农用工业废弃物生物生产虾青素的响应面法及树状叶黄菌固态发酵生长动力学

摘要

在这项研究中，固态发酵对三种不同的农用工业废弃物进行了虾青素色素生物合成的研究Xanthophyllomyces dendrorhous(写明ATCC 24202)。发酵采用响应面法对条件进行建模和优化。小麦、扁豆和水稻废弃物中虾青素含量最高，分别为109.23 μg AX/gdw、100.25 μg AX/gdw和66.03 μg AX/gdw。90%水平的水分含量是所有发酵系统的最有效参数。在最优条件下，对优化的废物小麦进行葡萄糖消耗、细胞和产物形成的生长动力学研究，并对实验数据进行建模。计算了各动力学参数的产率系数来表示产量。固体发酵的建模、优化和动力学研究以及废物的抗氧化能力均满足上述要求。

关键字

农用工业废物，虾青素，动力学，优化

简介

虾青素色素的生物生产具有不容置疑的生物学和商业意义，研究和开发该工艺是其研究的重点。固态发酵(SSF)由于能够为目标产品提供天然特性，是研究人员普遍首选的方法，但在用农业生产虾青素时却发现存在问题工业废物。这主要是由于发酵对生产有严重影响[1］．

土耳其在国际农业社会中占有宝贵的地位，因为它生产和加工大量的农作物并生产谷物和豆类废料，这些废料需要作为增值产品加以利用。谷物和豆类的废物是在收获后的操作和工业加工后获得的。秸秆、谷壳、麸皮、粗面粉和膳食粉属于谷物工业的农业废弃物(或作物残余物)。它们在发酵系统中提供效率和生产力方面的利用对系统的成本和产品收率具有重要意义[2，3.］．

能够大规模生产微生物色素的工艺必须阐述清楚。由于其巨大的经济潜力，在加工食品中使用的微生物色素的大规模生产中有一些关键因素，即;1)实验设计，2)培养基组成，3)发酵培养基及条件优化，4)研究统计评价[4-6］．然而，在响应面法(RSM)的框架下，利用SSF技术从谷物和豆类废弃物中生产虾青素的研究尚缺乏。此外，目前还没有对固态发酵动力学进行评估的研究，这是一个由于中等固体度、均匀性和分离问题而难以确定的实体。

本研究以小麦、扁豆和水稻为原料，对虾青素色素的生产进行了研究酵母。主要目的是优化发酵参数和确定动力学参数。

材料与方法

酵母培养和样品制备

Xanthophyllomyces dendrorhous(ATCC 24202，冻干形式)购买自美国类型文化收藏(马纳萨斯，美国)。在20°C的YM(酵母和麦芽提取物)肉汤和YM琼脂中保存。组合物为:3 g/L酵母提取物(Merck, Germany)， 3 g/L麦芽提取物(Merck, Germany)， 5 g/L蛋白胨(Merck, Germany)， 10 g/L葡萄糖(Sigma-Aldrich, Germany)和20 g/L琼脂(Merck, Germany)。由土耳其加齐安泰普(Gaziantep)提供的小麦、扁豆和大米废料被筛至0.85毫米大小，以便为发酵系统获得均匀的材料。

近似分析

pH值计(NEL pH890，土耳其);干燥箱含水量(RT 500 W.C. Heraeus Hanau，德国);燃烧炉灰分(MF 120 Nüve，土耳其);蛋白质通过消化单元(DK6 Velp scientific，欧洲)和蒸馏单元(Kjeltec 2200 Foss，瑞典);用索氏仪(SER 148 Velp scientific, Europe)对原料和发酵物进行重复分析[7］．苯酚-硫酸[8方法采用双束紫外/可见分光光度计(美国Lambda 25紫外/可见分光光度计)分光光度法测定原料和发酵物的糖含量。

发酵体系及色素分析

每种废物发酵使用250 mL Erlenmeyer烧瓶。100 g瓶中含量用高压灭菌器(HMC HV-85L，德国)在121℃下灭菌15分钟，然后接种2%的新鲜培养物。在设计温度下孵育12天，为前期研究确定的发酵期。

将5克发酵物和20毫升纯甲醇(Sigma-Aldrich, Germany)混合放置2小时。离心(6000 rpm, 10 min)后，上清液在474 nm对纯甲醇空白[9]进行分光光度分析。虾青素量计算与标准曲线和结果解释为三次测量的平均值。

建模与优化

BBD (Design-Expert Version 7.1.5, Minneapolis, USA)使用三个自变量生成:水分含量(M.C.)，温度(T)和pH值，基于酵母的最佳生长条件(80% M.C.， 20°C T, 4.5 pH值)。17次，5个中心点(表1)进行。在Design-Expert程序的RSM范围内，对发酵体系的数据进行回归分析和方差分析。

y =β_o+β_{1 x1}+β_{2 x2}+β_{3 x3}+β_{12 x1x2}+β_{13 x1x3}+β_{23 x2x3}+β_{11 x11}+β_22日将+β_{33 x33}Eq。(1)

表1:三种废物的BBD设计矩阵及响应结果aAX:虾青素，gdw:克干废物。

RSM建议的二次模型(Eq. 1)如上所示，其中y为响应或因变量;βo为模型常数;β₁,β₂,β_3.为线性系数;β12、β13、β23为交叉积系数(表示变量间的相互作用);β₁₁,β₂₂,β₃₃是二次系数[10];温度x₁，含水率x₂， pH x_3.都是自变量。

抗氧化能力测定

以DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼基)自由基清除活性测定原料和发酵物的抗氧化活性[11］．用纯甲醇(Sigma-Aldrich，德国)填充50 mL的5克样品(Innova 40R New Brunswick Scientific，美国)，以250 rpm和30°C的速度摇2小时，以清除。过滤和离心后的提取液与60 μM DPPH自由基(Sigma-Aldrich, Germany)在甲醇中混合。该反应是在黑暗和室温以及与对照样品(水)进行的。测量在517 nm处进行，AC值由下式计算(式2):

AC%=((对照ABS -提取物ABS))/(对照ABS) × 100 Eq. (2)

动力学研究

产物形成(虾青素生产)，酵母生长(细胞数量)和糖(葡萄糖)消耗参数在发酵期间进行优化。参数由SigmaPlot Version 11.0(伦敦，英国)程序建模，该程序定义了逻辑方程[12]用于酵母生长和产物形成(公式3)，通过使用葡萄糖消耗的logistic-3参数方程(公式4)。

y=a/(1+(a/b)−1)×exp(−m×x)) Eq. (3)

其中y为响应，a、b为细胞数或虾青素量，m为斜率，x为时间。

y=a/(1+(g/m)b)式(4)

其中y为响应，g为葡萄糖量，a和b为系数。

生物转化的定量描述由产率系数−Yp/s(产物/底物)、Yx/s(细胞数/底物)和Yp/x(产物/细胞数)决定。它们在数学上是指动力学参数的初始值和最终值之间的差值。

结果与讨论

建模与优化

对利用农用工业废物产生的虾青素量进行了每种发酵系统的测量(表1)．总结了发酵过程中各种废弃物的最佳发酵条件表2。以前发表的关于小麦废料的数据被用来比较其他废料。在水分含量为90%、温度为20℃、ph值为5.5的条件下，小麦废料发酵得到的虾青素含量最高，为109.23 μg AX/gdw。虽然发酵条件与小麦废料相同，但小麦废料发酵得到的虾青素含量更高。这其中的原因可能与营养内容。当蛋白质、水、脂肪和灰分的值结合起来时，其余的可以被认为是总碳水化合物。以小麦废弃物碳水化合物总量66.59 g/100 g为最大值。因此，碳水化合物的量越大，虾青素的产量就越大。大米废料的碳水化合物总量(51.71 g/100 g)高于扁豆废料(49.35 g/100 g)，但利用大米废料产生的虾青素不足三分之一。这可能是由于扁豆废料的蛋白质含量较高(36.96克/100克>13.42克/100克)(图1)．

表2:响应面方法学结果。

R2值大于80%是微生物过程响应数据可变性的显著表达。虽然决定值系数最高的是扁豆废弃物(0.8696)，但二次模型仅在(p<0.1)概率下对小麦发酵系统拟合良好(0.1701>0.1)。

在以前的研究中，使用Ramírez等人生成的实验设计范围内的合成培养基，ATCC 24202中虾青素的最大含量在19.7°C和6.0 pH下达到。[13］．阿难达和瓦德拉尼[14研究了全脂麦麸米糠(脂肪含量21%)和脱脂米糠(脂肪含量2%)经ATCC 24202工艺制取虾青素。发酵11 d后，麦麸、全脂米糠、脱脂米糠分别能产生66.75 μg AX/g底物、80.42 μg AX/g底物和16.94 μg AX/g底物。除全脂米糠外，其他AX用量均低于本研究中所使用的废弃物。的大米浪费脂肪含量为16.31%，产量为66.03 μg AX/gdw。据了解，水稻废弃物中脂肪含量增加，AX含量也随之增加。

一个全系数和三维图的二阶多项式方程(图1)，以演示系统中受影响最大的变量之间的相互作用。一般来说，对于所有发酵体系，高含水量和温和的温度值都能产生较高的AX产量。低温和pH的交互作用对小麦和扁豆发酵系统提高了产量，而对水稻没有影响。此外，无论其他参数的值是高是低，与高含水率的相互作用都能提高产量。一直强调含水率是SSF系统最重要和最关键的参数[12，15］．

小麦发酵:

y = 0.081 - -0.002617 x₁+ 0.025倍₂-0.001497倍_3.+ 0.0006725 x1x₂+ 0.009256 x1x_3.+ 0.00508 x2x_3.-0.012倍₁₁- 0.022 x₂₂+ 0.004801倍₃₃

动力学研究

对优化后的废物进行了12天的动力学参数考察。用公式3对细胞数和虾青素量数据进行建模，用公式4对葡萄糖量数据进行建模。给出了动力学参数的结果以及模型的回归和统计分析结果表3而且4。细胞数和葡萄糖量模型的回归值特别高。在本研究中应用了通常用于确定数据是否被良好建模的正态性检验。所有参数均通过检验，说明样本分布正常，实验数据与估计数据之间的相关性正常。情节中图2显示每个参数的实验和估计数据。只要葡萄糖被消耗，酵母就会生长并产生虾青素。形状的一致性证明了这一现象。批处理系统中的屈服系数可以指生产率。Yp/s=0.1057 (μg AX/g葡萄糖)，Yx/s=0.25 × 10⁸(细胞数/g葡萄糖)，Yp/x=3.68 × 10⁹(μg AX/细胞数)。

表3:动力学参数及回归分析结果。

表4:回归工具，统计检验，方程系数。

虾青素的抗氧化能力

虾青素色素抗氧化能力的重要性对研究人员来说是显而易见的。本研究考察了发酵前后的AC值，以确定废物SSF体系中虾青素的存在。发酵小麦废料中AC值与虾青素含量相关最高(96.71%)。同时测定了扁豆渣(82.03%)和大米渣(77.25%)的抗氧化能力，结果与虾青素的添加量有关。

结论

在实验设计中，通过对三种废弃物发酵条件的建模和优化，构建了虾青素生产SSF的参数水平和影响、废弃物类型、发酵周期和数值分析意义等关键因素。这项研究可作为执行其他有关研究和发展的基础。RSM优化结果表明，最有效的自变量为含水率。高水分含量可能危及质量和热量的均匀分布，从而使酵母容易获得营养物质。结果，生长和色素沉着得到了支持。对废物中有机、无机含量的变化进行了测定营养在抗氧化能力方面的产品价值也包括在这项研究中。动力学参数的建模和生产率的确定已被确定为困难的过程。因此，为了更好地理解和改进SSF系统，需要进一步的研究。

确认

本研究由土耳其加济安泰普大学科学研究基金会(项目编号:BAP M.F.12.08)资助。

参考文献

1. Dufossé L.食品级色素的微生物生产。食品技术生物技术。2006;44:313-321。
2. López S，等。基于化学成分和体外消化率的谷物和豆类秸秆营养价值评估。中国食品农业科学，2005;85:1550-1557。
3. Panesar R，等。利用农用工业废弃物生产微生物色素的研究进展。食品科学，2015;1:70-76。
4. Chattopadhyay P，等人。天然食品级生物着色剂的生物技术潜力。生物技术学报。2008;7:2972 - 2985。
5. Gupta C，等。微生物是生物颜色的潜在来源。药理学。2011;2:1309 - 1318。
6. Nigam PS和Luke JS。食品添加剂:微生物色素的生产及其抗氧化性能。食品科学，2016;7:93-100。
7. 莱恩RH。谷物食品，第777-788页。在Helrich K.(编)，AOAC，官方分析方法，卷II，第15版。官方分析化学家协会，阿灵顿，弗吉尼亚州，美国。1990.
8. Masuko T，等。微孔板法苯酚-硫酸法碳水化合物分析。生物化学学报。2005;39:69-72。
9. Babitha S，等。菠萝蜜种子固态发酵生产红曲色素的研究。生物资源学报。2007;29(2):344 - 344。
10. 阿斯兰N和Cebeci Y.应用Box-Behnken设计和响应面方法对一些土耳其煤建模。2007;燃料86:90-97。
11. 权毅，等。枇杷树科植物克隆性药材治疗糖尿病和高血压的疗效评价。中华临床病学杂志2006;15:107-118。
12. Mithcell DA等。综述了固体发酵中微生物生长动力学和颗粒内现象建模的最新进展。生物化学学报，2004;17(4):344 - 344。
13. Ramírez J，等。因子设计和响应面法优化法酵母生产虾青素。中国生物医学工程学报，2001;29(2):344 - 344。
14. Ananda N和Vadlani PV。红酵母法菲菌和玫瑰孢子菌单菌和混菌发酵谷物产品类胡萝卜素增值研究。中国农业科学，2011;29(4):467-472。
15. Pérez-Guerra N，等。固体底物发酵的主要特点及应用。电子环境农业食品化学。2003;2:343-350。