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e-ISSN号:2581 - 3897
2食品卫生、动物卫生研究所Kafrelsheikh分支,埃及
收到日期:26/11/2015接受日期:07/03/2016发表日期:15/03/2016
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总共有一百婴儿奶粉样本收集来自不同药店Kafrelsheikh省的细菌检查。结果表明,b .仙人掌中检测出19%和11%(形成孢子形式)检查样品的平均数量为1.2×102±5.2×102和4.0×102±1.4×102 cfu / g,分别。随后,PCR检测识别2毒性基因30分离菌株的应用。PCR目标选择使用FHBLC hblc基因(F)和FHBLC (R)引物,并使用FCytK cytK基因(F)和FR2ytK (R)引物。8(42%)的营养b .仙人掌隔离hblC基因,和3隔离cytK基因,而7隔离有两个基因。11 b的仙人掌孢子菌株、4隔离hblC基因,2 cytK基因和2有两个基因。此外,阪崎肠杆菌可以隔离3%的检验样本,而salmonellae未能被发现在任何检查的样本。此外,4株,一个携带hblC基因,一个携带cytK基因,一个携带基因和基因的一个不带任何实验接种到还原奶粉浓度持续从5×10到1.6×102 cfu /毫升。接种牛奶样本孵化25ºC和检查b .昙花,计数每个2 h 6 h存储。有显著增加的昙花,生物体的计数没有意义区别b .仙人掌接种基因。 The results concluded that infant milk powder in spite of its low moisture content may at times suitable for supporting the growth of these organisms and subsequently be responsible for food poisoning to infants. The public health importance of the isolated microorganisms was discussed.
婴儿奶粉,b的仙人掌肠毒素,阪崎肠杆菌,Salmonellae。
婴幼儿配方奶粉(论坛)多年来一直用来喂养数以百万计的婴儿,它构成了全球大部分的婴儿配方奶粉。本产品是制定模仿人类母乳的营养成分。论坛不是无菌产品,它是一个很好的媒介支持细菌生长可能含有病原微生物能引起很严重的疾病在婴儿1]。
它不可能通过现有技术生产低水平的微生物的论坛都没有。后期处理污染是一个主要的因素影响污染的奶粉,作为原料通常是受到致命的温度,消除营养细胞的病原体。奶粉爆发证明故障预防系统等存在的水使微生物增殖,或区域难以维护和清洁是污染的来源2]。
b的仙人掌是与论坛相关的主要微生物污染据粮农组织/世卫组织专家咨询(3)和低的数量b的仙人掌出现在婴儿配方奶粉是由于环境污染的原料奶(4]。
b的仙人掌据报道5产生肠毒素和1催吐剂毒素,其中,heamolysine提单(HBL)和非heamolytic肠毒素(新人道)由3种不同exo-proteins而其他毒素,Ent调频,公元前cyt K和T由单一的蛋白质(5]。
2004年,一个专家会议召开的联合国粮食及农业组织和世界卫生组织得出结论,最大的担心在论坛的微生物沙门氏菌和肠杆菌坂(6]。
奶粉配方的重要来源阪崎肠杆菌感染。这种细菌抵抗干燥和酸性pH值,热,生物膜的形成和坚持在食品制备过程中表面和新生儿感染阪崎肠杆菌有关与婴儿配方奶粉(7]。低污染的婴幼儿配方奶粉与salmonellae与感染有关婴儿(8]。
我们所知,有一个小的数据与各种各样的生态毒性b的仙人掌在婴儿奶粉中发现Kafrelsheikh省,埃及。因此,本研究的目的是确定的流行b的仙人掌(营养和孢子前),阪崎肠杆菌和Salmonellae生产和检测的肠毒素基因b的仙人掌(hblc & cytk)在婴儿奶粉和研究存储时间的增长的影响b的仙人掌在重组婴儿奶粉储存在室温下保证安全的婴儿奶粉的消费。
本研究进行了一百个随机样本收集的婴儿奶粉从当地不同的药店Kafrelshiekh省,埃及2015年1月至7月期间。样品在他们的包都被转移到实验室检查细菌。
制备连续稀释(9]
每个婴儿奶粉混合之前被无菌包打开。11 g的混合奶粉被转移到89毫升无菌0.1%蛋白胨水(40º四十五ºC)使用干燥、无菌金属铲给1:10稀释,然后准备了串行稀释10倍。
细菌检验
枚举、隔离和标识的b .仙人掌的营养形式:这样做是根据霍尔布鲁克和安德森(10)使用polymyxine puruvate蛋黄-甘露醇溴麝香草酚蓝琼脂(PEMPA)和细菌隔离被确定为B.cereus
枚举(或然数/ g),分离和鉴定的孢子前b的仙人掌:这是根据波兰执行标准PN - EN ISO 21871 (11]。增长——积极管(浑浊)是他们的亚文化PEMPA介质(Oxoid),盘子被孵化30ºC 48 h。b .仙人掌群孢子的总计数1 g的婴儿奶粉是由或然数(最有可能的数字)方法。孤立的生物的生化鉴定是根据Koneman et al。12]。
hblC与cytK检测基因的分离菌株营养和孢子前b昙花,利用PCR技术:应用PCR鉴定的heamolysin提单(hblC)和细胞毒性K (cytK)基因b .仙人掌进行本质上的引物(法玛西亚生物技术)所示表1。
| 目标基因 | 引物 | 寡核苷酸序列(5′→3′) | 产品尺寸(bp) | 引用 |
|---|---|---|---|---|
| hblC | FHblC (F) | 5′CCTATCAATACTCTCGCAA′3 | 695年 | (13] |
| FHblC(右) | 5′TTTCCTTTGTTATACGCTGC′3 | |||
| cytK | FCytK (F) | 5′CGACGTCACAAGTTGTAACA′3 | 565年 | (13] |
| FR2ytK(右) | 5′CGTGTGTAAATACCCCAGTT′3 |
表1。hblC & cytK基因的识别B.cereus使用引物了。
分离和鉴定大肠sakazaki我:根据美国食品药品管理局(14]。
Salmonellae隔离和标识:根据美国食品药品管理局(15]。
增长字符的昙花,还原奶粉
细菌的股票文化:b .仙人掌应变在10毫升无菌培养大豆胰蛋白酶的肉汤(TSB)。汤是在37°C孵化24小时然后离心机在3000 rpm。浮在表面的删除,剩余的细胞re-suspended无菌dist.水。连续稀释准备从每个股票从每个管扩散管和100 ul之前准备PEMPA盘子。板块在35ºC孵化24 h和菌落形成单位/毫升计算。
实验接种:1000毫升的还原奶粉添加到五无菌烧瓶(200毫升)。烧瓶是接种b .仙人掌负hblC & cytKb的仙人掌+ ve hblC,b的仙人掌+ ve cytK和b的仙人掌+ ve hblC & cytK每个瓶中的每个应变。烧瓶有效用软木塞塞住,孵化25°C和检查每个2 h,直到6 h(存储b的仙人掌计数。
| 类型的样本 | 不。检查样品 | 积极的样品 | 结果/ g | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 不。 | % | 最低 | 最大 | 的意思是 | SEM± | ||
| 婴儿奶粉 | One hundred. | 19 | 19 | 1×10 | 9×102 | 1.2×102 | 5.2×10 |
表2。蜡样芽胞杆菌数统计分析结果(生长型)检查婴儿奶粉样品海拔琼脂媒体。
| 类型的样本 | 不。检查样品 | 积极的样品 | 或然数/ g | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 不。 | % | 最低 | 最大 | 的意思是 | SEM± | ||
| 婴儿奶粉 | One hundred. | 11 | 11 | 2.3×10 | 1.1×103 | 4.0×102 | 1.4×102 |
表3。蜡样芽胞杆菌的统计分析结果(孢子前)计数的或然数/ g检查婴儿奶粉样品。
| 类型的样本 | 不。的隔离 | 积极的hblC基因只 | 积极的cytK基因只 | 积极的hblC&cytK基因 | 负hblC&cytK基因 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 没有隔离的 | % | 不。的隔离 | % | 不。的隔离 | % | 不。的隔离 | % | ||
| 婴儿奶粉 | 19 | 8 | 42 | 3 | 15 | 7 | 36 | 1 | 5.4 |
表4。检测肠毒素基因(hblC和cytK)蜡样芽胞杆菌(生长型)隔离检查婴儿奶粉样品。
图1:琼脂糖凝胶电泳的多重PCR hblC(695个基点)和cytK(565个基点)毒性基因植物的特征b的仙人掌。
| 类型的样本 | 不。的隔离 | 积极的hblC基因只 | 积极的cytK基因只 | 积极的hblC&cytK基因 | 负hblC&cytK基因 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 没有隔离的 | % | 不。的隔离 | % | 不。的隔离 | % | 不。的隔离 | % | ||
| 婴儿奶粉 | 11 | 4 | 36.4 | 2 | 18.2 | 2 | 18.2 | 3 | 27.3 |
表5所示。检测肠毒素基因(hblC和cytK) b .仙人掌(孢子前)隔离检查婴儿奶粉样品。
图2:琼脂糖凝胶电泳的多重PCR hblC(695个基点)和cytK(565个基点)毒性基因形成孢子的特性b的仙人掌。
| 类型的样品 | 不。检查样品 | 积极的样品 | |
|---|---|---|---|
| 不。 | % | ||
| 婴儿奶粉样品 | One hundred. | 3 | 3 |
表6所示。的发病率阪崎肠杆菌在检查了婴儿奶粉样品VRBG媒体。
| 病原体 | 婴儿奶粉样品 | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| 兼容的样品 | 不兼容的样品 | 标准 | |||
| 不。 | % | 不。 | % | ||
| B.cereus(营养) | 15 | 79年 | 4 | 21 | ≤100 / g。食品及药物管理局(16] |
| b的仙人掌(形成孢子) | 4 | 36 | 7 | 64年 | ≤100 / g。食品及药物管理局(16] |
| E.sakazakii | 97年 | 97年 | 3 | 3 | 在10 g示例缺席。 |
| CAC (17] | |||||
| Salmonellae | One hundred. | One hundred. | 0 | 0 | 缺席。食品及药物管理局(16] |
表7。比较从婴儿奶粉样品分离出病原体的食品及药物管理局(16]和CAC [17)标准(n = 100)。
| 类型的样品 | 不。的隔离 | 生化试验 | |
|---|---|---|---|
| 不。 | % | ||
| 婴儿奶粉 | 5 | 0 | 0 |
表8所示。发病率的沙门氏菌检测婴儿奶粉样品(n = 100)。
| 菌株 | StorageTime | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 零时间 | 2 h | 4 h | 6小时 | ||||
| Cfu /毫升 | cfu /毫升 | %的增长 | cfu /毫升 | %的增长 | cfu /毫升 | %的增长 | |
| 控制负 | 负 | 负 | 0 | 负 | 0 | 负 | 0 |
| -vehblC&cytK | 1.6×102 | 6.9×102 | 431.2 | 5.1×103 | 3187.5 | 2.3×103 | 1437.5 |
| + vehblC | 5.0×10 | 2.1×102 | 420年 | 1.4×103 | 2800年 | 6.9×103 | 13800年 |
| + vecytK | 1.1×102 | 4.7×102 | 427.3 | 3.2×103 | 2909年 | 1.5×104 | 13636年 |
| + vehblC&cytK | 8.0×10 | 3.3×102 | 412.5 | 2.1×103 | 2625年 | 1.0×104 | 12500年 |
表9所示。影响存储在室温(25°正在°C)在b .仙人掌的生长有一定的毒性基因重组牛奶。
b的仙人掌被归为一类C或低风险,其患病率在婴儿配方奶粉是足够高导致食源性感染暴发(18]。肠毒素(腹泻综合症)的昙花,中毒是由于摄入大量的细胞和后续生产的毒素在小肠。然而催吐剂综合症b的仙人掌发生食物中毒后摄入的食物中生物生长,形成其毒素(19]。
结果提出了表2显示,19%的婴儿奶粉样本检查阳性b的仙人掌与计数范围从1×10 9×102和平均值为1.2×102±5.2×10 cfu /毫升复原乳。这些结果同意近Azza等获得的结果。20.),黄等。21]虽然高Sameer等报告的结果。22和安琪拉et al。23]。
结果表3宣布b .仙人掌孢子被发现在11%的婴儿奶粉样品检查计数范围从2.3×10 - 1.1×103和平均值为4.0×102±1.4×102孢子/毫升。这些结果同意结果由阿曼et al。24),雷耶斯et al。25和胡安et al。26]。
根据FDA(1996)规定的标准b的仙人掌必须小于或等于100 / g,所以很明显,21%和64%的婴儿奶粉样品未能遵守标准限制分别关于项营养和孢子成型机。
奶粉产品污染的频繁b的仙人掌孢子(26]。b .仙人掌可能不同的感染剂量约1×1051×108可行的细胞或孢子/ g。普遍存在的昙花,大于106生物/ g的食物是指示性生物的生长和扩散,认为潜在的危害健康27]。
费尔南德斯et al。28)发现的约40%b的仙人掌菌株港hblc基因负责HBL编纂而隆德et al。29日)记录的爆发菌株表达cytk毒素产生严重症状腹泻带血。
设计的引物Ngamwongsatit et al。13)使用特定的多重PCR条件下检测肠毒素基因(hblc和cytk)在选定的菌株。DNA带用溴化乙锭在琼脂糖凝胶hblc预期的分子大小和cytk基因检测分别为695个基点和565个基点。
19 b .仙人掌营养株分离从婴儿奶粉样品进行分析的hblc cytk基因表4使用中列出的PCR引物图1hblc基因被发现在只在8隔离(42.1%)、cytk基因只在3隔离(15.8%)、hblc和cytk基因在7隔离(36.8%)和hblc cytk基因并没有检测到在一个(5.2%)隔离。
此外,11形成孢子b .仙人掌孢子菌株分离分析hblc和cytk基因的存在使用PCR引物中列出图2hblc基因被发现在4隔离(36.4%)、cytk基因检测2隔离(18.2%),hblc& cytk基因检测2隔离(18.2%)和两种hblc和cytk基因没有被发现在3隔离(27.3%)(表5)。安吉拉et al。23];Ji-Yeon和Jong-Hyun30.];Arsalan et al。31日];侯赛因(32)和分et al。33)可以检测hblc和cytk基因,以不同的比例范围从20到77%的分离株的筛选。
结果总结在表6显示3%的检查婴儿奶粉样本含有克——消极阪崎肠杆菌。我们的研究结果是一致的Heuvelink et al。34)而获得的更高的结果Aigbekaen et al。35]。另一方面El-Sharoud et al。36]未能发现阪崎肠杆菌在任何检查样品。根据CAC (17)缺乏的标准设置一个限制阪崎肠杆菌在10 g的婴儿奶粉,所以很明显,3%的婴儿奶粉样品未能遵守标准的限制(表7)。婴儿配方奶粉和奶粉最常见的车辆与新生儿阪崎肠杆菌感染(37]。从历史上看,肠杆菌已经涉及新生儿和婴儿感染,引起脑膜炎、坏死性小肠结肠炎(NEC)和菌血症或败血症(38]。
沙门氏菌生物未能被发现在所有的检查婴儿奶粉样品(表8)。这些发现几乎类似于Matug等结果。39,同意欧洲和埃及,美国食品药品管理局(16)标准规定的极限零沙门氏菌(25 g的奶粉产品40]。另一方面手Zagare et al。41)可以在婴儿奶粉检测salmonellae。
结果表9显示,b .仙人掌的生存特点携带hblc基因,cytk基因和两个hblc & cytk基因重组奶粉储存在25°C 6 h。所有批次都检查每个2 h。稳步增加cfu /毫升还原奶显然是观察到但没有显著区别不同接种b .仙人掌携带基因的生长特点,感染剂量在不到6个小时。的结果稍微同意澳大利亚新西兰食品标准(4)表示,公式与初始水平准备100 cfu b .仙人掌/ g可能达到感染剂量当储存在室温下大于4 h。因此,FDA,粮农组织/世卫组织和美国疾病控制与预防中心大力倡导母亲-饲料/瓶喂,以避免可能的威胁生命的疾病,新生儿和婴儿造成微生物污染,减少婴儿奶粉的制备和消费之间的延迟。
本研究表明的产毒素的b .仙人掌菌株和高发病率阪崎肠杆菌婴儿奶粉销售Kafrelsheikh省和可能的高危食品感染尤其是婴儿承担。因此,应特别注意其中的重要性b的仙人掌和阪崎肠杆菌疾病控制和预防计划在埃及可能构成公共卫生风险。多重PCR被认为是一种快速识别的方法b的仙人掌在牛奶产品。
