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CSK HPKV农业学院植物病理学系，印度Palampur- 176062。
收到日期:02/02/2014修订日期:15/03/2014接受日期:22/03/2014
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真菌王国，据估计约有150万个物种，其中约5%已被正式分类。基于传统表型鉴定方法的物种鉴定往往费时费力，而且由于表型特征的不稳定性和主观性，容易受到培养条件的影响而受到阻碍。这种表型方法对不能在培养物中生长的真菌有明显的限制。分子系统学涉及到利用基因来获得生物的分类学地位和它们的进化关系，对传统的分类学概念产生了重大影响。RFLP、RAPD、rDNA分析、SSR和ISSR等技术在真菌系统学及相关研究中越来越重要。这些技术更快、更具体、更准确。这些进展提供了新的信息，使得生物种概念受到了支持系统发育种概念的批评，并帮助重塑了真菌王国的分类。
真菌分类
真菌王国包含了巨大的多样性，具有不同的生态、生命周期策略和形态，从单细胞水生壶菌到大型蘑菇。然而，人们对真菌王国的真正生物多样性知之甚少，据估计约有150万种，其中约5%已被正式分类。历史上，分类是基于宏观和微观可观察的特征-表型方法。形态特征因物种不同而有很大差异，在人工条件下可能无法繁殖。此外，被认为是真菌典型特征的特征是多系出现的，似乎有一个明确的无性繁殖的趋势，减少了形态特征的谱[1］．基于传统表型方法的物种鉴定往往费时费力，而且由于表型特征的不稳定性和主观性，容易受到培养条件的影响而受到阻碍[2］．
基于培养的形态学技术无法充分识别植物病原体，导致了不依赖培养的分子方法的发展[3.］．最近两个重要的发展极大地影响和引起了传统的系统概念的重大变化。这些是系统发育的方法和分子生物学技术的结合，特别是DNA序列分析，进入现代系统学。这一新概念已被发现特别适用于未观察到有性生殖的真菌类群(氘菌)[4］．真菌分类学的分子革命始于20世纪90年代初，通过分析pcr扩增的核糖体RNA基因[5］．聚合酶链反应的出现，使我们能够分析少量的真菌细胞，甚至单个孢子，干燥的植物标本室材料[6］．真菌专用通用寡核苷酸引物的选择[7为获取核苷酸序列提供了方便。rDNA的部分高度保守[8]，并作为进化差异研究的参考点。
对18S rRNA序列的比较已用于评估生物体的主要类群之间的关系[9］．在丝状真菌的系统发育中，18S序列大多被完全使用或以超过600 bp的亚单位[10］．在酵母中，25S rDNA区域的D1和D2可变区几乎完全被使用[11］．许多真菌，主要是酵母，已经建立了nDNA的GC含量。GC含量相差2%被认为是两株菌株属于不同的种[12］．在分子遗传学证据的基础上，现在很清楚，一些传统上被视为真菌的群体属于其他一些群体[13卵菌。
我们为什么要分类?
•分类学是一种交流语言。如果你愿意，分类学家提供生物学的基本词汇，定义每个新物种(单个单词)，并确保这些物种有准确的定义(就像字典一样)。
•易于与其他科学家交流。在许多不同的情况下，交流进一步需要识别更高层次的分类单位。交流还要求植物具有广泛接受和认可的科学名称，以反映它们在分类等级中的位置。
•如果分类学很差，研究可能在不同的分类群上进行，但以相同的名称报告-造成混乱。
•分类学差的分类单元，甚至可能无法进行研究。如果研究人员在研究对象上没有可靠的名称，就不可能交流和发表研究结果。
分类
分类学是生物学的一个分支，研究生物的命名和分类。分类学是对生物进行分类、命名和描述的科学。分类学是被称为系统学的科学实践的一部分，它涉及生物之间的进化关系。
生物体中不同程度的亲缘关系导致了不同分类等级的概念:
•物种-由一群可以繁殖和产生可育后代的个体组成。
•属-由一组密切相关的物种组成。
科-一组密切相关的属。
•Order—相关家族的一组
•Class -相关订单的组
门——相关类的一组
王国-相关门的一组。
有些真菌有不止一个学名——为什么?
真菌繁殖的双重模式，即有性繁殖和无性繁殖，这意味着自上个世纪以来[14一直有双重命名法。
Teleomorph:
有性生殖阶段(形态)，通常为子实体(如羊肚菌、褐蘑菇)。鉴定:
一种无性繁殖阶段(变种)，通常像霉菌(如黄曲霉、镰刀菌)。当一种真菌产生多种形态上不同的变形时，它们被称为变形。全形:
真菌，作为一个整体，包括一个teleomorph(性状态)和一个或多个anamorphs(无性状态)[15］．真菌的种类概念
分类学的基本等级是种。真菌学家使用不同的概念来定义真菌种类[4］．
•形态(表现性或表型)的概念是真菌学家使用的经典方法。在这种方法中，单位是在形态特征的基础上定义的，理想情况下是由它们之间的差异来定义的。
•发展研究
在子实体的年轻阶段出现的一些特征可能在成熟时消失，相反，一些特征只在子实体发育的后期出现。因此，子实体发育的研究为真菌分类提供了另一种思路。例如，担子在未成熟的蓬松球中存在，但在成熟的蓬松球中不存在。如果没有对幼体阶段的了解，我们就不会知道蓬松球是担子菌。发育研究已被证明对所有菌类都非常有用。
•多面体概念是基于字符的组合，虽然每个菌株不一定有相同的组合。
•生态理念，这是基于对特定栖息地的适应而不是生殖隔离，通常用于植物病原真菌。
•生物学概念，在现代系统发育分析出现之前发展起来的，强调物种内的基因交换(即有性生殖和准有性生殖)，以及阻止物种交叉繁殖的障碍的存在[16］．一个物种被认为是一个实际的或潜在的被内在生殖障碍隔离的杂交种群[17］．然而，由于交配和评估结果的困难，将生物物种概念应用于真菌是复杂的[18］．
真菌分类
根据Ainsworth(1966)，真菌王国(Myceteae)分为两个部分[19］：
➢Myxomycota
➢真菌门
Myxomycota
它分为四类:•聚粘菌纲
•Hydromyxomycetes
•粘液菌门
•根肿菌纲
真菌门
它分为五个部分:➢Mastigomycotina
•Chytridomycetes
•Hyphochytridomycetes
•卵菌纲
➢Zygomycotina
•接合菌纲
•毛菌纲
➢子囊茵
•半子囊菌类
•不整菌
•核菌纲
•盘菌纲
•Laboulbeniomycetes
•Loculoascomycetes
➢担子菌亚门
•Teliomycetes
•伞菌类
•腹菌
➢半知
•芽孢纲
•丝状菌类
•腔孢纲
Ainsworth对真菌的最新分类
引起植物病害的真菌和类真菌生物是一个多样化的群体。一些类似真菌的生物，通常被称为低等真菌，现在被认为属于变色菌界[20.］．
真菌样生物(变色菌属)
卵菌门
•纲:卵菌纲
真正的真菌
壶菌门
•纲:壶菌
接合菌门
•纲:接合菌
子囊菌门
•类:Archiascomycetes
•纲:酵母菌
•丝状子囊菌
•不整菌
•核菌纲
•Loculoascomycetes
•盘菌纲
•半知菌纲
担子菌门
•纲:担子菌
为什么卵菌门不是真正的真菌?
卵菌门长期以来一直被认为是真菌，因为它们通过吸收来获得营养，其中许多产生了许多真菌特有的丝状丝。卵菌门现在根据一些独特的特征被分类为一个不同的组(表)。卵菌门的所有成员都经历了卵母生殖，这意味着单倍体配子使单倍体卵球受精后产生二倍体卵孢子作为受精卵。这些卵孢子可以是大而孤立的，也可以是在卵囊内的小而多的。真正的真菌都不产生卵孢子[21］．
表型方法的缺点
表型方法因其缺乏标准化和稳定的术语和高度的主观性而受到很大的批评。此外，一些表型特征被认为是不稳定的，依赖于环境条件，如人工培养中的生长。表型方法的一个明显的局限性是它们不能应用于不能在培养中生长的真菌。因此，只要分类学家仅仅依赖表型特征，就有许多真菌将保持未分类状态。基于形态学标准进行分类的另一个值得注意的问题是双重分类系统，子囊菌和氘菌的分类之间没有一致的相关性[22］．这是建立真菌整体分类学概念的一个重要难点。基于文化特征的识别需要经验，且耗时[2］．传统方法难以对真菌分离株进行种级鉴定。例:不同种类的真菌的菌丝状态非常相似。生物物种的概念不能应用于不经历减数分裂的生物。
系统发育概念-以DNA为基础
分子分类学，也称为分子系统学，是利用基因来获取生物进化关系的信息。最近两个重要的发展极大地影响和引起了传统的系统概念的重大变化。这些是系统发育的方法和分子生物学技术的结合，特别是DNA核苷酸序列的分析，进入现代系统学。以前只在实验室研究中使用的分子技术现在已经很普遍了。这些发展提供了新的信息，使得生物物种概念受到了支持系统发育物种概念的批评[4］．
分子分类学的优势
分子方法更快，更具体，更准确，并且可以由没有专门分类学专业知识的人员执行和解释。分子方法普遍适用[4］．最重要的优点之一是能够区分密切相关的生物。这一新概念已被发现特别适用于未观察到有性生殖的真菌类群(氘菌)[4］．现代技术的增加使用和可用性在系统学中开辟了许多新领域，并使更传统的领域得到进一步发展。23］．
真菌分类学中的分子方法
•DNA碱基组成
•DNA杂交
(四)限制性片段长度多态性(RFLP)
•基于PCR
(三)随机扩增多态dna (RAPD)
(六)rDNA分析
•PCR-RFLP
(六)SSR(简单序列重复)
(一)ISSR(简单序列间重复)
DNA碱基组成:鸟嘌呤+细胞素含量的测定
核DNA碱基组成是最简单的分子技术，允许分解分类单元。单个物种的碱基组成理论上是一个固定的性质;因此，比较不同种间的G+C含量可以揭示它们之间的亲缘程度。其中经典的基于DNA的方法是核DNA (nDNA)鸟嘌呤+胞嘧啶含量的测定。许多真菌，主要是酵母，已经建立了nDNA的GC含量。GC含量相差2%被认为是两株菌株属于不同的种[12］．在一些分解不充分的真菌群中，物种内允许有8%的差异
DNA碱基比表示为:
茄根丝枯菌吻合群DNA碱基组成的比较[24］
比较了30株茄根丝枯菌的dna碱基组成。鸟嘌呤+细胞素含量范围为40.9 ~ 49.3 mol %。AG-1 GC含量最高(平均48.8 mol %)。GC含量在AG-2-1组内变化最大。AG-3的平均GC含量与AG-4非常接近。AG-6组内变异较其他组低。AG- b1 GC含量在AG组中最低。在所有吻合组中，AG-1的GC含量最高(平均48.8摩尔%)，其次是AG-4(平均48.8摩尔%)。47.3摩尔%)，AG-3(平均。47.1摩尔%)，AG-5(平均。45.2摩尔%)，AG-2-2(平均。44.6摩尔%)，AG-2-1(平均。 43.7 mole %), AG-6(avg. 41.8 mole %), and AG-BI(avg. 41.4 mole %). The GC contents of the isolates within each anastomosis group was almost same. Therefore, each anastomosis group must be regarded as a genetically independent unit.
它是互补DNA链之间的杂交。基因组杂交测量序列的相似程度，对于区分非常密切相关的生物是有用的。从一种生物中分离出的DNA用32P或3H进行放射性处理，剪成相对较小的尺寸，加热到变性，并与以同样方式从另一种生物中制备的多余的未标记DNA混合。将DNA混合物冷却以使其重新退火，将双链双链DNA从任何剩余的未杂交DNA中分离出来。测定杂交DNA中的放射性含量，并与对照进行比较，对照取100%。相对杂交值超过80%通常被认为属于同一物种，而相对杂交值低于20%则证明不属于同一物种[4］．
DNA-DNA杂交法测定根胞菌吻合群间的遗传相关性[25］
根丝枯菌的分离株在形态、致病性和生理上有很大的差异，使分类学研究变得困难。分离出的r. solani (telomorph = thanatephorus cucumis)可以通过其多核菌丝来区分，而与之相反的是根丝菌菌具有双核细胞。采用DNA-DNA杂交技术，对44株根丝枯菌的双核和双核分离株的亲缘关系进行了研究。从茄根丝枯菌的8个不同吻合群(AG)、双核根丝枯菌的5个不同吻合群(CAG)以及几个吻合亲和力不确定的不同分离株中分离出具有代表性的基因组DNA。不同AG菌株的DNA序列互补性很小，一般不超过25%。每个AG的DNA杂交值范围相当大(30-100%)，表明在某些AG中存在大量的遗传变异。在AG中，降低的DNA杂交值(<60%)表明存在遗传上不同的亚群，其中一些亚群已经根据菌落形态、致病性或吻合行为被识别出来。多核油菜参比分离株与双核根枯菌5个CAG分离株的DNA杂交值最低。DNA杂交水平的高度降低表明，多核和双核Rhizoctonia sp .是不相关的，并提供了遗传证据支持的分类分离的短形属Thanatephorus和Ceratobasidium
限制性片段长度多态性(RFLP)
在电泳方法中，限制性片段长度多态性(限制性片段长度多态性，RFLP)在分类学上尤为重要[4］．这种方法是用限制性内切酶消化基因组DNA，电泳后直接在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中检测产生的条带。根据基因组的大小，可以直接比较来自不同物种的基因组dna的摘要。这些图案可以制成表格并进行比较[26]或表现性树可以被构造[27］．
随机DNA探针和限制性片段长度多态性在镰刀菌分类中的应用[28］
通过对一株尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.)总DNA随机探针(A3和B2)的杂交，在乙矾染色的agrose凝胶中筛选了一系列镰刀菌的DNA限制性片段长度多态性。dianthi。用HIND III消化DNA。探针A3 (950bp)获得的片段在4个分离株中是相同的，而探针B2 (1550 bp)获得的片段有多态性，这使得尖孢镰刀菌f.sp。丹西和其他两种特色菜
随机扩增多态dna (RAPD)
RAPD分析是一种基于PCR的分子技术。在这里，单个短寡核苷酸引物被任意选择来扩增一组随机分布在整个基因组中的DNA片段。为一个人而不是为另一个人生成的特定片段表示多态性[29］
RAPD分析检测两种类型的遗传变异:
•两个引物结合位点之间的DNA长度
•启动区序列变异。
PCR引物结合区域的核苷酸取代，特别是在3 '端，可以阻止引物与DNA模板的结合。因此，在PCR反应中，这个条带将会缺失。可以计算不同应变之间条带分布的相似性(即数量和迁移率)，并用于推断应变关系。当筛选多个引物时，RAPD分析可以非常敏感地检测到其他方法无法观察到的分离株之间的变异。RAPD分析可以检测到菌株之间的微小变化，因为即使在启动区单核苷酸错配也可能阻止退火和凝胶上特征带的缺失。
瓜类植物中冠状芽孢菌和瘿孢菌的RAPD分析
瓜黏茎枯病是瓜黏茎枯病的病原。RAPD分析了从瓜类植物中分离出的D. bryoniae和Phoma，以确定这些真菌内部和之间的分子和系统发育关系。利用RAPD指纹技术，将59株分离株分为4个系统发育组，即RAPD组(RG) I、RG II、RG III和RG IV。使用10种引物OPK-1、OPK-4、OPK-8、OPK-9、OPT-01、OPT-07、OPT-12、OPT-13、OPT-14和OPT-18。D. bryoniae分离株聚集在RG I(33株)、RG II(12株)和RG IV(1株)上，而Phoma全部13株分离株聚集在RG III上。
基于RAPD指纹图谱的bryoniae分离株系统发育分析结果及Phoma rDNA分析
rDNA区域在活细胞中普遍存在，并与细胞中的一个重要功能相对应，因此它的进化可能反映了整个生物的进化。该区域包含一些高度保守的序列和一些可变的序列，允许在不同的分类水平上对生物进行比较。
一个rDNA单元包括三个rRNA基因:
•小核(类18s) rRNA，
•5.8S rRNA，和
•大核(28s样)rRNA基因。
在一个单元中，基因由两个内部转录间隔子(ITS1和ITS2)分开。两个rDNA单元由基因间间隔子(IGS)分开[23］．
系统发育分析表明，真菌王国是10亿年前大真核生物群体末端辐射的一部分[30.］．令人惊讶的是，尽管真菌学一直被认为是植物学的一个分支，但也有证据表明真菌王国与动物的关系比与植物的关系更密切[31］．对多种酶的氨基酸序列的分析表明，植物、动物和真菌最后一次有共同的祖先是在大约10亿年前，植物最先分化。32］．
依据:PCR引物从代表菌株中扩增特定基因，然后用限制性内切酶消化扩增产物，以筛选变异
不同寄主灵芝品种分析[33］
通过ITS+5.8S区PCR-RFLP对不同寄主的灵芝分离株进行了鉴定，分别为油棕中的G. boninense、橡胶中的G. philiplii和林木中的G. southern。用6种酶(Mspl、Bsu151、Hin61、hinii、Hinf1和Taq1)对ITS+5.8S区域进行酶切分析，结果表明，同一物种的酶切模式相似。ITS+5.8S区域PCR-RFLP聚类分析表明，来自同一寄主的灵芝品种聚类在一起。基于ITS + 5.8S条带PCR-RFLP的不同灵芝分离株树突图
enyloma属系统发育的rDNA意义[34］
Entyloma属的特征由de Bary(1874)形成，这些孢子的萌发具有tilletia样担子，并具有特征性的白色致密叶斑点。由于其生命周期，他将该属置于黑穗病真菌中，尽管该物种不产生深色的松散的端孢子。通过超微结构和分子数据确认了系统位置。许多以前在Entyloma中列出的物种已经被删除，现在被分为几个顺序。rDNA的LSU和ITS序列分析支持Entylomatales目的单系性。Entyloma callitrichis(现在的Doassinga callitrichis)被转移到Doassansiales。到Tilletiales(现在的Erratomyces patelii)。氟菌Entyloma fluitans(现在的Ustilentyloma fluitans)到微葡萄孢菌。斯帕甘菌Entyloma sparganii(现在的南长石菌sannfeldtiomyces sparganii)到Doassansiales
简单序列重复
利用简单序列重复或微卫星作为遗传标记已经变得非常流行，因为它们在不同个体之间的丰度和长度差异。SSRs是1 - 6个碱基对的串联重复单元，在许多原核和真核生物基因组中大量存在。利用已知序列的位点特异性侧翼区域引物，通过PCR检测单个位点的SSR长度多态性。
利用SSR多态性数据生成的皂角孢的形态树状图
在真菌的自然范围内，已经描述了四种型态的S. sapinea。在40个代表不同形态型的葡萄球菌分离株和2个近缘种Botryosphaeria obtusa分离株上测试了11个多态性SSR标记。假定的I型被发现与B. obtusa完全相同。标记清楚地区分了其余三种形态型，并表明C型与A型的亲缘关系比B型更密切。
简单间序列重复
ISSR是指微卫星位点之间的基因组区域。将相邻两个微卫星的互补序列作为PCR引物;它们之间的可变区域被放大了。
利用互简单序列重复分析黑穗病菌种间亲缘关系36］
在黑穗病真菌中，基于dna的分子技术在扩展确定这些真菌之间关系时所考虑的特征方面是有用的。利用简单间序列重复序列(ISSRs)研究了黑穗病菌(U. avenae、U. bullata、U. hordei、U. kolleri、U. nigra、U. nuda和U. tritici) 7个种间的系统发育关系。利用ISSR引物对54株不同的黑穗病菌进行了分析。除U. bullata外，所有种内分离株间变异均较低。U. bullata、U. nuda和U. tritici分离良好。U. avenae和U.kolleri分离株之间没有分离，这些种之间的差异很小。U. hordei和U. nigra分离株在种间的变异也不大，但各种分离株聚在一起。U. avenae和U. kolleri为单系，应视为一个种，U.hordei和U. nigra也应视为一个种。
•系统发育研究帮助重塑了真菌王国的分类。
•分子技术的进步为DNA分析纳入分类学开辟了道路，如RFLP, RAPD, rDNA分析，SSR和ISSR。
•这些技术更快、更具体、更准确。
•这些技术允许检测不可培养的微生物。
•它们有能力区分密切相关的生物。
•分子技术成为建立不同品种分类地位的重要工具。
