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P - ISSN: 2347 - 2286
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收到日期:2015年7月10日;接受日期:2015年9月21日;发表日期:2015年9月24日
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多resistant-Mycobacterium结核病(mdr - tb)的出现,尤其是Rifampicin-dependent (R)耐多药结核病,已经成为一个热点问题。阐明潜在机制rifampicin-dependent耐多药结核病(潜伏性感染)利用其长期生存,我们研究了形态和l形rifampicin-dependent耐多药结核病的增长模式。Rifampicin-dependent耐多药结核病是孤立的病人从新鲜痰和显示Rifampicin-containing有利的发展条件。相反,当R-MDR-TB Rifampicin-depleted培养基培养,细菌生长停止和耐多药结核病转化为l形细胞。这个转换过程研究历时三周,光学显微镜和透射电子显微镜(TEM)。在一周,R-dependent细菌培养rifampicin-null条件下表现出抗酸的正面煎蛋殖民地,支原体状的形态。在星期2,R-dependent耐多药结核病的表现形态是:抗酸的积极的丝状,颗粒球体,细胞膜糖衣(丝状颗粒聚合)和原生质各种大小和形状。R-MDR-TB在星期3的形态:半透明菌落和巨大的球体,细丝,原生质,煎蛋的殖民地,“支原体(丝状伪足)”。这些形态典型、有代表性的l形细胞增长的特征。这些发现揭示rifampicin-dependent耐多药结核病的l形增长首次和阐明rifampicin-dependent耐多药结核病的潜在机制长期生存(潜伏性感染)。 This data will help to provide a foundation for novel early diagnosis and effective treatment of R- MDR-TB.
L-phase细菌,Rifampicindependent细胞壁缺陷、生殖模式、休眠孢子。
耐多药- - - - - -结核分枝杆菌(mdr - tb)已经成为主要的传染性肺结核菌株。研究表明,R-dependent耐多药结核细菌遍布(毒性增强)有利利福平浓度,但增长缓慢(或转换成l形)在un-favorable利福平浓度条件下(1]。作为结果,结核病患者感染R-dependent菌株将会有更糟糕的结果如果用利福平治疗或更强的利福平治疗方案。如果这些患者接受药物治疗方案没有利福平,他们的状况将会改善2]。这rifampicin-dependence现象也验证了小鼠模型(3,4]。
中国结核病专科医院和机构最近的数据表明,R-dependent菌株占36.7%(258/703株/年)和39.1%(18/46)的结核病例在重庆和北京,分别为(3,5]。对付耐多药结核病可能由于l形细菌的出现。l形细菌,也称为:L-phase细菌,L-phase变体,和细胞wall-deficient(鹿)细菌的菌株,缺乏细胞壁(6]。的l形细菌可能没有细胞壁的生长和繁殖,因此他们提出收购的重要细菌抗生素抗性基因和潜伏结核感染的原因。
我们以前的研究表明,当古典R-dependent结核病是培养没有利福平,l形的细菌显示特征变换(7]。在我们目前的调查,观察,研究,首次证实R-dependent MTB可以形成L-phase细菌。这可能是根本原因R-MDR-MTB潜伏性感染。此外,结核病的研究l形增长模式将有利于调查其他病原菌转变成l形。
痰液源-新鲜标本收集的临床诊断肺结核患者在重庆肺医院。男,70岁,临床诊断左右上角的降低继发性肺结核涂片阳性(+)再处理时间40 +年;二型糖尿病(15年以上)持续时间。这对于抗酸染色孤立的应变测试。L-J临床绝对浓度法用于检测利福平持久性和形态8]。很多次结果显示耐多药异烟肼、利福平、链霉素等。结果还显示R-dependent增长从而确定R-dependent耐多药结核病。rpoB基因进行了分析,结果显示Ser-Leu rpoB 531位点突变(9]。
研究方案和仪器经重庆传染病医学中心和肺部医院伦理委员会。参与者提供了他们的口头知情同意;书面同意并不是获得,告知口头同意被认为是足够的。病人的同意被记录为医学报告的一部分。委员会批准同意。
细菌培养法,BACTEC TB460 12 b文化和应变识别系统(美国BD公司)。洛温斯坦詹森(LJ)文化、灵敏度和应变识别进行根据“结核病细菌学检验程序”10]。
R-Strain筛选- - - - - -L-J临床筛查是用来测试利福平持久性和形态。
动态分析-实验样本典型的“rifampicin-dependent耐多药结核病”新鲜痰病人隔绝,与抗酸的确认的12 b液细菌培养阳性染色,并行,悬浮细菌接种在0.1毫升LJ R0, LJ R250 10管,370 c的文化。每周殖民地经济增长由专利评估原位印设备,以避免破坏细胞壁的原结构(专利号201420676756.3)。细菌培养管的形态和结构特征进行了分析,证实了通过电子显微镜。同时,的存在结核分枝杆菌被6110 PCR证实。的结核分枝杆菌王是6110 PCR分析是由上海金使用生物有限的商业工具。抗酸染色,整个幻灯片上覆盖使用染料,与coldcycling一步完成10分钟或更多。为了防止污染,清洗和漂白过程被用来避免waterstained直接影响区域的样本。在室温下幻灯片被风干。
光学显微镜分析-低放大倍数是用来观察细菌的笨重的形式。获得详细的形态,我们使用大功率显微镜定位和油浸镜头。我们也观察L-J R0相比和L-J R250管细菌形态学差异。
TEM分析-第二军医大学细胞生物学系提供jem - 2000 ex透射电子显微镜分析服务。比较结构分析是基于细菌在光学显微镜发现的特殊形式。
病人的痰仍阳性分枝杆菌甚至在250μg /毫升利福平,指示rifampicin-dependent耐多药结核病的一种现象。结果总结在应变特征图1。从病人的痰液细菌Rifampicin-containing条件下表现出良好的增长,但增长成为逮捕和细菌转化为l形形态在Rifampin-depleted条件。
图1:临床孤立R-dependent细菌的特征。(一)L-J文化菌落形态:R-containing管殖民地(左)显示粗糙,提高,共同作用;R-depleted管殖民地(右)很小,平坦,鸡蛋,l型形态。(B)抗酸的染色(100 x放大):R-containing管殖民地(左)显示厚,黑暗染色质染色颗粒很明显,典型的形态;R-depleted管(右)小细胞染色质浅,染色颗粒不明显或丢失;并不会形成典型的形态。(C)TEM形态:R-containing管殖民地(左)显示清晰的细胞结构,细胞壁的完整性,平滑的边缘;R-depleted管殖民地(右)显示模糊的细胞结构,密集的凝结核和细胞质,细胞壁缺陷。
进一步研究动态细菌L-morphological过程及其增长,rifampicin-dependent MTB培养在R-depleted媒介三个星期。时间进程原位平板抽样方法用于样本细菌培养。细菌的特点分析了透射电子显微镜(TEM)分析和辅助抗酸的染色和显微镜。确认结核分枝杆菌菌株是,MTB 6110 PCR分析也表现和结果显示。结果中描述图2- - - - - -4。
图2:抗酸的染色和PCR分析。(一)一周的细菌培养在R-depleted管显示acid-positive鸡蛋殖民地(100 x放大);(B)MTB 6110 PCR分析证实了细菌在结核分枝杆菌R-depleted文化。如图所示,车道1是消极的控制,巷2是R-containing管细菌,巷3是R-depleted管细菌和巷4是积极的控制。
图3:第二周的抗酸的染色和TEM分析R-depleted文化。(一)显微镜观察(100 x放大)的抗酸的染色阳性纤维后两周R-depleted细菌培养的条件。(B)巨大的抗酸的阳性颗粒。(C)抗酸的染色积极巨大的丝状组织。(D)TEM分析表明丝状形态。(E)纤维的横截面。(F)TEM分析表明细菌的内生孢子形态。
图4:TEM分析和抗酸的染色的第三周R-depleted文化。(A)和(B) TEM分析巨大的球形颗粒与糖涂层(B),表示成熟的细菌。(C)巨大的颗粒被证明能抗酸的染色阳性结核分枝杆菌(MTB)。
中的,抗酸的正面煎蛋殖民地出现在星期1,表明结核分枝杆菌的特性。在星期2,acidfast积极丝状,颗粒球体,和原生质机构与各种大小和形状出现,表明l形细菌的生长。在最后一个星期,星期3,光滑的半透明的殖民地,巨大的球体,观察“支原体(丝状伪足)”。TEM分析还揭示了糖衣。所有这些观察结果表明,MTB已经成熟到l形细菌在了3周的时间,因此接受了新的繁殖周期。
结核分枝杆菌的增长模式R-dependent R-depleted环境了图5。
图5:拟议中的结核分枝杆菌l形的复制模型。
在目前的研究中,我们直接从结核病病人孤立rifampicin-dependent耐多药结核病,体外培养细菌,研究其形态和生殖模式。第一次,我们清楚地观察到rifampicin-dependent耐多药结核病与专利变换成一个l形3周期间培养没有利福平。
细菌l形转换,即不存在刚性墙是一个公认的现象,但在自然界中很难观察11,12]。虽然L-forms各种细菌标本的观察病人几十年来,大多数被忽略,普遍被视为染色工件或碎片,直到最近。我们识别和描述这一种独特的繁殖的耐多药结核病[13- - - - - -15]。
各种各样的论文首次报道分枝杆菌l形变换体外,使用抗生素等因素,氨基酸、肽聚糖等诱导的变化(16,17]。我们的研究是第一次观察l形变换在样品和文化取自R-dependent耐多药结核病患者。在这项研究中,显微镜分析结合分枝杆菌抗酸的特征确定l形细菌的存在。此外,电子密度在TEM与蛋白质和RNA含量的水平相关联的细菌类核即核质量,也表明了电子密度与细菌的成熟程度有关。基于所有的发现,我们总结结核分枝杆菌l形的增长方式如下,图5。当rifampicin-dependent耐多药结核培养在没有利福平的情况下,(不适合他们的增长),细胞壁合成停止。在一个方面,原生质(无色细胞质)增殖,从而使细胞膨胀,然后聚集在一起作为一个巨大的球体(DNA复制或独立的领域)。原生质体单元进一步合成基因和蛋白质,组装成一个完整的L-particle(细胞),形成巨大的球形粒子。最后,成熟的形式(颗粒或纤维)释放的巨大球体,开始一个新的育种周期。在另一个方面,细胞壁合成停止,细胞也可以一分为二单个细胞或直接原位繁殖。这形式大支原体和丝状组织,允许对出芽或形成内生芽孢杆菌孢子或免费的味蕾。这些发现表明,无论原生质繁殖或二分裂繁殖,rifampicin-dependent耐多药结核病l型细胞能够繁殖。
l形变体的增长模式显示了一些酵母出芽方式相似,或病毒selfreplication和发布方式。1996年,DeMaio et al克隆一个σ因子基因(18]。这个基因编码的蛋白质相似的蓝色丝绸细菌和枯草芽孢杆菌孢子形式因素(SigF),还有一个枯草芽孢杆菌压力反应因子(SigB)。σ因子基因的mRNA高度表达培养牛结核病消耗氮或冷冲击,但不是在对数期(19]。这些数据表明SigF的表达在耐多药结核病的细菌可以帮助准备和适应宿主防御反应或阻力。
在我们的研究中,我们发现结核分枝杆菌l形可以形成内孢子(休眠孢子)。内生孢子是一种独特的阻力可能由革兰氏阳性细菌在一定条件下(20.]。显然我们的研究发现,内孢子形成结核分枝杆菌文化。这些发现强调R-dependent MTB治疗的困境。一方面,这种疾病会恶化如果病人感染了结核分枝杆菌R-dependent用利福平治疗方案。另一方面,如果病人没有利福平治疗方案的l形将开始增长,导致潜伏性感染。这个假设的结果验证了我们rifampicin-dependent结核病病人从未完全恢复这个病人这种疾病。作为另一个验证的假说,我们也进一步证明了观测,l形细菌(抗酸的染色积极巨大的球体)在其他患者痰液样本。MDR-MTB细菌转变成l形可能根本原因MDR-MTB很难完全消除和治疗。
总之,我们的研究结果揭示潜伏结核感染的潜在机制和长期生存。我们的研究结果也适用于开发策略,控制耐多药结核病l形变体的增长。
我们感谢中易胡博士,从上海结核重点实验室的支持。
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