并均质。流式细胞术需要用单独的荧光团标记每一种要分离的细胞类型。如果你只是试图计数细胞，可能效率不高。 | 流式细胞术可以区分不同的细胞类型。这可能很昂贵，而且需要专业技术。 | (33、34) |
| 荧光显微镜和染色 | 20 - 30分钟。 | Brightfield /荧光显微镜：荧光染色剂、抗体或内源性荧光蛋白 | 生物膜可以直接在载玻片或盖玻片上生长，染色并观察原位．生物膜染色与预期的结果。 | 有些污渍是潜在的诱变剂。染色剂的选择要谨慎——不是所有的染色剂都能穿透细胞膜，也不是所有的染色剂都能维持活的生物膜。 | [37140140] 14日,27日 |
| 共聚焦荧光显微镜 | 一到几个小时。 | 共聚焦荧光显微镜：荧光染色剂、抗体或内源性荧光蛋白 | 可以成像的地方生物膜(在封面上，例如)。细胞必须被标记。荧光团可根据多种用途选择，如区分活细胞和死细胞，染色细胞核/DNA等。 | 生物体积可以通过适当的软件和计算能力进行计算。通常需要专门的技术人员来操作和维护仪器。可以成像任何细胞或粒子，有荧光标签，可以被显微镜检测。它更适合用于结构和3D建筑，而不是计算单元格。可以在生物膜的厚度内成像并组装z-堆栈。 | [20, 35岁,38,41岁,44126170) |
| 干质量的测定 | 三四个小时。 | 分析天平:实验室烤箱可达100°C | 基材上的薄膜干燥、堆积，然后清洗。基材再次聚合。 | 应测量薄膜面积;厚度可以测量出每单位湿体积的干质量。 | [42、43、48、63、88) |
| 有机碳总量 | 每个样品15分钟。 | TOC仪 | 均质和重悬。 | 一个标准的协议可以区分EPS中的碳和细胞碳。 | [54] 17日,24日 |
| 结晶紫测定法 | 两天两四个小时。 | 平板阅读器或UV/VIS分光光度计：革兰氏染色剂 | 生物膜生长的间接测量。细胞用结晶紫染色，清洗，测量CV的吸收。较高的吸收与更多的生物膜质量有关。 | 每口井都是可变的，因此控制、标准和重复作业非常重要。需要一个96孔板适配器。还要求标准96孔板与平底。 | (25 58 59、66、88) |
| 四唑盐测定 | 两四个小时。 | 四唑盐:-评价方法:显微、流式细胞仪、光谱学等 | 生物膜生长的直接或间接测量。细胞与代谢转化为甲醛衍生物的四唑盐孵育。通过光谱学，显微镜或流式细胞仪评估，取决于甲醛的溶解度。 | 不溶性的甲醛盐将被困在细胞膜上，允许直接对单个细胞进行分析。可溶的甲醛可从培养基中收集并定量用于间接定量。只有活细胞才会将盐转化为甲醛，以衡量其生存能力。 | [63年23日,27日,65 - 68年) |
| ATP生物荧光 | 几个小时。 | 检测试剂盒:光度计 | 在大豆肉汤上培养生物膜长达5天。 | 试剂在15 ~ 25℃下可稳定1天，在0 ~ 4℃下可稳定1周。 | (73、75、77、78) |
| 血清总蛋白 | 几个小时 | 检测试剂盒:紫外-可见分光光度计 | 生物膜从其基质中刮除，并在液体悬浮液中均质，通常使用商业均质机。 | 蛋白质测定方法容易受到其他可能存在的物质的干扰，如某些离子、洗涤剂、还原剂或其他物质。 | (88、90、91、94) |
| QCM & QCMD | 分钟 | 石英晶体微平衡生物反应器 | 对于累积测量，必须在频率和单元数之间进行校准。 | 来自QCMD的材料属性信息需要一个合适的理论模型。 | (96年,99 - 101104106年) |
| 扫描电镜 | 小时到天 | 扫描电子显微镜:溅射涂布机 | 生物膜可以在覆盖物(或其他基质)上生长，并直接在显微镜上成像。样品必须固定，干燥，并涂上金属(Pt-Pd)。 | 某些固定技术可能涉及有毒化学物质。通常需要维修合同和特殊的住房条件。 | 39(21日,88年,124 - 126131135137年) |
本文由美国国家普通医学科学研究所(NIGMS) (5P20GM103427)资助出版，该研究所是美国国家卫生研究院(NIH)的一个组成部分，其内容由作者全权负责，并不代表NIGMS或NIH的官方观点。本出版物也得到了国家科学基金会LSAMP的资助。hrd - 1619654, 2016 - 2021;hrd - 1102461, 2011 - 2017。本材料中表达的任何观点、发现、结论或建议都是作者的观点，并不一定反映美国国家科学基金会的观点。感谢Peter Wilson博士对内容的有益编辑和建议。感谢多恩大学的Cat Foster和Helmholz传染病研究所的Susanne Häussler博士在获取生物膜荧光图像方面的帮助。
美国国家普通医学科学研究所(NIGMS) (5P20GM103427)，美国国立卫生研究院(NIH)的一个组成部分，国家科学基金会，LSAMP二期，批准号420-18-09B。
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