生淀粉降解,Acidic-Thermostable葡糖淀粉酶从来自烟曲霉菌CFU-01:纯化和表征生物技术的应用程序

文摘

改进工业过程中淀粉降解导致搜索耐热性的,嗜盐淀粉水解酶特别是葡糖淀粉酶,完全一种酶,这种酶能水解淀粉葡萄糖。在这个研究中,葡糖淀粉酶在液体培养的最优生产来自烟曲霉属真菌和纯化同质性的硫酸铵沉淀,离子交换色谱法和凝胶过滤、净化收益率为8.19%的20倍。50 kDa葡糖淀粉酶,分子量估计钠十二烷基硫酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)是高度酸性地区稳定在pH值范围宽以及耐热性的;保留约70%的初始活动60分钟的孵化后60ºC。纯化酶活性在直链淀粉、葡聚糖和不同的淀粉和K_米和V_马克斯的值分别为1.59毫克/毫升和14.33 U /毫克,当原木薯淀粉作为衬底。值得注意的是,这个葡糖淀粉酶具有高耐盐特性24小时后,约有50%的剩余活动孵化在3.0 M氯化钠溶液。一些金属离子包括K⁺、钙^{2 +}和毫克^{2 +}是酶的活化剂,而铜^{2 +}、铅^{2 +}和汞^{2 +}抑制其活性。这葡糖淀粉酶有资格的独特的生化特征用于生物技术特别是在食物,制药和生物燃料产业。

关键字

生淀粉、葡糖淀粉酶、生物燃料、耐热性的生物技术

介绍

面对挑战能源危机和全球环境健康问题与使用化石燃料,替代能源,比如生物燃料的开发和使用变得非常必要。淀粉、高分子量生物聚合物和主要存储的碳水化合物在植物形式,已被确定为主要原料一代的生物燃料,一个主要的可再生能源。淀粉是一种分布最丰富多糖在本质上,它是已知的和纤维素是地球上最丰富的碳水化合物聚合物(1]。淀粉分子首先水解的作用bond-specific淀粉酶成单糖进而转化为乙醇的微生物,通常酵母在发酵过程。经济上,淀粉行业约占15 - 20 %总工业消费的酶(2]。

葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)是最著名的淀粉酶之一,但具有独特的淀粉水解财产淀粉酶酶家族中,它可以完全水解淀粉和其他1,4-linked glucose-oligosaccharides攻击两个α-(1,4)和α-(1,6)糖苷键与直接形成淀粉葡萄糖(3]。事实上,葡萄糖,许多生物技术过程的主要碳源,目前主要生产工业的酶法水解淀粉取代酸水解的方法,因为它是经济效率和得到纯产品在这个过程的最后阶段4,5]。

酶,当工业的生产发酵技术从微生物,通常含有许多其他与此同时产生的酶,是活跃在同一衬底上,因此,它是重要的经济发展过程中最优生产的酶。有效的净化过程也需要获得纯酶以最大的特定活动(6),进一步了解这类酶的性质和作用机理。酶的生产、纯化、鉴定和利用无疑是非常重要的生物技术和淀粉处理,以满足工业要求的葡糖淀粉酶热稳定性优异,原淀粉降解能力和高葡萄糖产量是急需的7]。本文的纯化葡糖淀粉酶产生明显的生化特征来自烟曲霉属真菌CFU-01。

材料和方法

土壤样品的收集和准备

收集土壤样本随机在清洁和消毒从表层土壤层聚乙烯塑料袋,10厘米深的土壤环境木薯加工业在阿库雷的大都市,帕斯州,尼日利亚(坐标7°10镑5°05本部)8月,2014年。一克(1 g)的土壤无菌转移到9毫升无菌蒸馏水混合和混合的结果,允许在卸载之前站了几分钟。当时上层清液连续稀释和接受微生物分析。

微生物的分离、鉴定及筛选淀粉分解的活动

微生物被孤立于收集土壤样本序列稀释平板法和真菌物种的鉴定是根据吉尔曼的分类方法(8]。土壤真菌物种筛选淀粉分解的活动给纯培养接种疫苗每个确定的生物在刚做好的淀粉琼脂培养基。盘子在37°C 72 h,孵化后他们沾染了一个包含碘化钾溶液,KI 0.1% (w / v) /我₂0.1% (w / v)在1 M盐酸15分钟后来de-stained蒸馏水。盘子被检查周围的间隙带殖民地这表明淀粉水解酶的存在。

剂和酶生产做准备

葡糖淀粉酶的生产进行了深层发酵的优化条件下9]。液体矿产介质由可溶性淀粉;1%,酵母提取物;0.67%,硫酸铵;0.333%,硫酸镁七水硫酸锌;0.05%,硫酸铁(II);0.01%,氯化钙二水合物;0.01%,磷酸二氢钾;0.02%,pH值调整到5.0。发酵过程在一组shake-flasks包含五个厄伦美厄烧瓶(250毫升)被允许继续在轨道瓶72 h (Stuart的产物,模型S150)设定在150 rpm和30°C。生产媒体在10000 x g离心20分钟在4°C到获得一个浮在表面的游离在此称为粗酶。

酶活性测定和蛋白质浓度测定

葡糖淀粉酶活性早些时候由一个标准的试验过程描述Cereia et al。10)酶解(1毫升)被添加到试管中包含1毫升的1% (w / v)可溶性淀粉醋酸缓冲0.05缓冲区,pH值5.5和孵化60°C水浴10分钟。的还原糖(葡萄糖)发布的估计方法的米勒(11]。一个单位的酶活性被定义为所需的酶解放一微克分子还原糖在标准试验条件下每分钟。

总蛋白浓度的解决方案是由布拉德福德的方法(12),使用牛血清白蛋白(BSA)作为标准蛋白。

纯化的酶

葡糖淀粉酶的净化文化滤液三步完成;粗酶逐渐带来60%饱和固体硫酸铵冷水澡和离心机在10,000 x g 20分钟。沉淀分数(颗粒)含有葡糖淀粉酶是溶解在乙酸钠缓冲(50毫米,pH值5.5),透析对同一缓冲区广泛4ºC。透析液(32毫升)加载到CM-Cellulose列(25毫米直径40厘米高度法玛西亚的产物)与同一个缓冲区之前平衡;分数为5.0毫升每个收集60毫升/小时的流量和吸附蛋白质筛选了增加盐梯度最终浓度为1.0 M氯化钠。蛋白质的存在在筛选了分数在280 nm监控通过测量吸光度,葡糖淀粉酶活性进行分析筛选了分数使用描述标准试验程序。活动分数前池和集中使用超滤系统加载到交联葡聚糖g - 100凝胶过滤柱(25毫米直径和高度75厘米-法玛西亚的产物)之前平衡与50毫米醋酸缓冲(pH值5.5)和调整,以最后一个流量15毫升/小时。

通过sds - page测定分子量

纯化葡糖淀粉酶的分子量决定在变性条件下,钠十二烷基硫酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page) 10%如Laemmli所述13)使用Bio-Rad电泳系统(英国Bio-Rad)。

物理化学特性

ph值对酶活性和酶稳定性的影响:葡糖淀粉酶活性来确定最佳pH值、衬底制备不同缓冲区:50 mM Glycine-HCl缓冲(pH值2.0 - -3.0),50毫米醋酸钠缓冲(pH值4.0 - 5.5),50 mM磷酸钾缓冲(pH值6.0 - 7.5)和50 mM Tris-HCl缓冲区(pH值8.0 - 9.0)和葡糖淀粉酶活性在标准试验条件下决定。确定pH值稳定,这种酶在各种解决方案的pH值4.0 - 7.0 pre-incubated室温2 h和周期性采样每20分钟。之后残余酶的活动在标准试验条件下测量。

温度对酶活性和酶稳定性的影响:纯化的活动的最适温度为葡糖淀粉酶是由执行标准的测定在不同的温度下(30 - 100ºC)在50毫米醋酸钠缓冲溶液,pH值5.5。纯化酶的热稳定性是由pre-incubating稀释酶溶液与醋酸钠缓冲(50毫米,pH值5.5)在不同的温度下30至90ºC 2 h和周期性撤军整除的酶每20分钟。整除首次在冰上冷却之前测量残余在标准试验条件下酶活性。

金属离子和edta对酶活性的影响:金属离子的影响(Na +, K +、Mg2 + Ca2 +,与,Cu2 +和Hg2 +)和EDTA的纯化葡糖淀粉酶的活性测定进行酶活性测定氯盐的存在的金属离子和EDTA在不同浓度的1、5、10、20和30毫米50毫米醋酸钠缓冲(pH值5.5)使用可溶性淀粉作为衬底。在标准试验条件下的相对酶活性测定。

一些蛋白质变性剂对酶活性的影响:纯化酶(5毫升)孵化40ºC的30分钟50毫米醋酸钠缓冲(pH值5.5)包含变性剂(尿素和SDS)最终浓度的1、5和10毫米。相对标准试验条件下酶活性测定。

盐耐受性测试:纯化葡糖淀粉酶(5毫升)孵化在氯化钠溶液在不同浓度在0.5和5.0之间(氯化钠)M 24 h后4ºC的相对酶活性测定在标准试验条件下确定的公差葡糖淀粉酶高盐度。

动力学的研究

底物特异性研究:相对各种底物的水解率(可溶性淀粉、直链淀粉、土豆淀粉、可溶性葡聚糖,木薯淀粉,原料玉米淀粉和蔗糖)的纯化葡糖淀粉酶在标准试验条件下确定。底物浓度的解决方案准备1% 50毫米醋酸钠缓冲(pH值5.5)和酶与底物的相对活性测定可溶性淀粉。

动力学参数的确定:动力学参数(公里和Vmax)纯化葡糖淀粉酶测定通过测量的初始反应速率与可溶性淀粉,原料玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉、葡聚糖、直链淀粉和蔗糖在不同底物浓度(0.1 -10毫克/毫升)。表观动力学参数的准确值被莱恩威弗从双倒数的情节和伯克14]。

结果

微生物的分离、鉴定及筛选淀粉分解的活动

从收集到的土壤样本,隔离和标识曲霉属真菌物种;a . flavus来自烟和答:寄生,被观察到很好的生产商的淀粉酶区3.31厘米的间隙,分别为3.34厘米和3.18厘米(表1)。一个清晰的光环区在殖民地表示淀粉分解的活动。指定的隔离来自烟曲霉属真菌CFU-01之后选择了葡糖淀粉酶生产深层发酵。

表1:板(定性)筛选分离土壤真菌种类淀粉分解的潜力

酶的纯化

粗酶解决方案(650毫升)来自烟曲霉属真菌CFU-01总葡糖淀粉酶活性,血清总蛋白和具体活动16178.5 U,分别2900.95毫克和5.58 U /毫克的蛋白质。从CM-Cellulose离子交换柱洗脱后,一个主要峰值总葡糖淀粉酶活性为1485.12 U和总蛋白质含量20.502毫克(图1)。交联葡聚糖的葡糖淀粉酶的洗脱图g - 100凝胶过滤柱还显示一个主要的峰值葡糖淀粉酶活性(图2)。每个净化步骤导致增强的具体活动总结(表2)。

表2:总结葡糖淀粉酶的净化来自烟曲霉属真菌CFU-01

分子量的葡糖淀粉酶

纯化的分子量葡糖淀粉酶从来自烟曲霉菌CFU-01所估计的钠十二烷基硫酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page) 50 kDa(近似)(图3)。

纯化葡糖淀粉酶的物理化学特性

pH值对纯化葡糖淀粉酶的活性和稳定性:纯化葡糖淀粉酶是非常活跃的酸度4和6.5之间观察到的最佳pH值5.5活动为22.96 U /毫升(图4)。纯化葡糖淀粉酶的活动减少到只有80%的初始活动后孵化1 h在pH值为5.5,在pH值7.0至60%左右。纯化酶是55%的剩余活动2 h后孵化的pH值5.0(图5)。

温度对纯化葡糖淀粉酶的活性和稳定性:高酶活性之间观察到温度40 - 70ºC(图6)。纯化葡糖淀粉酶保留约70%的初始活动60分钟的孵化后60ºC时,酶活性保持相对不变的孵化2 h后30和40ºC分别保留约90和初始活动的85%(图7)。

金属离子对纯化葡糖淀粉酶的活动:葡糖淀粉酶的活性被K的刺激⁺和Ca^{2 +}随着浓度从1毫米到30毫米。然而,毫克^{2 +}观察刺激酶的活动的最终浓度10毫米。纯化酶的活性抑制了艾尔^{3 +}、铅^{2 +}、铜^{2 +}和汞^{2 +}盐浓度测试(图8)。

一些化学药剂对纯化葡糖淀粉酶的活动:螯合剂EDTA,几乎没有抑制作用在纯化的真菌葡糖淀粉酶的活动相对活动分别站在92%和83% EDTA的浓度1毫米和5毫米。尿素浓度也在这些变性的影响纯化酶的活性,相对活动的91%在1毫米和5毫米86%。然而,SDS的酶活性相对减少64%至1毫米到30%在10毫米(图9)。

盐纯化葡糖淀粉酶的公差:来自烟曲霉菌的纯化葡糖淀粉酶CFU-01保持约90%,67%和50%的初始活动24小时孵化后1、2和3 M氯化钠溶液,分别(图10)。

动力学的研究

底物特异性:来自烟曲霉菌的纯化葡糖淀粉酶CFU-01活跃在长链基板(多糖)包括可溶性淀粉、葡聚糖、直链淀粉、马铃薯淀粉和原淀粉(玉米和木薯),但表现出与蔗糖低活性,二糖(表3)。

表3:底物特异性纯化葡糖淀粉酶来自烟曲霉属真菌CFU-01

动力学参数(K_米和V_马克斯):动力学常数(K_米)和最大速度(V_马克斯)的可溶性淀粉的酶,葡聚糖,直链淀粉,生玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉和蔗糖进行了总结(表4)。

表4:Michaelis-Menten常数(K_米)和最大速度(V_马克斯)的葡糖淀粉酶产生来自烟曲霉菌CFU-01不同的基质。

讨论

酶活性的分析原油文化滤液或原油提取不准确地提供一种酶的特点,因为它并不意味着一个孤立的酶作用或multi-enzymic系统协同工作的存在的降解底物(15]。这样,一个广泛和高产净化过程是急需提供纯和同质葡糖淀粉酶研究工业使用。在这项研究中,净化产生的细胞外葡糖淀粉酶的同质性来自烟曲霉属真菌CFU-01深层发酵下通过硫酸铵沉淀、离子交换色谱法对CM-Cellulose和对交联葡聚糖凝胶过滤g - 100给种社会增加20倍ƒ一个¯‚¬‚c活动有8.19%恢复。葡糖淀粉酶部分纯化了硫酸铵沉淀在最近一段时间(16,17]。Manera et al。189.9)早些时候曾获得了净化褶皱的葡糖淀粉酶黑曲霉恢复47.6%用deae纤维素离子交换层析法。结合硫酸铵沉淀,离子交换色谱法和凝胶过滤色谱净化来自不同物种的葡糖淀粉酶(早些时候报道19,20.]。50 kDa葡糖淀粉酶的分子量答:来自烟CFU-01属于25 - 112 kDa平均分子量范围的真菌葡糖淀粉酶早些时候报道(21- - - - - -23]。

最大的最佳pH值观察纯化酶的酶活性在pH值5.5同意早期的报告,真菌葡糖淀粉酶曲霉属真菌菌株通常在酸性pH值(3.5 - -7.0)根据菌株和氨基酸序列(24]。林等。3早前报道这葡糖淀粉酶产生相同的值曲霉属真菌awamori。的纯化葡糖淀粉酶来自烟曲霉属真菌CFU-01非常耐热性的。50 - 60ºC的最佳反应温度得到纯化酶的协议与最佳反应温度通常为葡糖淀粉酶从曲霉菌2,24]。淀粉的水解包括两个高能要求步骤;液化和糖化,pH值和温度必须决定为了减少成本,避免不良副产物的形成(25]。耐高温淀粉酶的兴趣大大增加了,因为抵抗热失活已成为理想的性质在许多工业应用(26]。

金属离子抑制或刺激影响酶的活性取决于金属盐溶液的浓度。这种抑制作用的^{3 +}、铜^{2 +}和汞^{2 +}也是葡糖淀粉酶产生菌株的报道吗答:flavus早些时候的特征(27,28)和其他物种的葡糖淀粉酶(22,29日]。EDTA的抑制作用并没有深刻的表明金属离子可能不需要这些淀粉分解的酶的活动活跃的网站。纯化葡糖淀粉酶是观察到明显容忍高盐度的α-amylase相比先前的研究报道约60%损失的活动在高盐浓度(30.,31日]。盐耐受性试验是很重要的在糖化淀粉和高盐度废水处理含淀粉或纤维素残留在污染控制机制28,31日]。

葡糖淀粉酶也观察到,一个独特的特征是其高度的亲和力α-1,6-bonds只出现在右旋糖酐以及α-1,4-bonds直链淀粉,因此,这个葡糖淀粉酶可以完全水解淀粉分子尤其是生淀粉的分子结构是一个复杂的两种类型的债券。这是在协议与早些时候报告葡糖淀粉酶的特点答:flavus(28,29日]。

动力学常数(K的价值_米),1.64毫克/毫升,从双倒数阴谋获得可溶性淀粉用于es时反应进行pH值5.5和50ºC与获得的1.67 mg / mL Akinmosun et al。32)和1.90毫克/毫升的葡糖淀粉酶腐皮镰孢霉菌通过巴蒂et al。33]。动力学常数K_米可以提供很多关于酶的生化和生理信息(34]。这些动力学参数也基本选择大规模工业应用的酶(9自低K)_米值允许工业过程更快,更简单。

结论

从这个研究结果确认来自烟曲霉属真菌CFU-01从土壤中分离的木薯加工淀粉水解酶的网站是一个很好的生产商,葡糖淀粉酶,在深层发酵。纯化酶具有良好的生化特性和令人难以置信的能力,利用完全水解淀粉品种包括生淀粉。因此,这部小说葡糖淀粉酶可以使用不同starch-utilizing产业可能的生物技术的应用,特别是在有效转化淀粉葡萄糖生产乙醇生物燃料行业所需。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

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