吡格列酮在四氧嘧啶诱导的糖尿病动物模型中的抗糖尿病作用再评价

摘要

这项研究包括吡格列酮的药理筛选，吡格列酮是一种治疗2型糖尿病的有效且常用的药物。一项体内研究包括三种动物模型，每组6只小鼠，一组为对照组或未经治疗，另外两组为四氧嘧啶，一组为药物治疗，以比较吡格列酮对糖尿病的药理反应。用四氧嘧啶诱导动物糖尿病。四氧嘧啶是一种β细胞毒素，化学上称为mesoxalylurea, mesoxalylcarbamide, 2,4,5,6 -四氧六氢-4-嘧啶或嘧啶四酮，已广泛用于动物体内诱导“化学diabetesâ”。与对照相比，吡格列酮可降低四氧嘧啶(70 mg/kg)诱导的糖尿病小鼠的血糖水平。

关键字

吡格列酮，抗糖尿病药，四氧嘧啶

简介

糖尿病是全世界一个日益严重的重大公共健康问题，估计1985年全球发病率为3000万，1998年为1.43亿，2000年为1.5亿，预计到2010年将增加到2.2亿，最近估计，到2025年，诊断患有2型糖尿病的患者人数将增加一倍以上，达到3亿[1］．1型糖尿病被称为胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)或青少年发病型糖尿病，2型糖尿病被称为非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)或成人发病型糖尿病。降糖药降低糖尿病动物血糖水平的机制不同。在不同的实验动物身上研究药物的这种特性有各种各样的模型。噻唑烷二酮类药物(TZDs或格列酮类药物)目前包括罗格列酮和吡格列酮，是治疗2型糖尿病的有效且常用的药物，是现有治疗方法的补充，是治疗算法的重要组成部分。在它们被引入的十年里，肥胖、糖尿病和代谢综合征的患病率呈指数级增长[2，3.］．

材料与方法

四氧嘧啶一水

用四氧嘧啶诱导动物糖尿病。四氧嘧啶是一种β细胞毒素，化学上称为mesoxalylurea, mesoxalylcarbamide, 2,4,5,6 -四氧六氢-4-嘧啶或嘧啶四酮，已广泛用于动物体内诱导“化学糖尿病”。它能破坏产生胰岛素的胰腺β细胞，从而导致动物患上糖尿病。四氧嘧啶和N取代的四氧嘧啶衍生物对胰腺β细胞具有选择性毒性，其他内分泌细胞和外分泌实质细胞即使在高浓度下也能完好保存[4，5］．

70mg /kg四氧嘧啶一水溶液的制备

精确称取0.7克一水四氧嘧啶，倒入100毫升注射用水中溶解四氧嘧啶。得到溶液浓度为7 mg/ml。

吡格列酮

吡格列酮是一种噻唑烷二酮类药物，主要作用是降低胰岛素抵抗。它们改善胰岛素敏感性的作用机制尚不完全清楚。它们是过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)的选择性激动剂。PPARγ受体的激活导致葡萄糖在脂肪组织、骨骼肌和肝脏[6]中转运到细胞的增加。

动物模型

动物模型选择前已经过伦理审批。体重29-36克5克的瑞士白化小鼠被用于目前的抗糖尿病筛查。动物们被关在聚丙烯笼子里。笼内垫料定期更换。实验室内温度保持在25C，人工照明。12小时亮片12小时暗片。常规的实验室饮食和水是免费提供的。

葡萄糖测定试剂盒(GOD-POD法)

本试剂用于血清或血浆中葡萄糖的定量测定。葡萄糖被葡萄糖氧化酶(GOD)氧化产生葡萄糖酸盐和过氧化氢。在过氧化物酶(POD)的存在下，过氧化氢与4氨基-安提芘(4- aap)和苯酚氧化偶联，生成红色喹诺亚胺染料，在505nm处测量。在505 nm处的吸光度与样品中葡萄糖的浓度成正比。

在505nm测量时，颜色溶液的吸光度与葡萄糖浓度成正比[7］．

活体动物研究

通过反向眼眶穿刺(ROP)方法去除血液

小鼠分为16组，每组6只，用苦味酸作标记。8他们被禁食18个小时，并随意提供水。18小时后，采用反向眶穿刺(ROP)采集空腹血样。采集从毛细血管流出的血液样本，放入装有抗凝血液约0.5-1毫升血液的瓶子中。

准备用Accurex葡萄糖Stat比色法测试神荚法

用酶比色法测定初始空腹血糖。按此方法，在1.5 ml微型离心管中抽取动物(小鼠)血液，在30分钟内以2800转/分的速度离心15分钟，分离血浆，取10μl样品转移到工作试剂管中，37℃或室温下孵育15分钟[9］．测量制备的样品(AS)或标准品(Astd)在505 nm处对空白的吸光度[7，10］．零分光光度计对水作空白。

确定结果如下:

As × Conc。标准/ Astd

葡萄糖(mg/dl) =

将结果转换为mmol/l，将mg/dl乘以10。

换算成mg/l，再除以180 (mol. wt.葡萄糖)

四氧嘧啶诱导动物的选择

血清葡萄糖水平(SG)较高(150 mg/dl)或较低(75 mg/dl)的动物被丢弃，而血清葡萄糖水平最佳(80 - 120 mg/dl)的动物被选择用于研究，并注射四氧嘧啶(70 mg/ kg)静脉注射。

给药四氧嘧啶一水溶液

四氧嘧啶溶液10 mg/ml静脉注射小鼠，剂量100mg/kg，根据动物体重诱导糖尿病。

选择研究动物

注射四氧嘧啶48小时后，采用反向眼眶穿刺法放血，采用GOD/POD法测定血容量。选择SG高于200 mg/dl的动物进行研究。共18只动物分为三组，即每组6只动物被选择进行研究，它们被分组如下

第一组车辆(蒸馏水;10ml /kg, p.o.)

二氧嘧啶(70mg /kg，静脉注射)

III组吡格列酮(30 mg/kg)

I组包括6只未使用四氧嘧啶或吡格列酮治疗的小鼠。

第二组，包括6只只给予四氧嘧啶的小鼠。

III组包括6只同时给予四氧嘧啶和吡格列酮治疗的小鼠。

口服药物管理

使用皮下注射针，弯曲30，距离针尖约1cm，针尖处量规变钝，以避免对口腔和食管内表面造成任何伤害。这是喂养套管。将套管连接到校准的注射器上。从注射器中提取所需剂量的药物溶液/悬浮液。去除气泡，重新调整溶液/悬浮液的体积。用一只手抓住老鼠的屁股，使它张开嘴巴。将喂食套管从牙内间隙插入，轻轻推入食道。调整套管所需位置，轻轻推动注射器活塞，给予准确剂量的药液。如果药物碰巧进入肺部，那么抓住动物的尾巴并悬浮在空气中。轻拍它的背，试着把药物从肺里排出。

剂量的制备和管理

试验化合物是口服的。以30 mg/kg体重的固定剂量逐步给药。[11，12动物在给药前禁食18小时，并免费饮水。给药3至4小时后给予小鼠食物[11，13］．

血液样本采集

分别于2、4、6、24 h采用反向眶穿刺法取血，采用GOD/POD法测定血容量。

计算SG、平均值和SD的变化百分比并制成表格。

血糖下降% =对照组BSL -药物BSL /对照组BSL

统计分析

采用四氧嘧啶诱导降糖法，紫外可见分光光度计测定不同时间间隔的BSL，评价其降糖活性。对所得数据进行单因素方差分析，然后进行Dunnet-t检验。结果以均数表示，各组的均数标准误差(SEM)，p<0.05为有统计学意义。

结果与讨论

吡格列酮可降低四氧嘧啶(70 mg/kg)诱导的糖尿病小鼠的血糖水平，与对照(蒸馏水，10 ml/kg, p.o.)治疗组相比(表1而且图1）.

结论

采用四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠法检测吡格列酮的抗高血糖活性。活动以血糖水平下降百分比的形式表示。采用单因素Dunnet“t”检验，比较各处理组的活性，并进行方差分析。总之，吡格列酮是一些相关抗糖尿病药物的有效替代品。

鸣谢

我们感谢副校长提供并允许进行室内实验。四氧嘧啶和吡格列酮是来自锡金zydus制药有限公司的礼品样品。

参考文献

1. 柳青，李志刚，李志刚。非肥胖糖尿病小鼠脾细胞移植自身免疫性糖尿病的研究。糖尿病。1986;35(8): 855 - 856。
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3. Ford ES，国际糖尿病联合会在美国成年人中定义的代谢综合征患病率，糖尿病护理，2005;28日:2745 - 2749。
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6. 吡格列酮(Actos)产品信息，武田制药，2002。
7. Juaristi, Eusebio, Gabriel Cuevas，《异位效应》，CRC出版社，1995;9 - 10。
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10. 卡希尔GF Jr，琼斯EE，劳里斯V.实验性糖尿病在韦尔斯利杂交小鼠的研究。2血清胰岛素水平与外周组织反应。糖尿病学。1967;3(2): 171- 176。
11. 朱卡尔LM, Ann NY。科学学院，1965;131: 447 - 449。
12. Michaelis OE, Patrick DH, hacker CT。Am J Pathol, 1986;123: 398 - 399。
13. Wise PH, Weir BJ, Hime JM, Forrest E.糖尿病学。1988;37: 1163 - 1165。