关键字 |
| 耐多药结核病,线性探针测定、利福平耐药基因型MTBDRplus,比例的方法。 |
介绍 |
| 一个多世纪后,罗伯特•科赫发现结核菌结核病(TB)仍是全球死亡的主要原因之一从一个全球传染病和构成一个严重的公共卫生问题[1]。全球监测表明,耐药结核病是广泛的,现在威胁到许多国家结核病控制项目[2]。耐多药结核病定义为至少isoniazide阻力(异烟肼和利福平)(RMP)越来越威胁有效的结核病控制在工业化国家和发展中国家[3]。早期发现耐多药结核病患者来说都是最重要的管理和感染控制。最优方法确定结核病的耐药性及时和负担得起的方式在资源有限的环境肯定是需要一个小时。 |
| 最常用的药物敏感性检测方法(DST)比例法(PM)洛温斯坦-詹森介质要求4 - 8周收益率的结果。与检测耐药性的目的在较短的时间内,快速筛选的MDR标记,如耐利福平(RMP r)在某些人群,几个分子方法提出了在过去的几年里。快速测试的可靠性RMPr检测代理标记的耐多药结核病的流行很大程度上取决于RMP-monoresistance人口研究[4]。因为这需要验证在每个当地情况,试图也一直采取分析我们最后5年DST结核分枝杆菌的数据。 |
材料和方法 |
| 本研究在微生物学,格兰特先生政府医学院& J J医院,孟买,印度在获得必要的伦理权限和病人的同意。研究期间为两个月(6 -),然而一些只能在9 / 10月获得结果。43痰涂片阳性= 1 + &上图)标本构成本研究的材料。痰负结核病例和痰显示非典型分枝杆菌的存在被排除在研究之外。 |
| 涂片是由厚脓性痰标本的一部分&受到Ziehl Neelsen染色[5]。幻灯片是分级根据RNTCP指南。标本的分级如上1 + &使用RNTCP指南进一步受到n -乙酰- L -半胱氨酸(支持)氢氧化钠浓度方法[6]。接种完成剩下的一双偏媒体。相同的集中用于LPA和直接的敏感性测试。偏是孵化为8 - 12周35°C-37°C。经过足够的增长,文化进一步受到药物敏感性测试使用经济比例方法的变体。比例方法结果被认为是黄金标准统计计算。三种技术用于MDR检测的详细信息如下: |
| 行调查分析(LPA):基因型MTBDRplus [7] |
| 基因型MTBDRPlus检测在临床分离耐异烟肼和RMP和痰液样本检测的基础上最常见的突变katG,韩国仁荷和rpoB基因。MDR检测是使用基因型MTBDRplus(海Lifescience)按照制造商的指示构成DNA提取放大,放大后的程序——反向杂交和测序。结果被衬条读代码提供了工具。为了使结果有效,CC(共轭控制)和AC(放大控制)乐队出现在每个样本。浴缸乐队表明,结核分枝杆菌的存在复杂的样品中存在。相关基因的突变(和抵抗相关药物)被一个没有所指野生型带和/或每个基因的突变带的存在集群。rpoB katG和韩国仁荷每个控制带礼物为了解释结果。rpoB预测RIF阻力,katG预测高水平耐异烟肼,韩国仁荷预测低水平耐异烟肼。为结果有效的乐队是强度等于或大于交流带的强度。为了一批结果是有效的,负控制地带有一个CC和AC带礼物,但没有其他的乐队是可见的。 The product insert was referred for interpretation of banding patterns and troubleshooting. |
直接敏感性测试(DS) [8] |
| 痰存款获得的n -乙酰- L -半胱氨酸(支持)氢氧化钠法接种5毫米循环(27 SWG)到一双纯L-J包含L-J媒体和药物(异烟肼0.2μg /毫升;R-40μg /毫升)。山坡上被孵化,检查每周8周,每周增长记录。 |
| 电阻的定义是基于数量的增长上无毒介质。因此,当无毒介质上的增长是2 +或更多,增长1 +以上的药物含有中被定义为素的耐药性。当增长无毒介质1 +或更少(即< 100殖民地),科汉解释说,任何增长含药中被认为是抗特定药物的象征。为此,成对的斜坡上的高增长观察到被认为是为解释。 |
比例法[9] |
| 足够的增长后,药敏测试是针对主要抗结核药物的经济变异对Isoniazide method19比例:0.2μg / ml,乙胺丁醇:2μg / ml,链霉素:4μg /毫升和利福平:40μg /毫升。所有隔离耐异烟肼和利福平为多重耐药(MDR)。剂的不透明度/浊度匹配MacFarland没有1,黑色背景。山坡上孵化在37°C。生长在28天读,再一次42天。(增长记录-支流增长= 3 +;超过100个殖民地= 2 +;记录实际殖民地的数量= 1 - 100关口。)第一次阅读是在接种后28天。殖民地被数只在山坡上播种的接种体产生了完全可读计数或实际数量(100殖民地山坡上)。科汉解释说,殖民地获得了含药斜坡的平均数表示耐药细菌培养液中包含的数量。 Dividing the number of colonies in drug containing slopes by that in drug free slopes gave the proportion of resistant bacilli existing in the strain. Below a certain value – the critical proportion – the strain is classified as sensitive; above that value, it is classified as resistant. The proportions were reported as percentages. For each batch of testing, a culture of H37Rv (or a known all sensitive strain) was tested and validated. |
结果 |
| 共有43个痰(涂片阳性1 +和更多)标本受到线性探针分析,然后从相同的文化标本进一步受到经济比例方法的变体。表1显示了这两个技术比较的结果。在38(88.37%)情况下的技术表现出一致性。然而,有5例(11.62%)有差异的结果。差异被认为与利福平与异烟肼1例和4例(表2)。线性探针试验结果进一步评估考虑比例方法作为黄金标准。LPA被发现100%的敏感检测MDR以及RIFr(表3)。通过LPA不同条带模式产生的额外信息。表4显示了不同的模式在目前的研究中获得的耐多药菌株。有三个不同的模式在耐多药菌株。常见(91.6%)模式是S531L (rpoB) + S315T1 (kat G)。 |
| 另一种方法在本研究评估直接敏感性测试。由于时间限制,22日执行这个测试样品。表5显示了MDR的比较这三个技术检测。有显著差异在周转时间。分子方法快速但也有显著差异的周转时间两种表型的方法即DS(2 - 4周)和点(8 - 10周)。22直接的敏感性,一个显示污染。只有21个可供分析。3月底结果可用2星期,七在第三周,四个在第4周和7 8周。表5也表明RMPr可以作为一个替代标记MDR的所有三个测试。然而,我们回顾性分析5年DST数据基于比例法(见发表论文)显示,如果我们认为利福平monoresistance作为MDR的标记,然后MDR的比例将从47.54%增加到74.44%。 |
讨论 |
| 这项研究的主要目的是快速和经济评价MDR检测。为研究这方面,遗传方法(LPA)和表型(DS)评估。这两种技术的结果进一步与黄金标准比例的方法。进一步研究也旨在评估RMPr作为代理人的效用耐多药结核病的标志。 |
LPA和比例 |
| 近年来取得了实质性的进展我们了解结核分枝杆菌耐药性的分子基础。基于分子的分析可能是最快速和敏感的耐药性的检测方法。这些化验检测所有常见的耐药突变。这些技术包括PCR产物直接测序,SSCP分析,heteroduplex分析、双脱氧法指纹,RNA / RNA双工,碱基对不匹配分析,荧光素酶mycobacteriophage策略,核糖体RNA / DNA-bioluminescence-labelled探测法,反向杂交的探针测定,和其他策略[10]。本研究评估基因型的性能MTBDRplus(线性探针测定),检测临床分离耐异烟肼和Rif和痰正样本检测的基础上最常见的突变rpoB, katG和韩国仁荷基因。它使用PCR和反向杂交探针固定在一个塑料带,改善前一个版本的相同的测试,检测到突变的MTBDR rpoB和katG基因[11]。 |
| 基因型MTBDRplus用于LPA的性能测试直接涂片阳性痰用比例方法高度相关。43积极痰标本检测,结果38(88.37%)被发现是一致的黄金标准比例方法(表1)。差异与五个样品即指出。1在RIF和4在异烟肼结果(表2)。因此MDR的敏感性,RIF和异烟肼检测被发现100%,分别为100%和96.6%。巴纳德等人[12]做了相同的试验直接在536涂片阳性标本在开普敦,南非。结果与常规液体培养和药敏测试固体培养基。文德兰花等。[13]也使用相同的测定涂阳肺标本和文化隔离和得出结论,这个化验与表型药敏结果有良好的一致性。这些研究的细节见表6。 |
利福平耐药性(RMPr) |
| 利福平耐药性突变造成的rpo B基因DNA依赖RNA聚合酶[14]。rpoB基因的突变的性质和频率的Rif耐隔离根据地理位置[15]相差很大。分析大约500利福平耐药菌株来自环球资源的发现,96%的利福平耐药结核分枝杆菌临床分离株的变异在81 - bp rpoB基因的核心区域,而编码RNA聚合酶B亚基(10,16)。检测81 bp-region rpoB基因的突变高度相关(100%)在他们的研究。类似的结果也出现在文献[12 13]。然而,RMPr的敏感性可以降低在其他环境中,突变外rpoB 81 -基地-两地区的基因不被这个试验。事实上,我们的研究有一个假阳性(RMPr LPA但敏感的比例)。这可以归结原则的差异这两个方法,一个是基因型(LPA),另一个是表型(比例)。我们发现高(89.65%)的比例由于S531L RMP电阻突变。巴纳德等。[12]还发现更高比例(70.5% 0 RMP电阻由于S531L在他们的研究。 Similar to both above mentioned studies, Ravindran et al. [13] also found codon 531 of the rpoB was the most frequently encountered (84.6%). Other codons affected in all these three studies were 526 & 516. |
异烟肼耐药性 |
| 异烟肼也作为一线药物结核病是一种杀菌代理。突变导致异烟肼耐药性已确定在不同的基因目标包括Kat G,韩国仁荷,ahpc和其他基因仍有待建立[17]。在目前的研究中,kat G突变被发现在96.55%(仅KatG与异烟肼75.86%和20.668%)和异烟肼在3 44%。巴纳德等。[12]&文德兰花等。[13]报道97% & 86.5%的突变kat G .耐异烟肼一个地区的比例很低,相比之下,kat G (Barnard et al。[12]: 24% &文德兰花等。[13]:5.4%)。然而,他们同时没有发现这两个地区的突变和异烟肼独自一个地区,我们遇到了在我们的研究中。突变的患病率韩国仁荷和katG基因似乎相差很大在不同的地理位置有突变kat G地区(18、19、20)。然而,我们的研究指出S315T1 (Kat G) &C15T(异烟肼)作为最常见的突变区域与其他研究也是如此(12、13)。 |
| Telenti等。[21]MTB隔离的PCR分析,发现异烟肼耐药菌株的变异频率如下(Kat G: 36.8%,韩国仁荷:31.6%,Kat G-inhA: 2.6%, ahpc: 13.2%, Kat G-ahpc: 2.6%)。突变在异烟肼在德国很少报道[11]。盛行的kat G突变已报道占高比例的异烟肼耐药性结核病高流行国家和更低的比例在降低结核患病率设置大概是由于持续的传播这些菌株在高负担设置[19]。额外的信息通过这种分析是关于突变模式。常见(65.51%)模式是S531L (rpoB) + S315T1 (kat G)。类似的观察报告(12、13)。 |
| Sharma等。[22]分析了36株结核分枝杆菌的INNO-LiPA Rif结核病并与传统敏感性方法的结果。他们发现结核分枝杆菌探测特定的100%。最常见的观察突变是他- 526 rpoB基因酪氨酸。林加拉语等。[23]从海德拉巴研究的地理概况rpoB结核分枝杆菌临床分离株的变异使用PCR和DNA测序。他们发现28的38(74%)利福平耐药隔离显示常见突变,如531年,526年和516年。145 - 184年之间的多个沉默突变(外面热点地区)也在他们的研究报告。 |
利福平耐药性为耐多药结核病替代标记 |
| 耐利福平是一个相对罕见的事件,导致变异的选择,已经对其他组件的短疗程的化疗。因此,RMPr常被看作是一个优秀的代理标记[24]。然而RMP mono阻力之间的相关性和耐多药结核病可能不同人口取决于许多因素。因此在一些人口RMPr可能不是一个精确的耐多药结核病的标志。我们的结果(表3)表明RMPr可以作为一个替代标记MDR的所有三个测试。然而,我们回顾性分析5年发表的DST 25基于比例方法的数据显示,673年的隔离,578(85.88%)隔离到一个或更多的药物有耐药性。578、501(86 67%)利福平耐药(40 (7.98%):monoresistant, 461(92.01%):结合其他药物)。MDR 320 (47.54%)。如果我们考虑甚至利福平monoresistance MDR,那么MDR的比例将从47.54%增加到74.44%。需要更大规模的研究达到的结论。 What is of graver concern at this point is the increasing incidence of primary incidence of MDR -TB. Patients infected with RMPr strain of MTB generally have a poor prognosis, particularly because RMPr is often associated with resistance to other first line drugs. It also found that a majority of RMPr Indian isolate to be resistant to at least one or the other anti TB drugs, supporting the idea of using RMPr as a surrogate marker for MDR TB [14]. |
| 这里描述的直接测试将会为目的的国家有限的资源。他们的性能特征表明测定相当于传统的洛温斯坦Jensen媒介基础比例。直接灵敏度测试集22涂片阳性样品中哪一个有污染。表3显示了比较LPA、直接敏感性(DS)和比例的方法。敏感性测试异烟肼和RMP DS在2日周末在三种情况下,七在第三周,四个在第4周和7 8周。比例和直接的协议结果的敏感性是100%。尽管压力测试的数量很小,DS似乎是一个不错的选择对于MDR的快速检测。直接测试在间接测试的优点是,在大多数样品给敏感性结果的同时,小学文化。这个过程不仅减少了周转时间4周,但也通过消除污染的步骤的子文化。最重要的是,直接测试的结果更密切的代表细菌的数量在给定的痰样本,与间接测试,可以受到错误的选择当药敏测试从主成立文化。 In the direct tests, resistance can be reported if adequate growth is seen on the drug slopes even when the plain medium is contaminated. Mathew et al. 8 also have reported the utility of DS in MDR detection. Their results also indicate that resistance could be detected with growth as low as 10 colonies and with total agreement with the result of the indirect test. Hence, it is recommended that such results be accepted provisionally and confirmed with indirect test on subculture. |
| LPA和DS的缺点是测试需要进行涂片阳性(1 +或更多)肺标本的地方传统文化和比例方法得到一个上风。进一步评估可行性,本研究的影响和成本效率,有必要在结核病高负担建立大型示范项目设置为政策变化提供进一步的证据,进一步采用在资源有限的设置。 |
结论 |
| 直接灵敏度法可以作为一个很好的选择M结核病的快速药敏测试资源约束的设置。本次测试的结果是令人鼓舞的,让我们想更换比例方法,很多专业技术要求。同样,DS也可以与LPA的周转时间(就像廉价的技术,减少周转时间与比例相比)。线性探针测定绝对是一个好工具MDR的快速检测提供了一个必要的基础设施和训练有素的人力。比例时仍然是黄金标准阳性基因型的技术。一个查询仍然心里,这个假阳性是否真正的假阳性? ?还是由于检测方法的差异? ?表型和基因型的? ?这是一个简短的研究需要大量的加强我们得出任何结论前! |
确认 |
| 这项工作是由Priyanka Kembhavi女士(III M.B.B.年代学生)的短期资助ICMR:开展STS / 2011 /引用ID 201100347) Sarala Menon博士的指导下,副教授,格兰特政府医学院微生物系印度孟买。作者感谢技术团队的分工Mycobacteriology格兰特政府医学院,孟买的优秀的技术支持。 |
表乍一看 |
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