反应的植物内生微生物群落马尾松松树枯萎病的早期阶段

文摘

pnewood线虫(PWN),Bursaphelenchus xylophilus (b . xylophilus),是松树的因果代理人之一枯萎病(PWD)。PWDis的早期诊断具有重要意义,为有效治疗这种疾病的后期并不存在。目前,微生物菌群被建议在PWD扮演一个角色。然而,是否微生物菌群可以早期的诊断指数PWD是未知的。在这项研究中,我们应用10健康的野生成年马尾松(马尾松)分析了植物内生微生物群落的作用的早期感染b . xylophilus通过使用PCR-DGGE,我们发现细菌的结构马尾松接种后明显不同b . xylophilus。八号的细菌乐队,16日11和12线虫感染的细菌是与时间相关,这表明这四个细菌可能有潜在的松材线虫病的预防或治疗。此外,个人的菌群结构的变化马尾松通过分析nmd是相似。多维标定的微生物群落,我们发现内生细菌的种群结构之间明显不同的提前30天,40天。因此,通过识别中的内生细菌结构p . massonian一,我们就能够诊断的PWD首先出现症状前40天。松材线虫病早期诊断将为疾病的治疗提供宝贵的时间。我们的研究显示显著的数据证明植物内生细菌是一种新颖的索引对松材线虫病的早期诊断。

关键字

Bursaphelenchus xylophilus,PCR-DGGE内生细菌马尾松。

介绍

松树枯萎病(PWD)被称为“癌症”的松树,由感染引起的Bursaphelenchus xylophilu(b . xylophilus),也称松木线虫(PWN)构成的一个最严重的世界性的针叶树疾病(1]。这种疾病是一个重要的经济环境破坏受灾国家,巨大的木材,每年损失的成本增加疾病控制和不可逆转的改变原始森林生态系统包括生物多样性的丧失,野生动物栖息地的破坏、水土保持和树种的转换(2,3]。

松木线虫具有较强的致病性。一旦索耶松树甲虫,昆虫向量,引入了nema tode,感染树一般会在几个星期或几个月。没有治疗PWD一旦受到树成为出没的松木线虫和删除和凿出没的树木,防止蔓延到附近的敏感的树木是有限的防御方式。快速、准确检测的PWN松树在预防的引入是至关重要的xylophilus。然而,没有明显的症状就会显示早期PWN侵扰,这就增加了对该病的早期诊断困难4]。

近年来,随着的发展微生态学理论,微生物之间的关系环境、宿主和微生物种群进一步阐述了(5]。这是报告植物内生菌可以提高植物的营养生理学f虚情假意和抵抗活动在不同方式和诱导植物防御酶。这些结果表明,内生细菌和植物防御系统是密切相关的6]。勒夏特列原理发现,患有低细菌丰富具有更为显著的整体代谢疾病和更明显的炎性表型与高细菌丰富个人[相比7]。虽然PWN被认为是松材线虫病的主要病原,越来越多的证据表明,细菌可能在PWD发展发挥积极作用。•迪奥戈发现相关的微生物群落B。xylophilus出现在松果体松树PWD,大多数菌株分离属于系统组通常孤立的内生细菌松果体松树几个PWN-associated细菌可能会增加PWN毒性和诱导PWD症状在各种松树主机(1,8- - - - - -10]。更重要的是,昆虫向量中的细菌社区已报告影响昆虫的生活方式和发展以及与PWN交互(PMID: 23927049)。

尽管许多研究表明在PWD PWN-associated和昆虫vector-associated细菌的作用,但不是很多人注意到松树的内生细菌,以及如何的反应马尾松内生细菌应用于b . xylophilus感染,内生细菌是否可以索引松材线虫病的早期诊断。在这项研究中,我们分析了植物内生细菌的微生物群落结构和动态变化的马尾松感染后b . xylophilus,建立早期诊断技术的理论基础b . xylophilus基于微生物指纹图谱(11]。

材料和方法

植物材料

马尾松林地(119°55得名30°59’)位于2公斤米Taiyangshan路以西Xiaofeng镇,中国浙江省湖州市安吉县。林地的海拔高度是81米。十个健康的野生马尾松胸径(DBH)约50厘米从森林被选为实验对象,和时间接种2015年7月。

准备松木线虫悬浮液

死马尾松收集由PWN感染,病人木材被分割成小块5厘米长,直径5毫米。纱布是用于包装300 g木片,放在玻璃漏斗的底部是由橡皮管与扁下巴弹簧夹。100毫升去离子水25°C涌入的漏斗持平下巴弹簧夹关闭。24小时后,15毫升的液体漏斗的底部被送往在显微镜下检查PWN的存在(12]。

线虫是通过离心收集(4000×g, 2分钟),并转移到一个充满PDA培养基葡萄孢菌。恒定的温度下培养进行了25°C松木接种后的线虫。线虫后吃光了菌丝(8到12天后),Baermann漏斗法提取线虫的媒介。孤立的线虫离心消毒,集中到一个暂停6000线虫/毫升。

松木线虫接种

生长锥(5.15毫米孔径)被用来钻的树干(高度约为1.3米到1.5米),和准备湿棉花球的一个很好的吸附PWN悬挂被放入钻洞。局部涂红霉素抗生素是在孔盖无菌遭受微生物外,用无菌塑料薄膜后,接种斑点胶带密封(13]。

10株ofhealthy马尾松准备接种。三棵树收到水,三棵树被接种b . xylophilus,四个树不但是只有接种opetation。测试马尾松满是细孔的筛网使屏幕预防甲虫和其他昆虫的自然传播(14]。贴上了十个健康马尾松没有任何操作,J1-J10,树木b . xylophilus接种是卫星,J3 J8 water-inoculated马尾松j - 1, J2,阁下,徵树J5, J7, J10 J9。收集的样本:从树J3 10、20、30和40天被贴上J310 J320, J330 J340分别,这种标签的方法也适用于其他样本。

样品收集

木材样品在3 - 5厘米远离接种洞由四个方向(上,下,左,右)。样本收集接种前和接种10后,20、30和40天,每个排序是在顺时针旋转22.5°分前取样的位置。收集样本放置在无菌样品袋和保存在液氮罐,直到回到实验室。样本保持长期储存的-80°C。抽样的具体划分树的一种疾病状态是根据树木和针尖的叶子的颜色,和萎蔫的条件马尾松(14]。

内生细菌基因组的提取马尾松

具体操作过程如下:加权,3 g的P。马尾松。表面消毒后,样品被放在无菌离心管,密封塑料包装,存在漏洞。Pre-frozen在-80°C以上2 h和转移到2.5 L桌面冷冻干燥仪(美国Labconco自由区)冷冻干燥。重1克冻干样品和磨迅速由美国议员FastPrep-24样品制备系统参数6 m / s,在45 s两个周期,周期间隔3分钟。经过40孔筛,0.2 g的磨马尾松是重的提取植物内生细菌的基因组通过使用ωD3350细菌DNA工具包。提取方法与manufactorial指令之后,和DNA样本净化和存储在-20°C。

PCR扩增

纯化的DNA作为模板,16 s rDNA基因在V3地区细菌和古生菌被PCR放大,放大碎片约230个基点。特定的引物gc - 341 f (5 ' -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGGGACT-CCTACGGGAGGCAGCAG-3 ')和518 r (5“-ATTACCGCGGCTGCTGG-3”)。

PCR是在0.2毫升管使用Hybaid Px2热循环。直接PCR, 50µl反应混合物由25μl预混料taq(豆类taq,版本2.0 + dyc), 21.5μl双重蒸馏水,0.5μl的上游和下游引物(10μM工作浓度)和2.5μl DNA模板。PCR扩增的PCR扩增条件94°C条件为5分钟,94°C 30年代,55°C 30年代,72°C 1分钟,30个周期,最终在72°C扩展10分钟。这些优化PCR条件被用于所有在本研究中描述的底漆的结果集。琼脂糖凝胶电泳检测PCR应用产品。

变性梯度凝胶电泳(DGGE)的性能

PCR DGGE分析的产品有8%聚丙烯酰胺凝胶,变性梯度是40%到55%。凝胶是准备和运行1×TAE电泳缓冲在恒定电压80 v 60°C 13 h。PCR产品(10µl)与6µl 10×混合凝胶在装货染料。经过电泳,凝胶在室温下是彩色的30分钟GelRed™核酸凝胶染色和可视化紫外线透照法(15]。

DGGE乐队的序列分析

DGGE地图所示的兴趣清楚乐队的感染马尾松样品被切断与无菌手术刀和被转移到无菌管包含20µl无菌DNase / RNasefree水和孵化一夜之间在4°C。PCR之前,凝胶块放置在-20°C 1 h。然后融化,1 - 2μl上层清液用作模板的PCR扩增。筛选了DN放大了各自的gc - 341 f - 518 r引物和应用条件设置为前提出。P CR由豆类产品纯化minibest DNA片段净化装备ver.4.0,随后与T向量的豆类pMD™19-T向量克隆工具。DH5a主管细胞转化和阳性克隆挑出并送往上海桑戈语n生物技术有限公司有限公司测序。结果相比,可用16 s rRNA基因序列使用爆炸计划(从基因库http://www.ncbi。nlm.nih.gov /爆炸)。系统发育分析,16 s rRNA隔离并密切相关菌株的基因序列对齐使用CLUSTAL X软件(16]。Mega6软件被用来构造一个Neighbor-Joining系谱树的方法,在每个分支的信心1000倍boostrap [17]。

数据分析

PCR-DGGE的数据分析是使用软件包括图像实验室执行5.2.1(凝胶labography),数量一个v4.6.2(定量分析),古生物学统计2.03版本数据分析(数据分析),2016年和Mega6 Matlab。DGGE条带模式评估与骰子相似系数构造用UPGMA聚类分析,架构图,Shannon-Weaver指数、物种均匀度指数和丰富度指数(马格列夫),nmd)多维尺度,相似性指数P, R值(18,19]。

结果与讨论

马尾松接种B。xylophilus执行松树枯萎病

由于野生成年松树是有价值的,传播的潜在危险b . xylophilus在森林里,我们选择10健康马尾松在这项研究中,所有这些都在森林里生长了50年的树干直径超过50厘米。亚热带季风的炎热、潮湿的夏季条件可能松树下压力,使他们更容易攻击PWN和提供温暖的条件所需的线虫的快速繁殖,所以接种时间是7月份。我们在本研究中使用的用量线虫紧随其后金立群谢的研究(20.]。

我们观察到所有的十树没有明显的症状在四十天的实验。50天后,与布朗线虫接种开始显示10%的树木叶子,40 - 50%布朗离开80天,最后死无叶。然而,3与水和树木接种4树没有接种除了接种操作没有疾病的症状。确认的感染b . xylophilus从十树,我们也分离线虫通过修改Baermann漏斗。结果表明,线虫线虫接种可以从树木中提取,而不是从其他七树没有线虫接种。

内生细菌相似的物种和丰富健康马尾松。

人口结构的内生细菌样本J1-J10从健康马尾松被PCR-DGGE分析。DNA提取所有木材样品给预期的约230个基点与细菌引物PCR片段gc - 341 f - 518 r(数据见PCR扩增)。这些片段分离DGGE产生复杂条带模式反映了微生物多样性出现在这些样本(图1)。它被观察到,一般来说,DGGE样本未经处理的树(Figure 1)也有类似的主要乐队,这意味着物种和大量的内生细菌从十个健康树木互相接近。

植物内生细菌的结构马尾松有轻微的变化与水接种后40天

在奥德er t o消除桩孔的干扰和接种内生细菌的水马尾松,我们比较了细菌结构的内生细菌马尾松接种前和接种操作或接种后水40天。Water-inoculated马尾松在40天贴上J140, J240 J440,和徵样本在40天贴上J540, J740, J940 J1040。利用PCR-DGGE技术,我们发现物种和大量的内生细菌并没有改变多少水接种后,乐队,乐队丰富性与样本的健康的树木(图1 b)。shannon-weaver系数、均匀度和马格列夫十四马尾松样本数量分析的一个软件。从表1,我们观察到的香农指数为J1 J140分别为1.84和1.83,香农指数J2 J240是1.8和1.81,和J540为1.89,接近J5的香农指数1.87。因此,桩孔和water-inoculation内生细菌的结构几乎没有影响马尾松。

表1:多样性、均匀度和丰富的内生细菌的分析从water-inoculated徵马尾松手术前(j - 1, J2,阁下,J5 J7, J9和J10)和手术后40天(J140、J240 J440, J540, J740, J940和J1040)。

内生细菌具有显著的结构变化后接种线虫。

内生细菌的种群结构病变P。massonian被PCR-DGGE分析。我们发现内生细菌的结构明显改变,和物种丰富的内生细菌随时间增加(图1 c)。的shannon-weaver coefficie nt、均匀度和马格列夫的15马尾松一个软件样本进一步分析了数量。从表2,我们明显J340的香农指数是2.12,这是更大的:比J3。卫星与香农指数和J8, J640和J840香农指数也显著增加。此外,这些三棵树的意思是均匀度指数从0.62改为0.84 40天的感染,而意味着丰富指数没有显著变化。因此,线虫的感染后40天,内生细菌的多样性明显增加,这主要是取决于物种的丰富性,而不是增加物种的丰富性。它可以推测的感染b . xylophilus,细菌由树木打破平衡,导致病原体的传播马尾松和增加植物内生菌群的多样性。

表2:多样性、均匀度和丰富的马尾松的内生细菌分析(J3卫星是和J8)与b xylophilus感染10、20、30和40天。

Treatment-Dependent细菌反应者

乐队在图1 c这显然是分开相邻组合孤立了测序。与爆炸进行相似性搜索16 s rRNA基因共识序列。结果表明,优势种的endogeno我们在健康和患病的细菌马尾松是变形菌门和拟杆菌,其相应的物种不粘柄菌属,sphingomonas polaribacter,克雷伯氏菌、假单胞菌等。其中有一些是无教养的细菌。有趣的是,我们发现八号和16个细菌带显示与inoculationtime增加明显下降或消失,而11和12个乐队密度增加。我们应用matlab2016软件画出拟合曲线的8号,11、12和16个细菌接种的时间变化。结果表明,t他带亮度的主要细菌八号和16是负相关的线虫感染,11号和12条亮度的细菌是上调时间的方式(图2)。所有植物内生菌株的系统发育树后聚集和分析(图2),我们发现在四个主要细菌八号,11、12和16号和16个细菌密切相关(93%)、11和12个细菌相关(48.6%)。

多种植物病原细菌对植物造成伤害和疾病宿主被抬高,因为分类等的进步分子多相分层方法改进的发展史(21]。然而,在松树,没有已知的疾病与植物病原细菌的存在有关。在这项研究中,我们确定了11路细菌病马尾松作为Mucilaginibacter sp,这种细菌最初从树上,作为样本健康树木没有强。11个乐队DGGE图谱。它还报告说,Mucilaginibacter pinetisp.是孤立的植物内生微生物群落松果体松树从混合片松树树枝(图3)。系统发育16 s rRNA基因序列分析表明,这种生物在家庭中代表一个不同的分支Sph ingobacteriaceae(PMID: 24711588)。Mucilaginibacter sp属于细菌菌株,倾向于寄生虫的烂木,以腐烂的材料为食物。我们假定PWN感染,感染的树木开始衰变里面没有显示任何症状在松材线虫病早期,与此同时,Mucilaginibacter sp大力倍数。此外,它可能线虫活动具有巨大的潜力在预防和治疗这种疾病。因此,Mucilaginibacter sp可以作为响应指数早期感染了吗马尾松PWD。16号细菌一致格是同一标准的Klebsiella。的一些压力Klebsiell一个显示强大nematocidal活动在体外也有报道,促生长功能树。克雷伯氏菌sct5 nematocidal活动4天最高,与PWN死亡率达到100% (22,23]。在葡萄牙进行的一项研究,发现克雷伯氏菌与PWN有关,这可能从松树。丰富的克雷伯氏菌与接种时间增加(减少24]。我们怀疑这个细菌是松树的起源,和这社会平衡被感染。响应的差别一个对这些克雷伯氏菌。是一个典型的症状早期PWD。

与八号和12的比较序列可用16 s rDNA基因序列在基因库中,我们发现这两个序列是两个unculturable细菌。尽管大量的细菌物种在树上,99%以上的这些物种不能由传统培养技术。此外,只有不到1%的细菌,可以培养不代表总数的系统发育多样性25]。然而,确定物种及其新功能的八号和12个细菌仍然是一个重要的任务在这项研究中,我有一个巨大的潜力n松材线虫病的预防和治疗。

内生细菌可以潜在指数松树枯萎病的早期诊断

为了探索内生细菌的改变规则社会线虫感染,我们进行了nmd在不同马尾松同样的感染时间梯度(10年,20年,30和40天)。我们观察到,马尾松收到接种线虫的重合度非常高的在同一时间和空间(图4)。人口结构的改变内生细菌有相似性和同步特征不同马尾松感染了B。xylophilus。

比较植物内生菌群结构的差异马尾松接种后,我们应用nmd的植物内生菌群分析数据马尾松在第一个30天,40天inocu副调制。多维标定的微生物群落,这是表明两层明显分离,和人口结构的内生细菌是明显不同的(图5)。使用过去的软件分析,我们得到了P值是0.0005999,和相关的R值为0.5418(图5 b)(26]。因此,内生细菌的结构有显著差异和温和的相关性在接种后40天。这些结果sugge圣,通过检测内生细菌的变化马尾松,我们能够诊断树是否生病的前40天的疾病。

松树枯萎病构成重大威胁的森林生态系统在世界范围内,从经济的角度以及从环境的角度来看。早期诊断尤为重要的预防和治疗这种疾病。根据不同的原则、方法的外部症状、病原线虫显微镜,物理光谱和电子、分子生物学、生物化学和其他识别方法被用来证实诊断(27- - - - - -31日]。传统检测松材线虫病是耗费时间,基本上取决于树木的观察,通常来不及阻止疾病的蔓延。尽管最新的分子检测技术如灯(loop-mediated等温扩增)或疤痕特征序列特异性PCR扩增显示快速和直接检测方法,提取线虫或无需使用昂贵的和专门的设备以及分类的专业知识(32]。然而,没有一个执行实验在野生森林长期时期,和所有的研究可以提供诊断的具体时间。我们的研究表明,内生细菌的结构的变化马尾松可以诊断松树枯萎病早在感染时间40天。此外,我们发现的细菌病马尾松这是与线虫感染的时间有很大的潜力在预防和治疗这种疾病。

结论

在这项研究中,我们发现的细菌结构马尾松接种后明显不同b . xylophilus八号的细菌乐队,16日11和12线虫感染的细菌是与时间相关,这表明一个潜力巨大的细菌预防松材线虫病或treatme nt。植物内生细菌的结构的变化马尾松可以诊断PWD早在感染时间40天。我们的研究提供了一种新的植物内生细菌的作用马尾松在预防松材线虫病。松材线虫病的早期诊断提供有价值的蒂姆·e治疗这种疾病。十野外实验进行马尾松,相对较小的大小是一个限制。此外,还需要进一步的研究来确定相关的特定细菌w i线虫接种。然而,我们的研究提供了重要的数据证明内生细菌是松材线虫病早期诊断的新研究领域,在一个更大的样本量和正在进行的实验将为这个新理论提供更多证据。

确认

这项研究受到了中国国家社会科学基金(格兰特没有:(电子邮件保护)),浙江省自然科学基金(格兰特没有:ly17c160001)、浙江省教育部门项目(格兰特没有:Y201533256),湖州大学科研项目的结果(格兰特没有:2018 xjkj40)。

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