研究与评论:动物科学杂雷竞技苹果下载志
菜单e-ISSN: 2321-6190 p-ISSN: 2347-2294
e-ISSN: 2321-6190 p-ISSN: 2347-2294
部门动物学， Guru Ghasidas Vishwavidyalaya(中央大学)，科尼，比拉斯普尔，恰蒂斯加尔邦，印度
收到日期:30/06/2017;接受日期:29/09/2017;发表日期:02/10/2017
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本研究的目的是评估改变的组织结构和生化链脲佐菌素治疗雄性白化病大鼠睾丸、附睾和精囊的变化。此外，另一个目的是评估外源性褪黑素与链脲佐菌素联合使用可能的保护作用。经组织学和生化分析，认为外源性褪黑素可能与其他抗氧化剂共同作用，增强和调节抗氧化系统功能，并在抗氧化过程中克服细胞损伤糖尿病
褪黑素，糖尿病大鼠模型，生殖并发症，链脲佐菌素
现代化和不断变化的生活方式使我们的身体容易患上多种疾病。他们影响生理身体的过程或早或晚，侧重于男性生殖，导致生殖性能下降。这项全球调查报告显示，糖尿病影响了近10%的人口[1它是第八大死亡原因(仅次于心脏病和心脏病)癌症)在许多发达国家。其特征是高血糖、高甘油三酯血症和高胆固醇血症，其原因是胰岛素分泌缺陷或组织对胰岛素的敏感性降低(胰岛素抵抗)和/或两者结合[2］．它对……有不利的影响性功能，尤其是男性个体。糖尿病会改变男性生殖功能，因为它通过施加氧化应激降低了精子发生的内分泌控制，从而导致性欲下降、性成熟延迟和精液质量差的不育症。前瞻性研究表明，睾丸激素水平低预示着男性糖尿病的发展[3.］．尽管糖尿病男性游离睾酮和空腹胰岛素水平的确切调节模式与年龄、肥胖和体脂分布无关。糖尿病会降低精子数量、血清睾酮、精子发生障碍、精液量、勃起功能障碍和性能力丧失。
链脲佐菌素(STZ)是一种抗生素抗癌由于其在胰腺β细胞中的细胞毒性，是糖尿病研究中最突出的致糖尿病药物。它是一种有效的生长抑制剂和烷基化剂，用于治疗结直肠胰腺，肾上腺皮质和胃肠癌症单用或与其他抗肿瘤药物联合使用[4］．STZ对β细胞的选择性毒性是由于其通过GLUT-2葡萄糖转运体摄取而优先积累在β细胞中。早期研究表明，使用STZ对不同恶性肿瘤进行化疗可导致抗体的形成[5]，进而开始破坏产生胰岛素的β细胞，最终导致胰岛素缺乏[6］．因此，它会导致体内的高血糖水平。多余的葡萄糖发生自氧化，成为自由基产生的来源。一定量的过量葡萄糖会导致蛋白质如血红蛋白的非酶糖基化，将它们转化为糖化血红蛋白。
褪黑素是一种天然化合物，存在于人类、动物、微生物、动物和植物中[7］．它在松果体中合成，也从其他松果体外部位合成(如视网膜、肠、骨髓细胞和皮肤)[8］．褪黑激素的循环水平每天都在变化。它具有强大的抗氧化作用和减少氧化应激，因为自氧自由基清除剂和刺激内源性抗氧化系统;血液及肝脏中的超氧化物、谷胱甘肽氧化酶、谷胱甘肽S转移酶及总硫醇[9］．由于褪黑素结合位点已在不同物种的生殖系统中被检测到，似乎有理由假设褪黑素通过与生殖器官的类固醇原性细胞直接相互作用来发挥作用。褪黑素的抗氧化功能与其清除活性氧/氮(ROS/RNS)的能力有关。此外，褪黑素通过刺激抗氧化酶的活性来降低自由基水平。外源性褪黑素治疗可恢复PCOS雌性白化大鼠的氧化应激和激素水平[10]，并报道它可以减少链脲佐菌素诱导的肝肾障碍，即脂质过氧化率，肝肾功能测试[11］．本研究旨在评价链脲佐菌素对雄性白化大鼠睾丸、附睾和精囊组织结构和生化变化的影响。此外，另一个目的是评估外源性褪黑素与链脲佐菌素联合使用可能的保护作用。
链脲佐菌素(STZ)溶解于0.1M柠檬酸缓冲液(pH 7.4)中，剂量为15 mg/kg，连续6天腹腔注射。链脲佐菌素(STZ)治疗72小时后，用血糖仪(ACCU CHECK)监测动物血糖水平。第6天血糖水平超过250 mg/dl的大鼠被确认为糖尿病模型(表1）.
| 组 | 剂量 | 不。的动物 |
|---|---|---|
| 控制 | 0.5 ml (0.1M)柠檬酸缓冲液 | 6 |
| 链脲霉素(STZ) | 15毫克/公斤 | 6 |
| STZ +梅尔 | 15毫克+1毫克/公斤 | 6 |
| 褪黑激素(MEL) | 1毫克/公斤 | 6 |
| 格列本脲(GB) | 0.6毫克/公斤 | 6 |
| STZ + GB | 15 mg/kg+0.6 mg/kg | 6 |
表1:实验设计。
组织学研究
实验结束后，大鼠经乙醚麻醉后处死。取出睾丸和男性附属器官(精囊和附睾)，清洗并称重。组织在Bouin固定液中固定24小时后进行生化分析。它们经过脱水和清除的各种步骤，然后被埋在石蜡中。用旋转切片机(Leica RM 2125RT5)切取5 μm厚的组织切片，双染色法染色。切片组织显微图在400倍放大的三目研究显微镜下摸索。
生物化学分析
总蛋白质含量测定:总蛋白按照Lowry等人的方法估算[12作了一些修改。组织在Na中均质2有限公司3.制作10%的匀浆。用牛血清白蛋白做标准曲线，在635 nm处吸光度。
脂质过氧化(LPO)测定:采用Ohkawa等人改进的方法，采用TBARS法评估脂质过氧化(LPO) [13］．用Tris-HCL (20 Mm)均质，用Perkin Elmer分光光度计(Lambda 25，序列号501812090210)在535nm处吸光度。用摩尔消光系数1.56 × 10表示LPO的速率为每克新鲜组织重量的TBARS的纳摩尔5米/厘米。
还原性谷胱甘肽(GSH)测定:采用改进的Sedlak和Lindsay方法测定硫醇含量[14］．在0.025M蔗糖中制备组织匀浆。412 nm处的吸光度(Perkin Elmer分光光度计，Lambda 25，序列号。501812090210)。摩尔消光系数13100用于计算谷胱甘肽含量。
超氧化物歧化酶活性:采用Kakkar等人改进的方法评估组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性，[15］．用0.25M蔗糖制备组织匀浆，用Perkin Elmer分光光度计(Lambda 25，系列号:560nm)测定吸光度。501812090210)。
过氧化氢酶(CAT)活性:采用改进的Beers和Sizer法测定过氧化氢酶活性[16］．在磷酸盐缓冲液中制备组织匀浆。用珀金埃尔默分光光度计(λ 25，序列号:2400nm)在240nm处吸光度3分钟。501812090210)。
统计分析
采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行统计分析，然后使用SPSS 16.0统计软件(SPSS, Chicago, IL, USA)进行学生t检验。p<0.05或p<0.01的概率值被认为有统计学意义。
器官重量
糖尿病大鼠的脏器重量明显下降，而给药后脏器重量恢复到正常水平。褪黑素和格列本脲单独被证明能保持与对照组相似的器官重量(图1）.
图1:褪黑素(MEL)和格列苯脲(GB)对链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠睾丸、附睾和精囊重量的比较影响。直方图表示平均值±SE;N = 6;CON与STZ的显著性水平为a=p≤0.05,b=p≤0.01;STZ vs. STZ+MEL;STZ vs MEL;STZ vs STZ+GB和STZ vs GB。
LPO测定(氧化应激标记物)
链脲佐菌素诱导的糖尿病对照组大鼠睾丸和附属性器官(附睾和精囊)组织中自由基的生成明显升高。STZ诱导的糖尿病大鼠输注褪黑素和格列本脲后，组织TBARS水平明显降低。褪黑素和格列本脲单独表现出明显的自由基生成调节作用(图2）.
图2:褪黑素(MEL)和格列苯脲(GB)对链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠睾丸、附睾和精囊脂质过氧化(LPO)的比较影响。直方图表示平均值±SE;N = 6;CON与STZ的显著性水平为a=p≤0.05,b=p≤0.01;STZ vs. STZ+MEL;STZ vs MEL;STZ vs STZ+GB和STZ vs GB。
还原性谷胱甘肽
链脲佐菌素组糖尿病大鼠GSH水平显著降低。褪黑素补充链脲佐菌素后糖尿病大鼠硫醇含量逐渐升高。结果与标准抗糖尿病成分(格列本脲)治疗组(图3）.
图3:褪黑素(MEL)和格列本脲(GB)对链脲霉素诱导糖尿病大鼠睾丸、附睾和精囊中谷胱甘肽降低(GSH)的比较影响。直方图表示平均值±SE;N = 6;CON与STZ的显著性水平为a=p≤0.05,b=p≤0.01;STZ vs. STZ+MEL;STZ vs MEL;STZ vs STZ+GB和STZ vs GB。
超氧化物歧化酶活性
链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠组织中SOD活性明显降低，而外源性褪黑素治疗后，糖尿病大鼠抗氧化酶活性升高。超氧化物歧化酶活性与格列本脲组大鼠和对照组大鼠相比均有明显升高(图4）.
图4:褪黑素(MEL)与格列本脲(GB)对链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠特定器官超氧化物歧化酶(SOD)活性的比较影响。直方图表示平均值±SE;N = 6;CON与STZ的显著性水平为a=p≤0.05,b=p≤0.01;STZ vs. STZ+MEL;STZ vs MEL;STZ vs STZ+GB和STZ vs GB。
过氧化氢酶(CAT)活性
链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠睾丸、附睾和精囊过氧化氢酶(CAT)活性明显降低。链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠睾丸、附睾和精囊过氧化氢酶活性明显升高，与对照组和格列本脲(图5）.
图5:褪黑素(MEL)和格列苯脲(GB)对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠睾丸细胞、附睾和精囊过氧化氢酶(CAT)活性的比较影响直方图表示平均值±SE;N = 6;CON与STZ的显著性水平为a=p≤0.05,b=p≤0.01;STZ vs. STZ+MEL;STZ vs MEL;STZ vs STZ+GB和STZ vs GB。
总蛋白质含量估计
链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠各器官总蛋白含量明显降低。而注射褪黑素和格列苯脲可显著提高STZ诱导的糖尿病大鼠组织总蛋白含量。结果与标准抗糖尿病分子(格列本脲)治疗组(图6）.
图6:褪黑素(MEL)和格列苯脲(GB)对链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠睾丸、附睾和精囊总蛋白测定的比较影响。直方图表示平均值±SE;N = 6;CON与STZ的显著性水平为a=p≤0.05,b=p≤0.01;STZ vs. STZ+MEL;STZ vs MEL;STZ vs STZ+GB和STZ vs GB。
睾丸组织显微照片
组织学观察显示，在糖尿病期间，生精小管管腔的萎缩和收缩，而褪黑素治疗恢复了收缩和生精细胞的数量增加(图7）.
图7:肺坏死组织病理学特征的代表性显微照片。
附睾组织显微照片
STZ诱导的糖尿病大鼠附睾组织结构显示空泡形成，纤维肌肉变性，间质减少。这些变化可能会影响精子的成熟和活力。附睾是精子的重要储存库;附睾的任何细胞畸变都可能导致不孕。褪黑素治疗可恢复与对照组相当的细胞异常。然而，格列本脲也显示细胞损伤的恢复。褪黑素和格列本脲单独调节附睾细胞密度(图8）.
图8:组织显微照片显示附睾组织的改变。对照组大鼠未见细胞损伤，STZ组大鼠附睾出现液泡形成，纤维肌组织减少，间质损伤。STZ+MEL可恢复细胞变化，如液泡大小减小、纤维肌肉组织正常化和间质恢复。STZ+GB处理后，这些细胞变化得到恢复。MEL组和GB组未见任何损伤。
精囊组织显微照片
组织学观察发现，精囊柱状细胞数量减少，从而抑制液体分泌。然而，服用褪黑素可恢复柱状细胞的数量，这与对照组相当。格列本脲治疗糖尿病大鼠柱状细胞损伤得到恢复，而褪黑素治疗糖尿病大鼠柱状细胞损伤得到显著恢复。褪黑素和格列本脲单独维持精囊的结构和功能调节(图9）.
图9:组织显微照片显示精囊组织的改变。对照组为正常的假分层大柱状上皮细胞，上皮呈典型基底细胞，无空泡形成，退化柱状细胞(CCS)、STZ+MEL和STZ+GB组柱状细胞(CCS)空泡大小减小，空泡恢复。然而，褪黑素治疗组观察到明显的恢复。褪黑素和格列本脲调节精囊的细胞结构。
糖尿病(DM)影响了8.3%的世界人口，2014年约有510万年龄在20岁至79岁之间的人死于糖尿病(IDF, 2014)。糖尿病的高死亡率和对生活质量的负面影响是由于主要由高血糖和氧化应激引起的多器官系统进行性损害[17］．STZ是一种β细胞毒素，被广泛用于诱发实验动物糖尿病的致糖尿病分子。它诱导自由基并增强氧化应激，这是导致不同毒性表现的原因。STZ通过破坏分泌胰岛素的β细胞诱导高血糖。促进糖尿病中自由基形成的机制可能不仅包括非酶和自氧化糖基化的增加，还包括由能量代谢变化、炎症介质水平和抗氧化防御状态引起的代谢应激[18］．褪黑素在本质上被认为是高度亲脂亲水的。这有助于它通过所有生物膜进入细胞及其亚细胞室。因此，无论通过何种途径给药，其褪黑素浓度均迅速升高，这可能使其减少细胞脂质和水环境中的氧化损伤。这使其他缓慢渗透细胞的抗氧化剂黯然失色。
在本研究中，重量分析显示不同生殖器官的组织特异性变化，其中附睾和精囊在糖尿病患者中受到的影响比睾丸更大，这意味着可能存在任何细胞结构的改变，导致萎缩，导致器官重量下降。这可能是糖尿病引起的男性不育症与健康男性相比，附睾和精囊功能障碍背后的强大原因之一，因为附睾促进精子成熟和储存。已证实STZ诱导的糖尿病可导致雄性大鼠泌尿生殖道组织重量下降[19］．褪黑素作为一种抗凋亡分子可能可以防止细胞死亡，因此外源性给药可以恢复器官重量的损失。
本研究以TBARS水平为氧化标志物，分析动物模型应激水平。与对照组相比，STZ诱导的糖尿病大鼠TBARS水平显著升高。这表明在STZ诱导的糖尿病大鼠中有显著的自由基生成。给糖尿病大鼠服用褪黑素可减少ROS的产生，这表明褪黑素具有自由基清除剂的作用。结果证实褪黑素对大鼠的每次治疗没有表现出任何自由基产生的改变，如抗糖尿病药物(格列本脲)。目前的研究结果与Lena和Subramanian之前的发现相吻合，他们报告说褪黑素是一种有效的抗氧化剂和自由基清除剂。他们得出的结论是，褪黑素可以通过(i)直接清除各种自由基和ROS， (ii)诱导抗氧化酶降低ROS的稳态水平，(iii)抑制产生一氧化氮的一氧化氮合酶，以及(iv)稳定细胞膜，帮助它们减少氧化损伤来控制氧化滥用。Gutierrez-Cuesta等人也得到了类似的结果，[20.褪黑素改善了促生存信号，减少了促死亡信号。研究表明，褪黑素可能通过改善高血糖小鼠的组织病理学改变和减少生殖细胞凋亡来潜在地减轻睾丸损伤[21］．精子中的脂质是过氧化作用的主要底物，过量的ROS和自由基对精子活力和生育能力有不利影响[22］．此外，糖尿病可能会破坏细胞膜的脂质含量，如非酶糖基化、脂质过氧化和胆固醇磷脂比的增加。
高血糖通过至少四种不同的途径导致自由基中间体的产生增加:糖酵解增加;山梨醇(多元醇)通路的细胞内激活;葡萄糖的自氧化和非酶蛋白糖化Ahmed(2005)。为了控制ROS的通量，需氧细胞已经形成了一种抗氧化防御系统，其中包括酶和非酶成分[23］．抗氧化系统由低分子抗氧化分子和各种抗氧化酶组成[24］．谷胱甘肽(GSH)是最常见的低分子量抗氧化肽，具有超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性。
谷胱甘肽还原性(GSH)，超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)，谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)，谷胱甘肽循环(包括GPx, G6PDH, GR, NADPH和ATP)，所有酶和非酶系统在糖尿病条件下减弱。STZ可诱导OFR诱导的生殖器官脂质过氧化和DNA链断裂。SOD和过氧化氢酶活性、谷胱甘肽和维生素e水平的变化已被报道Oberley和Oberley [25］．在糖尿病状态下，大鼠和小鼠的睾丸、附睾和精囊中SOD活性显著降低。在本研究中，GSH、SOD和过氧化氢酶水平下降表明糖尿病期间抗氧化防御机制减弱。与对照组相比，服用褪黑素的患者病情有所好转。提示褪黑素治疗可通过恢复SOD活性和抑制氧化应激在细胞和生化水平上改善糖尿病大鼠睾丸损伤。其结果是减少了ROS的产生，改善了糖尿病大鼠的睾丸损伤。有证据表明，链脲佐菌素诱导的糖尿病会释放自由基[26］．由于谷胱甘肽通过己糖磷酸分流的NADPH与葡萄糖代谢密切相关，因此在糖尿病中自由基代谢改变是合理的。
目前的研究表明，生殖器官的总蛋白质含量显著下降。蛋白质含量的下降可能是由于细胞膜损伤导致蛋白质从细胞中渗出，也可能是器官功能障碍和蛋白质代谢不规律的原因。迄今为止，关于睾丸、附睾和精囊蛋白定量的报道很少。因此，总蛋白质含量的下降降低了糖尿病患者的生殖能力，这可能是导致不孕的原因之一。
组织学观察显示生精小管萎缩，生发细胞退变，生发细胞组织紊乱，间质水肿，毛细血管充血，生精细胞减少。这些变化也被先前的研究结果报道，导致精子形成失败和持续失败[27］．早期的研究证实了睾丸形态的类似变化[28，29］．精原母细胞是生殖细胞中显示凋亡、减少的生精细胞系列[30.]导致不同的组织细胞畸变，如边缘畸变、精子数量减少、体积缩小等，这表明糖尿病患者精子数量明显减少。而STZ诱导的大鼠服用褪黑素后，睾丸功能的异常改变得以恢复。在stz型糖尿病大鼠中，附睾损伤可能导致精子运动不正常和生育能力下降。细胞结构坏死可导致空泡形成、血管充血、巨噬细胞浸润和水肿液在间质空间积聚[31］．既往研究报道，在糖尿病期间，精囊的分泌细胞(假分层柱状细胞)数量减少，由于细胞损伤增加而形成液泡。这些细胞损伤可能是由于自由基产生的异常细胞死亡而发生的[32-38］．然而，给糖尿病大鼠服用褪黑素可以恢复细胞损伤。糖尿病患者附睾细胞结构显示间质缩小和纤维肌肉组织减少，这可能影响精子成熟，并可能导致男性不育/不育。这是由组织学观察支持的[31褪黑素治疗显示细胞变化向对照组恢复。褪黑素和格列苯脲调节附睾细胞和功能状态。
褪黑素具有多种修复生物学功能，如抗氧化、免疫调节、抑瘤、抗衰老和抗炎作用。这些功能迫使科学界探索其保护作用。在本研究中，脂质过氧化率较高(TBARS水平)，抗氧化系统(GSH, SOD和CAT)在STZ诱导的糖尿病大鼠中表现出下降，褪黑素通过调节抗氧化防御，显著上调抗氧化系统，显示出非常有趣的结果。组织学显微照片显示STZ诱导的睾丸、附睾和精囊细胞损伤得到恢复。因此，外源性褪黑素可能与其他抗氧化剂联合使用，以增强和调节抗氧化系统的功能，并克服糖尿病期间的细胞损伤。进一步研究其在非受体和受体水平的作用机制，为糖尿病性男性不育症的医学研究提供依据。
作者之间没有利益冲突。
作者非常感谢中央大学(Guru Ghasidas Vishwavidyalaya)动物学系提供可用的研究设施。作者还感谢SK Verma博士(GGV动物学系)在显微技术方面提供的帮助。DBT建设者计划下的研究设施得到高度认可。
