研究和评论:微生物学和雷竞技苹果下载生物技术杂志》上
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P - ISSN: 2347 - 2286
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秋菊张1#钟,应2#,Ji-Hua黄2,Qing-Dong谢1肖芳茶色1#钟,陈瑶3许,局域网1,Tian-Hua黄2*
1生殖医学研究中心,汕头大学医学院,515041年汕头,中国
2金鑫生殖医学研究所遗传学、成都锦江妇幼保健医院,成都610066年,中国的公关
3科学与工程学院,大学保罗Sabatier, 31062年,法国图卢兹
收到了01/03/2016接受13/05/2016发表23/05/2016
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目的:鉴于乙型肝炎病毒和乙肝病毒(HBV)可以感染人类精子细胞基因引入的精子可以转录在胚胎发育阶段,我们试图确定成熟的HBV抗原的存在和评估胚胎细胞的病毒基因的复制机制。方法:人类精子与重组质粒转染pIRES2-EGFP-HBs或pIRES2-EGFP-HBc,然后被用于zona-free黄金仓鼠卵细胞受精。Two-celled胚胎有或没有绿色荧光收集检测HBV DNA或蛋白质的荧光原位杂交(鱼),免疫荧光试验(IA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)。结果:1。积极的鱼信号为哈佛商学院和HBc-DNA观察精子核和核two-celled胚胎的测试样品但没有检测到控件。2。积极的IA信号HBsAg或HBcAg two-celled胚胎的细胞质内被检测出在测试样本而不是控制。3所示。利用ELISA,在单个two-celled HBsAg的水平胚胎0.064 ng / ml。同样,发现HBcAg five-embryo实验组。结论:sperm-introduced HBV S或C基因能够通过半保留复制与此同时宿主胚胎基因组DNA复制和模式能够表达在胚胎细胞病毒蛋白质。
乙肝病毒基因;HBcAg;表面抗原;精子;胚胎,复制,翻译
乙型肝炎病毒(HBV)感染是一种严重的健康问题。世界卫生组织(世卫组织)估计,约有500 000 000人慢性感染乙肝病毒和丙肝病毒。每年大约1 000 000人死于(~ 2.7%的死亡)原因与病毒性肝炎、肝癌最常见的肝脏疾病,包括(1]。通过输血(乙肝病毒的传播途径2),体液(即。,serum, saliva, vaginal secretions, breast milk, and semen) [3- - - - - -6),宫内感染(6),细胞、组织和器官移植7,8),和其他机制包括血液透析单位,静脉注射毒品注射和职业暴露9,10)已被记录。的传播途径致病的病毒被识别出来,病毒威胁人类健康的严重程度可以减少采用有效的预防措施。新,但不明,传播途径构成潜在风险更大,因为即使病毒宿主,目前预防措施可能无效的阻止这些新路线。
1977年诺贝尔演讲,布隆伯格博士建议乙肝病毒可以进入细胞核的主机和垂直传播的遗传物质(11]。随后,Hadchouel等确定综合HBV DNA序列的存在精子从两三个患者乙型肝炎病毒感染(12]。王等人研究了血清收集来自16个父亲/婴儿对父亲是已知的乙肝病毒携带者,而母亲为乙肝病毒标志物阴性。他们发现98 - 100%和99 - 100%的同源性乙肝病毒表面或信封(核苷酸451 - 660)和乙肝病毒核心C(2022 - 2301)核苷酸基因序列,分别在父亲和婴儿(13,14]。这是假设的存在综合序列在精子可能通过生殖细胞系促进乙型肝炎病毒的垂直传播,但到目前为止没有人证实了他们的假设。必须解决两个主要的问题在测试这个假说。首先,人类精子窝藏HBV基因成功地遍历卵膜和进入卵母细胞的呢?第二,这些sperm-introduced乙肝病毒基因复制和表达病毒在胚胎细胞信使rna和蛋白质吗?种间zona-free黄金仓鼠卵的体外受精人类精子已广泛应用于生殖生物学的研究(15),曾用来提供直接证据表明,HBV DNA可以集成到病人的精子染色体和这些人类精子携带乙肝病毒基因可以通过卵膜,导致正常的受精(16]。受精后,sperm-introduced HBV S和C基因转录成病毒mrna在胚胎干细胞(17]。然而,目前尚不清楚是否sperm-introduced HBV S和C基因保留他们的能力复制在胚胎细胞和蛋白质表达。
乙型肝炎病毒S基因病毒包膜蛋白编码的结果在三个不同的亚型的表达,合成在所有患者中,称为大,中间,和主要的蛋白质。一些抗原决定因素,包括“一个”行列式,共有乙肝抗原(表面),以及“d”、“y”,“w”,和“r”因素,是流行病学的关键因素。乙肝病毒C基因编码乙型肝炎核心抗原(HBcAg),这是封装了病毒DNA的核衣壳蛋白。当表面HBcAg-derived肽表达肝细胞,他们产生细胞免疫应答,是至关重要的检测和杀死感染细胞(18]。因此,当前的研究是探索spermintroduced HBV S和C基因是否保留他们的复制和表达能力成熟的胚胎细胞的蛋白质。
伦理批准
精液样本来自健康的捐赠者。书面知情同意了所有科目允许使用他们的精子样本为研究目的,在明确了解研究的目标和他们的权利。所有人类和动物有关的协议用于本研究的受试者汕头大学医学院伦理委员会的批准(批准文号:sumc - 00 - 0031)的机构伦理审查委员会和成都锦江妇幼保健医院(批准文号:cjhmchc - 0010)根据推荐的指南涉及人类受试者的国家健康研究所和动物保健和1975年的赫尔辛基宣言。
主题
三个健康男性在20到22岁之间选择,接受常规体检包括实验室测试,胸部x光检查,心电图,尿液和粪便测试,HEENT(头部、眼睛、耳朵、鼻子和喉咙)评估。所有三个人-为乙肝病毒标志物评估使用抗原抗体结合试验,提出了正常精液参数根据世界卫生组织的实验室手册。
质粒和媒体
重组质粒的pIRES2-EGFP-HBs和pIRES2-EGFP-HBc前所述[19]。Biggers-Whitten惠廷汉姆(BWW)中补充0.3%牛血清白蛋白(BSA,西格玛化工有限公司,圣路易斯,密苏里州,美国)是为人类精子准备准备,收集卵母细胞,受精和后续处理。卵子培养基(OCM、流动实验室、德国)heat-inactivated含10%胎牛血清用于post-insemination文化。
准备的人类精子
精液样本来自健康男性没有乙型肝炎病毒感染和孵化有限公司2孵化器(37°C, 5%的公司2在空气中)30分钟允许液化。能动的精子游过方法,被收集的600 x g离心5分钟。精子在BWW re-suspended中有0.3% BSA和离心机。精子洗涤re-suspended在5毫升10μM 8分钟促进精子获能的离子载体解决方案,洗两次,然后悬浮在BWW 3.5% BSA完成精子获能。
接触精子的质粒pIRES2-EGFP-HBV
后2.5 h孵化精子转染重组质粒。简而言之,100年μl混合物1μl pIRES2-EGFP-HBs(或pIRES2-EGFP-HBc)(1.5μg /毫升),6μl脂质体,和93年μl消息灵通的缓冲盐在室温下孵化了15分钟,随后添加到精子,然后返回到孵化器为另一个1.5人力资源。转染精子被洗五次在5毫升BWW媒介。
制备金仓鼠卵母细胞
成熟的仓鼠是诱导如何让40 IU的腹腔注射超量排卵怀孕母马血清促性腺激素(PMSG,宁波激素产品有限公司,宁波,中国),发情周期的第一天。72小时后,仓鼠是注射,腹腔内40 IU人体绒毛膜促性腺激素(hCG、宁波激素产品有限公司)。Super-ovulated收集卵母细胞的肝区输卵管17 hr hCG注射后,摆脱了积云细胞0.1%透明质酸酶(西格玛化工有限公司)。BWW Cumulus-free卵母细胞被洗两次中有0.3% BSA治疗2分钟0.1%胰蛋白酶(西格玛化工有限公司)在室温下的透明带,然后洗两次与0.3% BSA BWW介质。
受精和Post-insemination文化
使用精子授精了悬浮液的浓度106生产精子/毫升。卵母细胞在精子悬架20 - 30分钟,然后转移到孵化BWW中有0.3% BSA在矿物油(西格玛化工有限公司)为另一个40分钟,以确保精子穿透。在OCM洗两次后,每个组包含五个卵母细胞,分别培养在滴下的OCM(60μl每个)石油在塑料培养皿中保存在一个有限公司2孵化器(37°C, 5%的公司2在空气中)24小时。
准备的胚胎
二十四小时在受精之后,两个阶段的胚胎表达绿色荧光蛋白的荧光显微镜下选择(Axiovert 40节能灯、Zeizz、德国),洗了三次冷1 x磷酸缓冲盐(PBS)删除从血清培养基,并用于鱼、免疫荧光试验、ELISA。
标签的HBV DNA探针和鱼
包含哈佛商学院和负担沉重国家基因组DNA的重组质粒,分别被用来扩大各自的HBV基因如前所述[20.]。短暂,哈佛商学院和国家的DNA被放大,分别通过PCR和纯化使用Uniqu - 10-PCR产品净化设备(西贡、上海、中国)。哈佛商学院和HBc-DNA探针通过尼克贴上biotin-14-dATP翻译(BioNick DNA标记系统、GIBCO BRL沃尔瑟姆,妈,美国)。非公司核苷酸被冷乙醇沉淀去除。
鱼和检测杂交探针进行如前所述[16]使用荧光显微镜(DM2500、徕卡、德国)与世行激发过滤器。
免疫荧光分析
two-celled胚胎在PBS和4%多聚甲醛固定在室温下15分钟,然后用混合含有0.5% Triton x - 100, 0.5毫米MgCl2, EGTA 5毫米,和50μM甘氨酸在室温下15分钟。固定胚胎放置在屏蔽解决方案包含2%胎牛血清,10%正常山羊血清在0.1% PBS 4°C 1小时,然后分成三组:a组和B与主anti-HBsAg或anti-HBcAg孵化抗体一夜之间在4°C, C组分别与PBS为负控制孵化。在PBS洗涤三次5分钟后,所有的样品都孵化biotin-labeled正常山羊血清(1:10 0稀释)37°C 1小时,然后洗了四次在PBS propidium碘(0.1毫克/毫升)染色5 - 10分钟。DABCO (1, 4-Diazabicyclo[2.2.2]辛烷)是用作anti-fade试剂。
化验检测乙肝病毒蛋白进行了根据生产指令使用HBsAg酶联免疫试剂盒(英特产品有限公司、厦门、中国)。标准曲线生成使用CurveExpert(1.3版)和表面抗原水平是根据标准曲线计算。
Two-celled胚胎被分为三组,包含一个,两个,分别或五个胚胎。蛋白质提取后,化验检测HBcAg根据制造商的说明进行使用HBcAg酶联免疫试剂盒(北京医学生物技术有限公司,北京,中国)。
质粒pIRES2-EGFP-HBV和两个胚胎
因为质粒pIRES2-EGFP-HBs(或pIRES2-EGFP-HBc)包含了哈佛商学院基因(或国家的基因)和一个增强绿色荧光蛋白(EGFP)记者构造为哈佛商学院(或国家)的基因表达,可以区分的胚胎有或没有哈佛商学院(或国家)的绿色荧光基因的胚胎卵母细胞的受精后精子转染pIRES2-EGFP-HBs或pIRES2-EGFP-HBc质粒。共有62个荧光胚胎被确定从258年收集的胚胎,指示一个总体的效率约为24%。
哈佛商学院的杂交信号或负担沉重的细胞核DNA被发现在部分精子转染thepIRES2-EGFP-HBs或pIRES2-EGFP-HBc质粒(图1)。哈佛商学院或国家的DNA的杂交信号同样观察到两个人的核two-celled胚胎表现出绿色荧光(图2和3),但没有观察到负控制没有可检测绿色荧光。
图1:鱼的结果人类精子经过重组质粒转染pIRES2-EGFP-HBs或pIRES2-EGFP-HBc x 1000。答:没有乙肝病毒DNA信号负控制传染源。B: pIRES2-EGFP-HBs-transfected精子展示一个积极的信号精子头部的哈佛商学院的DNA(箭头所指)。C: pIRES2-EGFP-HBc-transfected精子DNA显示一个积极的信号HBc精子头部(箭头所指)。结果表明,哈佛商学院和负担沉重的DNA序列已经集成到精子基因组。
图2:鱼的结果two-celled胚胎,x 1000。没有检测到信号HBs DNA内醚的two-celled胚胎细胞核控制样本。B:哈佛商学院的积极信号的two-celled胚胎细胞核DNA在每个实验样本(箭头)。B1和B2:增加每个原子核在B部分的放大,结果表明sperm-introduced HBs的复制基因半保留的和同步与宿主基因组,和两个病毒基因隔离复制到两个子细胞在第一次卵裂。
图3:鱼two-celled胚胎的结果,1000 x。没有检测到信号HBc DNA内醚的two-celled胚胎细胞核控制样本。C:国家的积极信号的two-celled胚胎细胞核DNA在每个实验样本(箭头)。C1和C2:增加放大每个核的部分c sperm-introduced负担沉重的结果表明,复制基因半保留的和同步与宿主基因组,和两个病毒基因隔离复制到两个子细胞在第一次卵裂。
免疫荧光检测表面抗原和HBcAg
免疫荧光分析的结果对HBsAg和HBcAg所示图4和5。清晰的表面和HBcAg信号被检测到细胞质内胚胎细胞从各自的实验受精,而没有检测到细胞质内的积极信号控制胚胎干细胞。
图4:免疫荧光分析的结果,x 1000。不积极的信号检测胚胎细胞的细胞质内控制样本。B: HBsAgare的积极信号检测到细胞质内的胚胎细胞在实验样品(箭头)。C: HBcAgare的积极信号检测的胚胎细胞的细胞质内实验样品(箭头)。结果表明,sperm-introduced哈佛商学院和国家的基因能够expressHBsAg和HBcAg胚胎细胞。
图5:标准曲线检测表面抗原(由CurveExpert)。标准中0.0125 - 3.2 ng / ml的浓度范围导致OD成比例450年测量。回归分析导致方程Y = 0.357 x -0.00068相关系数(R20.99897)。根据标准曲线,HBsAg检测到的平均数量在一个two-celled胚胎大约是0.064 ng / ml。
two-celled胚胎表现出绿色荧光被选在荧光显微镜和ELISA进行建立标准曲线计算乙肝表面抗原在单个胚胎和检测水平的存在HBcAg组包含一个,两个,分别或五个胚胎。HBsAg个人two-celled胚胎的平均浓度为0.064 ng / ml,根据标准曲线。HBcAg,相比之下,只有five-embryo实验组和试验中发现积极的控制,但不是一个实验组,two-embryo或消极的控制。未能检测到HBcAg——和two-embryo组可能是由于低水平的HBcAg测试单个细胞的胚胎,这仍低于阈值相结合的检测具体的分析。
它已经表明,乙肝病毒可以感染精子和精子可以检测出病毒DNA核(12,21,22]。在初步实验中,鱼的HBV DNA可以检测到信号HBV-transfected HBV-infected患者的精子捐赠者的精子相似(16]。因此,捐赠者的精子与质粒转染pIRES2-EGFP-HBs或pIRES2-EGFP-HBc代替病人精子在当前的研究中,从而能够区分胚胎有或没有乙肝病毒基因的表达绿色荧光蛋白转染精子和卵母细胞的受精后确定转染乙肝病毒的抗原性或C基因。
复制Sperm-introduced HBV S和C基因在胚胎细胞
乙肝病毒基因组是一个圆形的基因组约3.2 kb大小,由主要是双链的DNA。它有一个紧凑的组织,有四个开放阅读框(年代,表面,或者信封,基因;C,核心基因;X, X基因;聚合酶基因和P)运行在一个方向,没有非编码区域(18]。乙肝病毒是经济的利用其遗传物质;这是通过两个罕见的遗传性配置:蛋白质编码从重叠的翻译框架,所有的监管信号序列驻留在蛋白质编码序列。这种不同寻常的配置导致乙肝病毒的提议由一些科学家可能不会使用一个保守的DNA复制机制(18,23]。然而,使用与特定哈佛商学院——鱼HBc-DNA探针,分别,我们发现信号为哈佛商学院或国家的DNA可以发现一些转染人类精子核,表明HBV S和C基因整合到精子基因组。受精后,个人two-celled胚胎与绿色荧光有积极的信号在两个原子核哈佛商学院——或者HBc-DNAs,分别表明sperm-introduced HBV S或C基因能够复制与宿主胚胎基因组,和两个病毒基因隔离正常复制到子细胞在第一次卵裂。这是半保留复制和同步方式与规范乙肝病毒的宿主基因组和完全不同的生命周期。乙肝病毒隐藏在宿主基因组序列的后果由集成和半保留复制揭示乙肝病毒的潜在的新传播路线,可能诱发染色体异常,增加流产的风险,死胎或出生缺陷和可能增加原发性肝细胞癌的风险。
翻译Sperm-introduced HBV S和C基因在胚胎细胞
用免疫荧光化验,HBsAg HBcAg蛋白质检测胚胎细胞的细胞质内。这些结果表明,sperm-introduced HBs和国家的基因能够表达在胚胎细胞病毒蛋白质。
现在认识到宿主免疫反应的病毒抗原显示在被感染的肝细胞肝细胞损伤的主要因素(23]。病毒抗原含有高度抗原决定负责触发免疫反应,引起肝细胞炎症。在当前的研究中,已经证实sperm-introduced哈佛商学院和国家的基因与主机同步复制基因组和主管在蛋白质表达。如果哈佛商学院和国家的序列隐藏在宿主基因组中可以表达抗原,这些病毒抗原可能导致肝细胞炎症引发免疫反应。这种情况代表了一个新的机制,完全不同于乙肝病毒感染的典型模式。
综上所述,我们已经表明,第一次直接实验证据sperm-introduced HBV S或C基因能与主机同步复制胚胎基因组DNA复制的半保留的模式,并能表达在胚胎细胞病毒蛋白质。结合我们之前研究的结果(16,17,19),我们已经表明,乙肝病毒基因可以垂直传播通过男性生殖细胞系的后代,和这些基因保留他们的能力被复制,转录和翻译。然而,乙肝病毒基因不是相当于HBV病毒粒子,因此需要进一步研究来证实乙型肝炎病毒的垂直传播机制通过男性生殖细胞系。
作者感谢林教授斯坦利协助修改手稿的最终稿,感谢美国专家(AJE)杂志》英文编辑。
