埃及Kafrelsheikh省市场销售的婴儿奶粉的安全

摘要

从Kafrelsheikh省不同的药店共收集了100个婴儿奶粉样品进行细菌学检查。结果表明，蜡样芽孢杆菌检出率分别为19%和11%，平均为1.2 × 102±5.2 × 102和4.0 × 102±1.4 × 102 cfu/g。随后，对30株分离菌株进行PCR鉴定，鉴定出2个毒力基因。选择的PCR靶点为hblc基因，采用FHBLC (F)和FHBLC (R)引物;cytK基因，采用FCytK (F)和FR2ytK (R)引物。植物性蜡样芽孢杆菌8株(42%)携带hblC基因，3株携带cytK基因，7株同时携带两种基因。11株蜡样芽孢杆菌中4株含有hblC基因，2株含有cytK基因，2株同时含有cytK和hblC基因。此外，在3%的被检样本中可以分离出坂崎肠杆菌，而在任何被检样本中都没有检测到沙门氏菌。将4株携带hblC基因、携带cytK基因、携带两种基因和不携带任何一种基因的乳酸菌按5 × 10 ~ 1.6 × 102 cfu/ml的浓度接种到重组奶粉中。接种后的牛奶样品在25ºC下孵育，每2小时检测蜡样芽孢杆菌计数，直至储存6小时。各基因接种后蜡样芽孢杆菌数量显著增加，但差异不显著。 The results concluded that infant milk powder in spite of its low moisture content may at times suitable for supporting the growth of these organisms and subsequently be responsible for food poisoning to infants. The public health importance of the isolated microorganisms was discussed.

关键字

婴幼儿奶粉，b的仙人掌肠毒素,阪崎肠杆菌,Salmonellae。

简介

婴儿配方奶粉(PIF)多年来一直被用于喂养数百万婴儿，在全球婴儿配方奶粉中占大多数。本产品的配方是模仿人类母乳的营养成分。由于PIF不是无菌产品，它是支持细菌生长的极好培养基，可能被致病性微生物污染，可导致婴儿严重疾病[1］．

目前的技术还不可能生产出没有低水平微生物的PIF。后加工污染是影响奶粉污染的一个主要因素，因为原料经常处于致命的温度下，这会消灭病原体的营养细胞。奶粉事件的爆发表明，预防系统的失败是污染的根源，例如存在使微生物繁殖的水，或存在难以维护和清洁的区域[2］．

b的仙人掌是粮农组织/世卫组织专家磋商会报告的与PIF污染有关的主要微生物之一[3.的数量很少b的仙人掌存在于婴儿配方奶粉中的，是由于生奶受到环境污染[4］．

b的仙人掌已报道产生5种肠毒素和1种催吐毒素，其中溶血毒素BL (HBL)和非溶血肠毒素(Nhe)由3种不同的外源蛋白组成，而其他毒素Ent FM、cyt K和Bce T由单一蛋白组成[5］．

2004年，联合国粮食及农业组织和世界卫生组织召开了一次专家会议，得出结论认为，PIF中最受关注的微生物是沙门氏菌和阪崎肠杆菌［6］．

奶粉是配方奶粉的重要来源阪崎肠杆菌感染。这种细菌耐干燥和酸性pH值，热，生物膜的形成和持久性在食品制备表面和新生感染阪崎肠杆菌与婴儿配方奶粉和奶粉有关[7］．婴儿配方奶粉受到轻度沙门氏菌污染，可导致婴儿感染[8］．

据我们所知，有一些关于生态和毒性的数据在各种b的仙人掌在埃及卡夫勒谢赫省的婴儿奶粉中检出了三聚氰胺。因此，本研究的目的是确定的患病率b的仙人掌(植物和孢子形成)，阪崎肠杆菌和沙门菌并进行肠毒素产生基因的检测b的仙人掌(hblc & cytk)在婴儿奶粉中的含量，并研究了贮存时间对乳酸菌生长的影响b的仙人掌在重构婴幼儿奶粉常温下储存，保证婴幼儿奶粉的安全食用。

材料与方法

本研究于2015年1月至7月期间在埃及Kafrelshiekh省当地不同药店随机收集了100份婴儿奶粉样本。样品被装在包装中转移到实验室进行细菌学检查。

连续稀释剂的制备[9］

每个婴儿奶粉包装在无菌打开前混合均匀。取11克混合均匀的奶粉，用干燥无菌的金属抹刀转入89毫升0.1%的无菌蛋白胨水(40ºC-45ºC)中，按1:10稀释，配制10倍连续稀释液。

细菌检验

蜡样芽孢杆菌营养形态的计数、分离和鉴定这是根据霍尔布鲁克和安德森[10]用多粘菌素-嘌呤酸-蛋黄-甘露醇-溴百里酚-蓝琼脂(PEMPA)和细菌分离株鉴定为B.cereus

原孢蜡样芽孢杆菌计数(MPN/g)、分离鉴定:这是根据波兰标准PN - EN ISO 21871 [11］．将生长阳性试管(浑浊)在PEMPA培养基(Oxoid)上传代培养，在30ºC下培养48 h。用MPN(最可能数)法测定1 g婴儿奶粉中蜡样芽孢杆菌组孢子总数。分离的生物的生化鉴定是根据Koneman等。[12］．

用PCR技术检测蜡样芽孢杆菌分离株的hblC和cytK基因:应用PCR鉴定蜡样芽孢杆菌溶血素BL (hblC)和细胞毒K (cytK)基因，主要是使用引物(Pharmacia Biotech)，如图所示表1．

表1。hblC和cytK基因的鉴定B.cereus使用引物进行。

分离鉴定大肠sakazaki我:根据食品及药物管理局[14］．

沙门氏菌的分离鉴定:根据食品及药物管理局[15］．

重组奶粉中蜡样芽孢杆菌的生长特征

菌种培养:蜡样芽孢杆菌菌株在10ml无菌Tryptic Soy Broth (TSB)中培养。将肉汤在37°C下孵育24小时，然后以3000 rpm离心。除去上清液，将剩余细胞重新悬浮于无菌污水中。连续稀释准备从每个储备管和100 ul从每个管散布在先前准备的PEMPA板。在35ºC孵育24 h，计算菌落形成单位/ml。

实验接种:将1000 ml重组奶粉加入5个无菌烧瓶(每个200ml)。用蜡样芽孢杆菌-ve hblC和cytK接种烧瓶，b的仙人掌+ ve hblC,b的仙人掌+ve cytK和b的仙人掌+ve hblC和cytK，每个菌株在每个烧瓶中。将烧瓶有效地塞住，在25°C下孵育，每2小时检查一次，直到储存6小时b的仙人掌计数。

结果

表2。婴幼儿奶粉样品中蜡样芽孢杆菌(营养形态)在penba琼脂培养基上的统计分析结果。

表3。婴幼儿奶粉样品中蜡样芽孢杆菌(促芽孢杆菌)MPN/g计数的统计分析结果

表4．婴儿奶粉样品中蜡样芽孢杆菌(营养形态)肠毒素基因(hblC和cytK)的检测

表5所示。婴儿奶粉样品蜡样芽孢杆菌分离株肠毒素基因(hblC和cytK)的检测。

表6所示。的发病率阪崎肠杆菌在VRBG培养基上检测婴儿奶粉样品。

表7．婴幼儿奶粉样品中分离病原体与FDA的比较[16]及CAC [17标准(n=100)。

表8所示。婴儿奶粉样品中沙门氏菌的发生率(n=100)。

表9所示。室温(25°C-30°C)贮藏对重组乳中含有某些毒力基因蜡样芽孢杆菌生长的影响

讨论

b的仙人掌属C类或低风险，但其在婴儿配方奶粉中的流行程度足以引起食源性感染爆发[18］．蜡样芽孢杆菌中毒的肠毒素(腹泻综合征)是由摄入大量细胞并随后在小肠中产生毒素引起的。然而，催吐综合症b的仙人掌食物中毒发生在进食了有机体生长并形成毒素的食物后[19］．

研究结果载于表2显示19%的婴儿奶粉样品呈阳性b的仙人掌计数范围从1 × 10到9 × 10²平均值为1.2 × 10²±5.2 × 10 cfu/ml重组乳。这些结果与Azza等人的结果几乎一致。[20.]，黄等。[21]而Sameer等人报告了更高的结果。[22]和安吉拉等人。[23］．

结果表3在11%的婴儿奶粉样品中检出蜡样芽孢杆菌孢子，数量在2.3 × 10 ~ 1.1 × 10之间^3.平均值为4.0 × 10²±1.4 × 10²孢子/毫升。这些结果与Aman等人的结果一致。[24]，雷耶斯等人。[25]和胡安等人。[26］．

根据FDA(1996)标准规定b的仙人掌必须小于或等于100/g，所以很明显，21%和64%的婴儿奶粉样品在营养物质和孢子形成物的数量上不符合标准限制。

众所周知，奶粉经常被污染b的仙人掌孢子(26］．蜡样芽孢杆菌的感染剂量约为1 × 10⁵到1 × 10⁸活细胞或孢子/g。一般存在蜡样芽孢杆菌大于10⁶食物中的有机体/g表示该有机体的生长和增殖，被认为是对健康的潜在危害[27］．

费尔南德斯等人[28]发现大约40%的人b的仙人掌菌株含有负责HBL编码的hblc基因，而Lund等人[29]记录了一种表达cytk毒素的菌株的爆发，产生了严重的症状，包括血性腹泻。

Ngamwongsatit等人设计的引物[13]在特定的多重PCR条件下，对所选菌株进行肠毒素基因(hblc和cytk)检测。在琼脂糖凝胶中，溴化乙酯在695 bp和565 bp分别检测到hblc和cytk基因预期分子大小的DNA条带。

从婴儿奶粉样品中分离出19株蜡样芽孢杆菌营养株，分析其是否存在hblc和cytk基因表4中所列的PCR引物图1其中，HBLC基因仅在8个分离株(42.1%)中检出，cytk基因仅在3个分离株(15.8%)中检出，HBLC和cytk基因在7个分离株(36.8%)中检出，1个分离株(5.2%)未检出HBLC和cytk基因。

此外，利用所列PCR引物对分离的11株蜡样芽孢杆菌孢子株进行了hblc和cytk基因的检测图24株(36.4%)检测到HBLC基因，2株(18.2%)检测到cytk基因，hblc2株(18.2%)均检出& cytk基因HBLC和cytk3株(27.3%)未检测到基因(表5)．安吉拉等人。23];智妍及钟贤[30.];阿尔萨兰等人。[31];侯赛因(32]和乔恩等人。[33]能够同时检测到HBLC和cytk基因，在筛选的分离株中检测比例从20%到77%不等。

表6总结的结果显示，3%的婴儿奶粉样品被革兰氏阴性菌污染阪崎肠杆菌．我们的发现与Heuvelink等人一致。[34]而Aigbekaen等人则获得了更高的发现。[35］．另一方面，El-Sharoud等人。36侦测不到阪崎肠杆菌在任何被检测的样本中。根据CAC [17的标准，该标准规定了不存在的限度阪崎肠杆菌在10克婴儿奶粉中，很明显有3%的婴儿奶粉样品不符合标准限量(表7)．婴儿配方奶粉和奶粉是最常见的涉及新生儿的载体阪崎肠杆菌感染(37］．历史上，肠杆菌曾与新生儿和婴儿感染有关，引起脑膜炎、坏死性小肠结肠炎(NEC)和菌血症或败血症[38］．

所有经检验的婴儿奶粉样本均未检出沙门氏菌(表8)．这些发现与Matug等人的结果几乎相似。[39]，并同意欧洲和埃及，FDA [16]规定25克干奶类产品中沙门氏菌含量为零的标准[40］．另一方面，Zagare等人。41]可在婴儿奶粉中检测出沙门氏菌。

结果表9结果表明，携带hblc基因、cytk基因以及hblc和cytk基因的蜡样芽孢杆菌在25℃保存6 h的重组奶粉中的存活特征。每2 h检测各批次，重组奶的cfu/ml明显稳定增加，但不同携带基因的蜡样芽孢杆菌的生长特征无显著差异，接种不到6 h就达到感染剂量。结果与澳大利亚新西兰食品标准略有一致[4who指出，初始含量为100 cfu /g蜡样芽孢杆菌的配方奶粉在室温下储存4小时以上可达到感染性剂量。因此，FDA、FAO/ who和CDC大力提倡母亲喂养而不是瓶喂养，以避免微生物污染对新生儿和婴儿可能造成的危及生命的疾病，减少婴儿奶粉制备和食用之间的延迟。

结论

本研究表明蜡样芽孢杆菌的产毒率较高阪崎肠杆菌在卡夫勒谢赫省销售的婴儿奶粉中含有这种成分，而且可能存在很高的食源性感染风险，特别是对婴儿而言。因此，应特别注意包容的重要性b的仙人掌而且阪崎肠杆菌在埃及的疾病控制和预防项目中可能构成公共健康危害。多重PCR被认为是一种快速鉴定的替代方法b的仙人掌在奶制品中。

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