孜然籽提取物在预防7,12 -二甲基苯(a)蒽诱导的皮肤癌中的作用

摘要

孜然籽提取物(SCE)对7,12-二甲基苯(a)蒽(DMBA)致小鼠皮肤癌的化学防癌和抗氧化作用研究。将动物按处理方式分为4组，I组和II组小鼠分别作为载体处理和SCE处理的对照组。为了诱导皮肤肿瘤，III组和IV组小鼠局部应用7,12-二甲基苯(a)蒽(DMBA)， 2周后重复应用巴豆油(1%丙酮)，每周3次，持续到实验结束(即16周)。IV组小鼠在给药前后给予孜然籽提取物(SCE)。本研究结果显示，实验结束时，IV组小鼠的乳头状瘤发病率、累积数量、肿瘤产量和肿瘤负担均明显低于单用DMBA。肿瘤重量和体积也显著减少。减少乳头状瘤的发生率和数量，瘤前病变，被认为是评估的平均值。IV组的脂质过氧化水平显著(p<0.01)下降，抗氧化剂(谷胱甘肽、SOD、维生素c)活性和总蛋白水平显著(p<0.01-p<0.001)增强。SCE还发现有可能减少DMBA引起的肿瘤组织病理病变。从本研究可以推断，苦参具有化学致癌的化学预防和抗氧化潜力。这种化学预防活性可能与提取物中存在的抗氧化/自由基清除成分有关。

关键字

7,12-二甲基苯(a)蒽(DMBA)，致癌作用，抗氧化，瑞士白化小鼠。

介绍

尽管全世界无数的研究人员都在努力改善癌症的悲惨后果，但它仍然是人类的一个巨大负担。癌症起源于我们自己的细胞，但一些影响我们日常生活的内在和外在因素，会增加我们一生中患癌症的风险。虽然癌症本身不具有传染性，但某些感染可以作为诱发和促进癌症发展的刺激因素。此外，许多化学品、工业废水、一些治疗药物和包括电离辐射在内的致突变剂等环境污染物可增加癌症的发病率。大约50%的癌症是由生活方式引起的。饮食、吸烟习惯和饮酒，以及接触工业毒素。

在小鼠皮肤和可能的人类皮肤中，化学和紫外线辐射诱导的癌变是一个循序渐进的过程，至少有三个不同的阶段:起始、促进和进展[1]。肿瘤可由单剂量的致癌物如7,12 -二甲基苯(a)蒽(DMBA)引发，随后重复应用肿瘤促进剂如TPA [2]。不断增加的皮肤癌发病率和死亡率在人类和经济方面都是令人担忧和昂贵的。需要新的战略来防治这一疾病。癌症化疗预防的目标是通过识别和消除称为上皮内肿瘤的癌前病变和/或早期发现微创性癌症来降低癌症的发病率、发病率和死亡率。

草药的需求量很大，发达的药物带来了许多问题。要解决这一问题以及发展中国家的初级卫生保健问题，首要任务是选择具有广泛生物活性、安全性高、治疗利润大、成本低的植物材料。阿育吠陀是一种传统的印度植物药物医学，从很早就开始使用这些天然药物，并通过各种治疗方法预防或抑制各种肿瘤。近年来，植物化学物质及其对人体健康的影响得到了广泛的研究。特别是，在蔬菜、水果、茶叶、香料和草药中寻找抗氧化剂、降糖剂和抗癌剂引起了极大的关注。

一些有用的具有药用价值的植物药物包括长春碱、长春新碱、紫杉醇、鬼臼毒素、喜树碱、洋地黄黄素、吉他黄黄素、地高黄黄素、土瓜碱、吗啡、可待因、阿司匹林、阿托品、毛果卡品、辣椒素、大蒜素、姜黄素、青蒿素和麻黄碱等。［3.在某些情况下，药用植物的粗提物可以用作药物。另一方面，分离和鉴定药物的活性原理和阐明药物的作用机制是至关重要的。因此，对传统药物和单一活性化合物的混合研究非常重要[3.]。

美国cumini(l)在印度民间传说的医学系统中，Skeels被认为具有几种药用特性[4]。这种植物的树皮有涩味、甜味、冷冻、驱虫、利尿、消化、抗蠕虫、退热、便秘、健胃和抗菌的作用。果实和种子用于治疗糖尿病、咽炎、脾病、尿道炎和癣感染。叶子被广泛用于治疗糖尿病，便秘[5]、白带、胃痛、发烧、胃病、痉挛及皮肤病[4]，以及抑制粪便中的血液排出[5]。

因此，本研究旨在评价黄芪种子提取物的有效性气味清香cumini在改变致癌过程，以及氧化应激在DMBA诱导的皮肤癌。

材料与方法

动物的护理和处理由我们机构的伦理委员会批准，并根据瑞士日内瓦的世界卫生组织和印度新德里的印度国家科学院制定的指导方针进行。肿瘤发生的抑制作用气味清香cumini评估种子提取物对两阶段皮肤癌发生的影响，由单次应用DMBA(引发剂)诱导，两周后，通过每周三次重复应用巴豆油(促进剂)促进，遵循该方案持续16周[2]。

动物

该研究是在随机繁殖的7-8周龄、体重24±2克的瑞士白化雄性小鼠上进行的。这些动物被关在动物房里的聚丙烯笼子里，在受控的温度(25°C±2°C)和光照条件下(14光:10暗)。这些动物被喂食从印度昌迪加尔的Aashirwad Industries采购的标准小鼠饲料和自由用水。8只动物被关在一个聚丙烯塑料笼子里，笼子里装有锯屑(当地采购)作为垫料。为了预防感染，每两周给这些动物喂一次盐酸四环素水。

化学物质

7,12 -二甲基苯(a)蒽(DMBA)和巴豆油采购自美国Sigma化学公司。DMBA以100 μg/ 100μl的浓度溶解于丙酮中。巴豆油与丙酮混合，得到稀释1%的溶液。

植物材料和提取物制剂

的果实气味清香cumini经适当鉴定后就地采集。植物的鉴定气味清香cuminiL.(科:Myrtaceae)由印度拉贾斯坦邦斋浦尔拉贾斯坦大学植物系植物标本室的植物学家(证明标本号:RUBL- 20425)完成。将果肉从水果中取出，将种子适当清洗并遮光干燥，然后将水果磨成粉末，在混合物中加入双蒸馏水(DDW)和酒精(3:1)，在40ºC下回流36 (12 x 3)小时，制备水-酒精提取物。通过蒸发其液体内容物来冷却和浓缩提取物。准备的气味清香cumini提取物(SCE)低温保存，直到进一步使用，并在DDW中重新溶解，然后口服给药小鼠。

实验设计

在化学处理前2天，将瑞士白化小鼠的背侧皮肤(直径2 cm)剃光，选择生长周期静息期的动物进行实验。从近交系群体中选取小鼠分为以下5组:

第一组:经车辆处理的对照组

实验组动物在剃须后的背部皮肤上涂抹丙酮(100 μl/只)和双蒸馏水
口服相当于SCE (100 μl/只/天)16周。

第二组:药物(SCE)治疗对照

这些动物在整个实验期间(即16周)单独口服SCE (125 mg/kg b. wt./只/天)。

第三组:致癌物处理对照

将100 μg DMBA溶于100 μl丙酮，单次涂抹在小鼠剃须部位。两个星期
随后，每周涂抹三次巴豆油(1%巴豆油丙酮)，直到实验结束(即16周)。

iv组:SCE处理试验组

本组动物从应用DMBA前7天开始口服SCE (125 mg/kg b. wt./只/天)
并一直持续到实验结束(即16周)，并作为启动前后组。

对以下形态参数进行了研究

形态学参数

肿瘤发生率:携带至少一种肿瘤的小鼠数量以发病率百分比表示。
肿瘤的产生:每只小鼠乳头状瘤的平均数量。
肿瘤负担:每只荷瘤小鼠的平均肿瘤数。
直径:测量每个肿瘤的直径。
重量:在每次实验结束时，测量每只动物的肿瘤重量。
体重:每周测量小鼠的体重。
平均潜伏期:在应用促进剂和50%的肿瘤出现之间的时间间隔被确定。平均潜伏期是用每周出现的肿瘤数乘以使用促进剂后数周内的时间，并除以肿瘤总数。

其中F是每周出现肿瘤的数量，X是周数，n是肿瘤的总数。

生化研究

在小鼠肝脏和皮肤中估计了以下生化参数。

脂质过氧化(LPO)

采用Ohkhawa所述的硫代巴比妥酸反应物质法(TBARS)分光光度法测定LPO水平et al。(1979) (6]。简单地说，将硫代巴比妥酸(0.6%)、十二烷基硫酸钠(0.1%)和三氯乙酸(20%)加入上述制备的组织匀浆(10%)200 μl中。将该混合物加热60分钟，冷却后，用正丁醇-吡啶(15:1)萃取，光密度(OD)记录在532 nm，含量以nmol/mg组织表示。

还原性谷胱甘肽

谷胱甘肽的水平以总非蛋白巯基为指标，采用Moron法测定et al。(1979) (7]。匀浆立即用100 μl 25%三氯乙酸(TCA)沉淀，离心除去沉淀。将溶解于0.2 M磷酸盐缓冲液(pH 8.0)的0.6 mM 5,5 '二硫代双(2-硝基苯甲酸)200 μl加入到100 μl上清液中，在3ml的总体积中测定游离内源性sh，并用紫外-可见(UV-VIS) Systronics分光光度计在412 nm处记录吸光度。以还原型谷胱甘肽(GSH)为标准，以μmol/gm组织表达。

过氧化氢酶

采用Aebi法测定过氧化氢酶活性。8]。加入H后，在240 nm处用分光光度法测定吸光度的变化₂O₂(30 mM)至100 μL上清液(皮肤匀浆的10%在50 mM磷酸盐缓冲液中制备，离心10分钟)加入50 mM磷酸盐缓冲液(pH 7)中。酶活性以U/mg组织表示，其中U为μmol of H₂O₂失踪/分钟。

总蛋白

总蛋白用Lowery法测定et al。， [9]，以牛血清白蛋白为标准品，含量以mg/ gm表示。

超氧化物歧化酶

SOD测定采用Marklund和Marklund [10]，结果以单位/mg蛋白表示。在Tris-HCL缓冲液(50 mM, pH-7.5)中，通过增加420 nm的吸光度来测量邻苯三酚的自动氧化。

维生素c

为此，称量组织和新鲜器官，均质于醋酸缓冲液(20 mg/ ml)中，用4%三氯乙酸冷萃取，离心并过滤。抗坏血酸的测定采用Roe和Kuether法[11]。

组织病理学研究

切除肿瘤和正常皮肤，立即用10%福尔马林固定液固定24小时。然后将组织在上升系列的酒精中脱水，用石蜡包埋，切下5微米厚的切片，在二甲苯中脱蜡，在下降浓度的乙醇中再水化，用苏木精和伊红染色。在光学显微镜下观察。

统计分析

对不同实验组数据进行分析，用mean + SD表示。用Student 's t检验对致癌物处理对照组和SCE处理实验组的显著性差异进行统计学分析。

结果

对照组(I组和II组)均无肿瘤发生。所有接受致癌物治疗的对照组(Group-III)动物的皮肤均出现乳头状瘤，其中单次局部应用DMBA, 2周后重复应用巴豆油，即在III组中记录的发病率为100% (Figure.1)。整个实验期间诱发的乳头状瘤累积数量为68 (图。2)。每只荷瘤小鼠的平均肿瘤数(肿瘤负担)和肿瘤产量为8.5 (图3和4)，平均潜伏期为7.88周(图。5)。

第四组小鼠连续给予S.cumini与致癌物治疗的对照组(I组)相比，在起始期前后口服提取物，显示肿瘤发生率显著降低(62.5%)(数字： 1)。观察期间(即16周)产生的乳头状瘤的累积数量明显少于接受致癌物治疗的对照组(76.47%)。图。2)。

在dmba诱导的乳头状瘤发生前后(IV组)口服SCE可将肿瘤负担和肿瘤产量分别降低至3.2(62.35%)和2(76.47%)(图3和4)在应用促进剂和50%肿瘤出现之间的时间间隔，即在IV组中，平均潜伏期为11.75周(49.11%)，在应用DMBA前7天给予SCE，并持续整个实验期间(图。5)。与致癌物处理对照组(138.87 mg)相比，SCE处理动物的肿瘤平均重量也显著降低至45.5 mg (67.23%) (表1)。

各组动物肝脏和皮肤中TBARS、总蛋白和抗氧化剂(GSH、SOD、CAT和维生素C)的水平为7 - 12的数字。．与载体处理对照组(I组)相比，致癌物处理对照组(III组)的TBARS浓度显著(p<0.001)增加，而抗氧化剂和总蛋白的状态显著(p<0.001)降低。

肝脏和皮肤中的脂质过氧化，以TBARS表示，在启动期前后(IV组)，与致癌物处理对照组(III组)相比，显著降低(p<0.001)。在启动期前后，口服SCE给dmba涂漆的动物(IV组)，TBARS浓度显著恢复到接近正常的水平。

与致癌物治疗对照组(III组)相比，在启动前后阶段(IV组)SCE治疗显著(p<0.01-p<0.001)提高了肝脏和皮肤抗氧化剂和总蛋白水平。

用S.cumini单独提取物(组II)与对照动物(组I)相比，TBARS、蛋白质和抗氧化剂状态无显著差异。

E-表皮，D-真皮层，B-基底层，H.K-角化过度，E.H-表皮增生，D.I.-真皮浸润，S.G-皮脂腺，Ac-棘突病，H.C-角质囊肿，p.h.c -伪角质囊肿，Rd-淋巴细胞减少基质，t.n. -肿瘤巢

经致癌物处理的对照动物皮肤组织病理学检查显示，表皮各层细胞核不典型(增大、深染)，表皮严重增生，表皮侵犯真皮。在SCE治疗的实验动物(IV组)中，所有这些症状都被发现是最小的(图13。．a e)。癌原治疗对照组(III组)肿瘤表现为分化良好的鳞状细胞癌，棘层严重，间质减少，有淋巴细胞，角质珍珠明显增多，且大小较大S.cumini在起始前后给予提取物组(IV组)可见低分化的乳头状瘤，数量较少，角质珍珠大小较小。

讨论

7,12-二甲基苯[a]蒽(DMBA)是研究最好的多环芳烃(PAH)，广泛用于实验致癌[12，13]。P450通过AhR激活代谢是多环芳烃癌变的第一步。DMBA的代谢有很好的特征[14，15，16]。简单地说，P450将DMBA氧化为3,4-环氧化合物，然后由mEH水解为近似形式3,4-二醇。这种代谢物再次被P450氧化为最终形式，3,4-二醇-1,2-环氧化物，能够以共价结合到DNA并引起基因突变。

多环芳烃(PAH)的作用显然与致癌过程有关，特别是7,12-二甲基苯蒽(DMBA)，它是已知最有效的皮肤和乳房致癌物之一[17]。

在本研究中，DMBA的毒性作用显著降低了致癌物处理的对照组小鼠的体重和肿瘤大小。这种体重减轻和肿瘤大小在起始前后通过SCE治疗得到纠正。局部应用DMBA显著增加了乳头状瘤的发病率、累积数量、肿瘤产量和肿瘤负担，而降低了致癌物处理对照(III组)动物的平均潜伏期，因为已发现DMBA在代谢激活后，通过将二环氧化合物和其他ROS结合到DNA中，通过氧化介导的遗传毒性诱导癌症[18，19]。

细胞大分子的氧化损伤可能通过ROS的过量产生和错误的抗氧化剂和/或DNA修复机制而发生，从而导致癌症[20.]。ROS可诱导多种转录因子，如核因子κB (NFκB)和AP-1，已知它们对炎症、细胞增殖和凋亡有直接影响，从而使ROS在肿瘤促进中发挥作用[21]。因此，服用抗氧化剂可能会延缓这一过程。

口服S.cumini实验16周后，起始期和起始后提取液(IV组)显著降低dmba -巴豆油所致皮肤乳头状瘤的发生。此外，在整个实验期间，IV组的乳头状瘤累积数量、肿瘤产量和肿瘤负担明显低于致癌物处理对照组(III组)。

在本实验中，抑制肿瘤发生和减少氧化应激可能是因为这种植物提取物中存在几种植物化学物质，如乙酰齐墩果酸、三萜、鞣花酸、异槲皮素、槲皮素、山奈酚和杨梅素[22，23]。据报道，这些化合物大多具有抗氧化和清除自由基的活性[24]。

这些结果表明，SCE对dmba -巴豆油诱导的皮肤致癌具有抗肿瘤潜力，这可能是由于植物成分(即多酚类，黄酮类(槲皮素，霉菌素)，皂苷和单宁)存在于种子S.cumini．霉菌素抑制佛波酯诱导的COX-2蛋白上调[25]。如早前报导，慢性炎症易导致恶性肿瘤[26]而姜黄素通过抑制佛波酯诱导的COX-2蛋白表达来发挥抗炎和化学预防作用[27]。槲皮素是膳食中含量最丰富的类黄酮之一，可以在损伤发生时阻止细胞周期，从而抑制癌症的发生，这在本研究中得到了清晰的反映。

这些发现也得到了其他一些发现的支持。多项研究表明，中草药含有多种天然抗氧化剂，如酚酸、类黄酮和单宁，这些抗氧化活性比普通膳食植物更强[28，29]。近年来，根据中药材分类，一类“清热”类植物因在抗炎、抗肿瘤、抗过敏、抗病毒和抗菌等方面表现出显著活性而备受关注[30.，31]。

组织病理学检查显示，载药处理组(组I)和SCE处理对照组(组II)的皮肤结构正常。DNA是DMBA的靶分子，代谢激活DMBA可与DNA结合形成加合物[32]，导致突变[33]，进而诱导肿瘤形成[34]。在DMBA/ tpa诱导的小鼠皮肤乳头状瘤中，H-ras癌基因密码子61的A向T突变高度一致[35]。

致癌物处理对照组(ⅲ组)小鼠皮肤出现严重的表皮增生、真皮浸润和角化过度，肿瘤组织学表现为分化良好的鳞状细胞乳头状瘤，细胞核深染，间质减少，淋巴细胞大量。另一方面，在起始期前后接受SCE治疗的小鼠的肿瘤和皮肤中，低分化乳头状瘤和所有这些病变的范围都相对较小(IV组)。

表皮增生的增加可导致突变克隆的建立和发展，最终可导致乳头状瘤。细胞死亡是大多数后生动物正常生理机能的一部分。在发育过程中，不需要的细胞通过程序性细胞死亡被移除，对形态发生、器官发生和其他过程做出重要贡献。［36细胞死亡机制的缺陷阻止了细胞的程序性翻转，它会增加不希望的细胞积累、遗传不稳定性、延长细胞寿命并允许细胞在暂停状态下存活。因此，细胞凋亡缺陷可能间接促进癌症的发生。IV组DMBA诱导的病变均减少S.cumini种子提取物的作用可能是抑制DMBA介导的靶部位细胞增殖和诱导细胞凋亡。

丙二醛的形成被认为是脂质过氧化导致细胞损伤的一个指标。在致癌物处理对照组(III组)的荷瘤动物肝脏和皮肤中，观察到脂质过氧化物升高，表现为MDA升高，总蛋白降低。DMBA在体内诱导肝脏发生临界氧化损伤[37，38]。LPO在致癌过程中显著升高可能是由于活性氧(ROS)水平异常所致。ROS的产生超过了细胞的抗氧化能力，可能导致脂质、蛋白质、RNA和DNA的损伤或其他影响[39]。

与对照对照相比，经致癌物处理的对照组小鼠肝脏和皮肤中抗氧化剂，如SOD、CAT和维生素c的活性显著降低。这些结果与其他人的发现是一致的[40，41]。

SOD在癌变的起始和促进/转化阶段发挥抗癌抑制剂的作用[42]。超氧自由基可被超氧歧化酶还原生成H₂O₂和氧气。过氧化氢酶是一种将H₂O₂到中性产品，如O₂和H₂O₂．与致癌物处理对照组(III组)相比，SCE提取物显著提高了IV组动物肝脏和皮肤的SOD、CAT和维生素c的抗氧化活性，显著降低了肝脏和皮肤的脂质过氧化。

抗氧化活性尤金尼亚jambolana可归因于酚类化合物的存在，因为它们被认为是负责植物材料抗氧化活性的主要植物化学物质[43，44]。类酚类化合物如类黄酮、酚酸和单宁具有多种生物活性，如抗炎和抗动脉粥样硬化活性，这可能与其抗氧化能力有关[45]。

经致癌物处理的对照组肝脏和皮肤维生素C水平明显下降。维生素C水平的下降可能是由于在捕获由DMBA产生的氧自由基方面的利用增加。维生素C是一种重要的抗氧化剂，特别能保护脂质免受水溶液的过氧化损伤，从而阻止癌变的发生[46]。S.cumini提取物处理提高SCE处理动物肝脏和皮肤(IV组)维生素c水平，可能有助于中和DMBA诱导的自由基，保护细胞免受氧化损伤。沙玛et al。［47]提出，几种药用植物及其成分可能通过清除活性氧和改善抗氧化防御系统来发挥化学预防作用。

结论

从目前的研究，可以推断气味清香cumini在哺乳动物体内具有抗化学致癌和抗氧化潜能。这种化学预防活性可能与提取物中存在的抗氧化/自由基清除成分有关。

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