Rhizosecretion转基因烟草的重组抗菌肽Ranalexin毛茸茸的根源

文摘

Rhizosecretion功能重组蛋白的体外培养的根在水培中提供一个有吸引力的技术来简化加净化程序。本研究的目的是生产和分泌的抗菌肽(AMP) ranalexin烟草毛根部由agroinfection转换。一个His-tagged ranalexin表达CaMV 35 s启动子的控制下,直接到植物分泌通路通过融合其N末端的ER calreticulin的信号肽。最大积累ranalexin在毛状根组织20 - 25天后文化占了大约3.36%的总可溶性蛋白。分泌ranalexin达到浓度为0.28 mg / L在中在25天。细胞外ranalexin水平可以增加到1.64 mg / L培养基添加聚乙烯吡咯烷酮。分泌ranalexin活跃对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌包括菌株对抗生素、抗多种抗菌素的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等vancomycin-resistant VRE肠球菌,酿脓链球菌、大肠杆菌、不动杆菌baumanii以及临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分离株。我们的结果表明植物组织文化特别是烟草毛根部的有用性作为替代ranalexin生产系统和其他抗菌肽。

关键字

烟草,农杆菌rhizogenes,毛根部,抗菌肽(AMP), Ranalexin Rhizosecretion。

缩写

安培:抗菌肽;菌落:集落形成单位;呃:内质网;ESI-QTOF女士:电喷雾四极杆飞行时间质谱;GFP:绿色荧光蛋白;麦克风:最低抑制浓度;MS-MS:串联质谱;PVP:聚乙烯基吡咯烷酮;SDS:钠十二烷基硫酸盐;WP:木本植物。

介绍

几种不同的系统被用来产生大小不同的肽,3 d结构,需要不同的转译后的修改。抗菌肽(AMP)小membrane-active肽检测在许多生物(植物、动物)函数作为自然防御病原微生物。他们可能是有用的作为新的抗生素对细菌抗多种抗菌素的[1]。可以通过化学合成或安培基因工程重组蛋白。超过80%的安培在细菌产生,其余在酵母[2]。

最近,AMP基因转入植物主要用于作物改良,因为这些转基因植物表现出增强抵抗微生物感染。几个天然阳离子安培或其类似物在设计合成转基因植物像番茄、烟草、水稻、马铃薯、棉花、香蕉和拟南芥(3 - 14)。疫苗的生产技术已经取得了烟草叶绿体等C4V3(抗HIV病毒)和EtMIC2(对鸡球虫病)(15、16)。尽管已经运用各种策略来提高外源基因的表达在完整的植物,缺乏蛋白质的稳定与降解宿主组织被认为是为什么许多AMP-transformed植物并没有表现出显著增加抗病性(17 - 19)。如果工厂用于生产重组蛋白,重组蛋白的提取和纯化,包括安培,从植物组织可以耗时;也收益率通常是低安培限制大规模生产的植物。为了克服这些问题,基于分泌的系统已经开发出来的产品积累培养基[20]。

作为替代整体植物,植物组织培养越来越多地用于生产价值的药用蛋白。体外培养有几个优势像野外栽培条件下,独立和廉价和简单的媒体的可用性。除了蛋白质复苏简化文化特别是从污染的介质由于缺乏蛋白质(20、21)。

毛根部,可以很容易地从外植体获得土壤杆菌属感染rhizogenes确立了宝贵的植物次生代谢产物的生物合成以及外源蛋白,如单克隆抗体(22 - 24)。由于他们的快速增长率在无激素培养基和生化稳定性、毛状根培养制药行业有着巨大的潜力。生产外源蛋白在植物细胞和分泌到培养基可以限制低水平的合成、水解和氧化降解酶在中,或这两个因素的组合(24、25)。因此,许多因素需要优化提高表达和综合水平,在毛状根文化中重组蛋白的稳定性。

本研究的目的是应用烟草毛根部的合成重组AMP ranalexin。Ranalexin小阳离子抗菌肽(20个氨基酸残基组成的:FLGGLIKIVPAMICAVTKKC),首先从美国牛蛙的皮肤,隔离Rana cateiana广谱的抗菌活性与人类病原体(26、27)。重组ranalexin显示协同杀菌活动结合使用时多粘菌素B或linezolid耐多药细菌(28 - 30)。应用ranalexin结合溶葡球菌酶体内已经被证明可以实现非殖民化的MRSA菌株金黄色葡萄球菌NRS384 [28]。此外,ranalexin显示潜在的优势在临床使用抗生素。

然而,有限的可用性ranalexin从天然来源刺激使用基因工程方法作为替代。到目前为止,我们已经成功地表达了具有生物活性的重组成熟ranalexin作为硫氧还蛋白(硫氧还蛋白)融合肽在大肠杆菌和酵母最近毕赤酵母属pastoris (29、30)。

在这个沟通我们描述建立烟草毛根部合成与calreticulin ranalexin分泌信号序列。表达的重组和抗菌活性蛋白质CaMV35S启动子的控制下,分泌到培养基。之间的关系ranalexin分泌到培养基中,经济增长和文化时间评估。此外,中添加剂对根生长的影响以及ranalexin分泌也被调查

材料和方法

植物材料、菌株、质粒和抗生素

成熟的叶子烟草被用于转换。大肠杆菌(大肠杆菌)应变DH5α用于常规质粒扩增(subcloning)和土壤杆菌属rhizogenes写明ATCC 15834株(请提供的博士教授w . Alfermann杜塞尔多夫,德国)叶圆盘的转换。目标向量pK7WG2D从网关™作为表达载体[31]。Claforan(赛诺菲-安万特)、壮观霉素和卡那霉素(Sigma-Aldrich®GmbH,德国)被用来选择重组后毛根部,摆脱杆菌感染。抗菌活性标准菌株由医学微生物学实验室卫生研究所,海德堡大学。革兰氏阳性细菌(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌反恐怖主义中心10442,vancomycin-resistant肠球菌VRE写明ATCC 12344)写明ATCC 31299和酿脓链球菌和革兰氏阴性细菌(写明ATCC 25922大肠杆菌和不动杆菌baumanii写明ATCC BAA747)以及临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分离株。

建设Pk7wg2d——Ranalexin二进制向量

两个引物Ranlx-SacI和Ranlx-HindIII-His-tag(来自欧陆坊MWG操纵子Ebersberg,德国)被用来放大ranalexin基因从60米的寡核苷酸ranalexin PCR [30]。calreticulin分泌信号序列(Z71395)融合的N末端ranalexin基因为目标的重组AMP毛状根的细胞外空间。

ranalexin核苷酸序列(有或没有分泌信号序列)被克隆到网关捐赠者向量通过attB-attP pDONR221 (BP)复合反应根据网关®技术手册(表达载体;达姆施塔特,德国)。因此,建立了二进制向量由attL-attR (LR)反应使用pK7WG2D作为目标向量(图1)。正确的阅读框的ranalexin构造证实了PCR扩增和DNA测序(由STARSEQ GmbH是一家;美因茨,德国)。生物编辑版本7被用来分析序列。

转化农杆菌属Rhizogenes

构建二进制向量变成了a rhizogenes ATCC15834通过电穿孔(Bio-Rad;条件:1.8 kV, 25μF 200Ω)根据Mattanovich [32]。积极的殖民地(菌落PCR证实了使用特定ranalexin引物)被镀在选定YMB-spectinomycin(100μg /毫升)板(0.4 g / L酵母提取物,10 g / L甘露醇,0.2 g / L MgSO₄.7H₂啊,0.5 g / L K₂HPO₄.3H₂啊,0.1 g / L氯化钠,w / v Bacto琼脂1.5%;pH值7)在28ºC 2 - 3 d。a . rhizogenes重组克隆窝藏二进制向量(有或没有分泌信号序列)在30 mL:培养基培养与隔夜摇晃28ºC。细胞被离心收获(10分钟4000转4ºC)和resuspended½女士中达成OD600 = 0.4。制备烟叶光盘、植物转换和毛状根

植物生长媒体是基于Murashige斯和劳埃德(33、34)。执行n转化烟草使用描述的叶瓣co-cultivation方法Horsch [35]。光盘(直径0.5 - 1厘米)准备从5厘米长绿叶的烟草植物生长在温室。超过60个光盘在30毫升孵化解决方案包含转换a rhizogenes 30分钟温柔颤抖。叶子光盘被转移到纸过滤去除细菌悬液和放置在WP板块为2 - 3 d。最多选择5 - 7外植体被颠倒在WP板块含有抗生素(250 mg / L claforan消除a . rhizogenes 100 mg / L卡那霉素选择转基因植物)和保存在低光强度,直到毛状根提示出现了。

转换后的毛根部的生长条件和分析PCR

个人毛根部技巧(4 - 5厘米)被切断和转移到50毫升WP介质在轨道瓶250毫升玻璃瓶保存操作60 rpm和(24±2)ºC。21 d后文化、根分离介质,无菌水清洗和用于进一步分析。确认的假定的转基因毛状根被PCR获得。基因组DNA是第一个从根部分离使用修改后的CTAB法[36]。DNA的质量和数量都核对NanoPhotometer Implen GmbH(慕尼黑;德国)。选中的转化株进行分析,使用几对引物PCR (表1)

表1:在这项研究中使用的PCR引物列表

时间,课程研究的发展改变了毛茸茸的根源

大约0.25 - 0.35 g的21天的老毛根部鲜重野生型和转基因根培养在250毫升厄伦美厄烧瓶内含有50毫升WP介质在30天。湿和干重测量测定每5天。毛根部从每个转基因克隆是收获和脱水在真空下5分钟,然后确定他们的体重。干燥后的新鲜根在孵化器56ºC 2 - 3 d得到相应的干重值。

蛋白质的提取和量化Ranalexin

从毛根部提取的蛋白质

新鲜毛状根组织陷入细粉在液态氮用杵和臼,和总可溶性蛋白提取50 mM NaH2PO4组成的缓冲,300毫米氯化钠,0.1% (w / v) Tween-20 phenylmethylsulfonyl氟化物PMSF和5毫米;pH值8。

约1克的毛根部提取提取缓冲2毫升、涡流和用7分钟。离心后的上层清液收集在15000 g×10分钟4ºC。从花中蛋白质的转化和野生型毛状根文化和58%硫酸铵沉淀4ºC。过夜。沉淀蛋白质被离心收集(12000×g, 20分钟和4ºC)。颗粒是resuspended缓冲区(50毫米不₂阿宝₄300毫米氯化钠,pH值8)和脱盐交联葡聚糖G25列(通用电气医疗集团,德国)。股票的解决方案包含1毫克/毫升蛋白质储存在-80ºC,直到用于免疫印迹分析。蛋白质浓度测定布拉德福德化验[37]。

通过免疫印迹分析ranalexin

蛋白质是由针刺(12% tricine-sodium十二烷基sulfate-polyacrylamide电泳)根据Schagger [38]。免疫印迹分析蛋白质转移到硝化纤维膜在50 V 2 h。Ranalexin检测使用HisProbe-HRP (nickel-activated辣根过氧化物酶的导数)根据制造商的指示(热费希尔科学、德国)[39]。膜然后使用Bio-Rad成像系统记录的。连续稀释的重组ranalexin[30]准备每个污点作为积极的控制。ranalexin乐队的强度量化使用ImageJ 1.45 s。

亲和纯化的重组ranalexin毛茸茸的根源

细胞内或细胞外蛋白质从1 L花中分离第一如上所述。亲和色谱法使用His-resin列应用于净化重组他ranalexin根据制造商的指令(Protino®Ni-TED, Macherey-Nagel, Duren,德国)。筛选了不同洗脱步骤被Tricine-SDSPAGE分离蛋白质和银染色。后来,纯化ranalexin脱盐使用G10(通用电气医疗集团、德国)和冻干冷冻干燥。

测定GFP表达毛茸茸的根源

荧光显微镜

荧光图像获得使用商品一体化荧光显微镜bz - 9000 e(日本基恩士)。GFP,编码在我们的表达载体,直接可视化6 to15天老转基因毛状根op - 66835 BZ过滤器。发射的荧光收集在489到514纳米之间。处理程序显微镜跟着日本基恩士提供的手册

标仪

荧光5μg总蛋白提取转换毛茸茸的根与野生型加载到96好透明标一式三份,被理查兹et al . [40]。测量进行了Tecan萨菲尔读者(瑞士Mannedorf)的激发波长488 nm的发射535海里。

转录分析

确定ranalexin基因表达水平在不同毛根转化株,总RNA从12 d老毛根部分离使用通用RNA净化设备(Roboklon)。从每个样本1μg RNA作为模板来合成第一互补脱氧核糖核酸链的供应商的指令ImProm-II™逆转录系统从Promega工具包。(qRT)一个¢€‘PCR用于分析表达水平。每个定量PCR进行三个复制。β-actin基因被用作参考。ranalexin基因的相对表达水平pK7 / ranlx和pK7 /卡尔/ ranlx行计算的WT /人力资源。

添加剂对Ranalexin分泌的影响

1毫升的PVP (360000 MW,σ)股票的解决方案(75毫克/毫升)添加到每个50毫升的毛状根培养基达到最终浓度为1.5毫克/毫升。细胞外和细胞内ranalexin以及文化是量化的生物质通过样品20 d后的文化。另外,一系列浓度的氯化钠(100至400毫米)添加到毛状根文化在15天。采集标本来确定文化生物量和ranalexin内容

抗菌活性的重组Ranalexin毛产生的根源

最低抑制浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)是由汤采用如前所述,指令后临床和实验室标准协会(CLSI)(30日,41)。多粘菌素B和万古霉素作为积极的控制而无菌水作为消极的控制。

结果

建设烟草的二进制向量变换

本构pK7WG2D二进制向量是用来表达ranalexin基因在烟草毛茸茸的根源。驱动ranalexin合成分泌通路,ranalexin基因与calreticulin融合(cal) n端信号序列。一个向量含有ranalexin基因也没有信号序列构造控制。此外,为了简化ranalexin净化,他的标签是融合的糖基ranalexin基因。两个构造(pK7WG2D / ranlx和pK7WG2D /卡尔/ ranlx)是由网关的控制下的克隆CaMV 35 s启动子(图1)。

生成和转换后的毛根部的确认

30多毛状根克隆生成后叶感染a rhizogenes ATCC15834窝藏pK7WG2D / ranlx或pK7WG2D /卡尔/ ranlx向量。消极的控制,毛状根克隆转化与a rhizogenes ATCC15834 (WT / HR)不向量也成立。卡那霉素后选择和毛状根的外表,GFP荧光(通过显微镜观察)表示一个成功的毛状根的变换技巧。

与几对引物进行PCR (表1)确认ranalexin基因整合入基因组。改变了毛根部的PCR产物的凝胶电泳显示ranalexin基因的存在在所有转基因毛状根但不是在WT /人力资源。的集成信号序列是由不同大小的检测证明乐队pK7WG2D / ranlx之间和pK7WG2D /卡尔/ ranlx改变毛根部p35区域时,T35S引物。VirC PCR产品只有在a . rhizogenes样本被发现而不是转基因毛状根(图2)。在转基因文化缺乏virC PCR产品证明没有污染的农杆菌属[42]。高校的基因发挥重要作用在毛状根诱导[43]。因此,rolC PCR产品在所有的存在改变了文化证明了成功的毛状根诱导形成。

决心改变了毛的GFP的根源

绿色荧光蛋白的荧光强度转基因毛状根被用作GFP蛋白质合成的一个指标,这有助于检测到GFP合成水平之间的差异建立线比野生型(图3一)[40]。GFP强度测定细胞外和细胞内蛋白质分数(隔绝所有的毛状根线)使用Tecan板读者。细胞内可溶性蛋白质的荧光强度与转基因毛状根(pK7WG2D /卡尔/ ranlx)远远高于(pK7WG2D / ranlx)毛状根线(图3一)。

Ranalexin基因的相对表达水平

我们从野生型中提取RNA以及改变毛根部,测量ranalexin基因转录水平定量逆转录pcr (qRT)。Ranalexin基因转录被发现在pK7 /卡尔/ ranlx和pK7 / ranlx,但不是在WT /人力资源。ranalexin基因的相对表达水平pK7 /卡尔/ ranlx行远高于pK7 / ranlx行(图3 b)。

毛状根的生长

增长pK7WG2D / ranlx pK7WG2D /卡尔/ ranlx线条和野生型毛根部进行调查后3 - 4亚文化超过30 d。干和新鲜的模式所有行(的增长几乎是类似的图4一和4 b)所有克隆表现出类似的迟滞期第一天至5;发现一个常数比生长速率之间的5到20天。又一天20增长率下降,固定相在25到30天了。新鲜的生物质pK7WG2D /卡尔/ ranlx毛状根线(6.37±0。28克/瓶)明显高于pK7WG2D / ranlx线(5.64±0.2克/瓶)在20天。

生产分泌和亲和纯化的重组Ranalexin毛茸茸的根源

细胞内的表达水平和细胞外重组ranalexin记录图5。细胞内的收益率ranalexin (pK7WG2D / ranlx)是相对较低的0.83%,达到最大TSP(总可溶性蛋白)在20天文化。然而,较高的表达水平检测pK7WG2D /卡尔/ ranlx文化(TSP约3.3%;(图5一个))。正如所料,ranalexin并不分泌到培养基中从pK7WG2D / ranlx文化,而pK7WG2D /卡尔/ ranlx文化显示增加分泌从10到25天的最高产量约0.28μg /毫升(图5 b)。这些结果与免疫印迹结果(图5 c);一群~ 3 kda观察两种细胞提取物pK7WG2D / ranlx和pK7WG2D /卡尔/ ranlx缺席WT /人力资源野生型细胞提取的毛茸茸的根源。细胞外蛋白质从花中所收集的材料和方法和polyhistidine-tagged ranalexin被亲和色谱法纯化。图5 d介绍了重组的纯化步骤ranalexin从花中。从Ni-Ted列His-tagged ranalexin筛选了200毫米咪唑。

PVP和氯化钠的效果

PVP和氯化钠的作用ranalexin复苏研究pK7WG2D /卡尔/ ranlx文化。虽然没有注意到在细胞内ranalexin效应,PVP显著增强的分泌水平ranalexin 25天达到1.68μg /毫升约6倍的收益率在未经处理的文化(图6)在不影响文化新的生物质(图6 b)。这些结果证实了免疫印迹(图6 c)。令人惊讶的是,氯化钠添加到培养基不刺激分泌ranalexin即使在较高的浓度(数据未显示)。

抗菌活性的重组Ranalexin毛产生的根源

纯化重组ranalexin脱盐和测试体外对几个标准和临床病原体(表2)。重组ranalexin生物活性,表现出很强的抗菌活性对所有测试细菌包括抗多种抗菌素的金黄色葡萄球菌耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,vancomycin-resistant VRE肠球菌,酿脓链球菌、大肠杆菌、不动杆菌baumanii以及临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分离株与麦克风之间的值8和64μg /毫升。此外,最小杀菌活动(MBCs)的重组ranalexin双重高于相应的MIC值对所有菌株除了酿脓链球菌。PVP和生理盐水治疗对ranalexin的抗菌活性没有影响。

表2:麦克风和MBC值重组ranalexin对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。每个值代表三个独立实验的意思

讨论

毛状根文化曾产生各种有价值的诊断和治疗用重组蛋白[44]。与动物细胞培养系统相比,植物细胞的使用减少了污染风险animalderived病原体在一个简单的和相对廉价的媒介。产品回收时可能会促进蛋白质分泌到培养基[20]。

据我们所知,ranalexin尚未表达在植物组织培养或甚至在转基因植物。然而,一些报告其他安培在转基因植物的表达——持续或病原体入侵后用归纳法都行——显示增加抵抗病原体感染(5、8)。在我们的研究中建立了两条毛状根线窝藏二进制向量与ranalexin基因单独或与ranalexin融合在其N -末端ER信号肽。rt - pcr数据显示更高的ranalexin基因表达水平与pK7根转换/卡尔/ ranlx。虽然基因表达通常不与蛋白质合成有关;我们的研究结果显示,重组ranalexin的生产水平的存在信号肽是在TSP(4倍)远高于相应的转化株缺乏信号序列。这种增强的生产水平是在良好的协议与其他研究(14,45岁)。一些植物中产生安培,尤其是cecropin B,被内源性肽酶降解,这可能是负责矛盾影响植物的抗病性(18、19)。针对ranalexin内质网(ER)显然不仅改善积累水平(由于低水解活动腔)但也支持正确的折叠,以及分泌到培养基(17日46)。

提到同样重要的是,安培的表达在早先的研究中通常是一个强大的控制下本构CaMV 35 s启动子或其衍生品这似乎负责植物AMP含量不足导致转基因沉默[47]。易et al .,也报道,多个插入CaMV 35 s启动子可能造成的负面影响,这表明提高ranalexin的表达水平的能力从毛状根文化在将来的研究中通过改变子[48]。

此外,离子部队之间的高度差异带正电ranalexin——(融合6他的标签-π值为9.39),可以增强其约束力的细胞壁和限制其分泌到培养基中在以前的研究报告(49,50)。然而,将氯化钠添加到培养基没有影响的分泌ranalexin(数据没有显示)。

细胞外ranalexin水平转换pK7WG2D /卡尔/ ranlx相比相对较低,如果分泌抗体从烟草毛根部[44,51岁,52]。减少细胞外ranalexin水平后25天文化(图5 b)是类似于其他细胞外蛋白质生产之前在烟草毛根部[17日,51岁,53岁,54]。原因损失在无菌培养基仍不清楚,但可能是由于培养基的变化的指数增长阶段,这经验显著增加介质蛋白酶以及表面吸附至培养瓶[55]。

显著增强(6.1折)的分泌水平ranalexin毛状根文化的观察后添加PVP作为稳定剂,可能是因为它可以干扰ranalexin吸附表面通过修改环境可能使其变性和坚持在培养皿表面[17,56岁的57]。其他细胞外蛋白质稳定了PVP(51岁,52岁,58)。

活动的细胞内和细胞外ranalexin几个人类细菌菌株显示没有改变其活动甚至在PVP添加到培养基中记录表2。这些结果与我们之前的协议研究与分泌ranalexin获得重组毕赤酵母属pastoris [30]。

结论

生物合成的ranalexin毛茸茸的根源及其分泌到培养基中可能是一个有趣的替代为其在生物反应器大规模生产系统。然而,一些功能需要优化比报道在这项研究中获得更高的收益。由于重组ranalexin对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌抗多种抗菌素的杀菌,它可能是一个有趣的候选人作为紧急药物的败血症时快速需要化疗或局部应用。Ranalexin单独或结合其他抗生素需要评估在临床研究证明其功效在临床上下文。

确认

我们感谢教授k . Heeg博士和美国齐默尔曼提供访问传染病部门的实验室设施,海德堡大学医学微生物学和卫生。我们感谢教授格林尼r .地狱博士和美国(因为有机体的研究中心,海德堡)有用的意见和建议。r . a . Aleinein感谢叙利亚外交部高教育和特斯尹大学,叙利亚提供金融支持

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