筛选的微生物发酵生产的隔离L-Asparaginase深层发酵

文摘

L-asparaginase是一个公认的氨基酸降解酶具有抗肿瘤的活性。它是可取的选择主要试图发现新L-asparaginase生产商血清学与之前报道的不同,但表现出相似的治疗效果。20六微生物培养物包括三个微生物生产L-asparaginase财团进行了测试的能力。纯本地文化孤立的微生物,一些商业上使用的微生物和三个微生物协会(蚯蚓和白蚁肠道财团)进行定性、定量的能力产生L-asparaginase。七26文化包括海水隔离测试,给了一致的积极的结果在定性分析,因此他们采取了进一步的定量研究。海水分离的细胞自由发酵肉汤给0.710 u /毫升/小时L-asparaginase活动淀粉酪蛋白肉汤。当地隔离的酿酒酵母酵母发育肉汤(-74位),同样被发现0.884 u /毫升/小时。在M9培养基,当酵母分离是生长在天冬酰胺的存在,酶活性增加了20%的一个因素。海水隔离了一致的酶活性在淀粉酪蛋白肉汤直到160小时和天冬酰胺的酶效价高积累速度M9肉汤。显然表示通过本研究发现,许多常规微生物培养物有能力生产L-asparaginase。 A couple of isolates possess the ability to produce a significant amount of L-asparaginase enzyme. Presence of asparagine in M9 medium induced the enzyme yield.

关键字

L天冬酰胺酶,微生物分离筛选,海水隔离,酿酒酵母

介绍

酶L-asparaginase (L-asparagine酰胺水解酶,e·c·3.5.1.1)吸引了太多的关注作为一个氨基酸降解酶表现出抗肿瘤的活动(1,2,3]。肿瘤细胞在L-asparagine报道,从血液循环或体液,因为它不能合成L天冬。L-asparaginase酶的存在作为化疗药物可能降低L-asparagine存在于血液循环和间接饿死肿瘤细胞,导致细胞死亡。微生物酶是优于植物或动物源因其经济生产、一致性、易于修改过程,优化和净化。它们比相应的酶相对更稳定的来自植物或动物(4]。各种微生物如细菌、酵母和丝状真菌被认为是理想的来源L-asparaginase [5]。

L-asparaginase被用作化学治疗剂在过去的30年里,主要来自大肠杆菌的菌株和欧文氏菌chrysanthemi [6,7,8]。细菌L-asparaginases有时引起过敏反应和过敏反应9需要寻找其他的天冬酰胺酶来源和酶用更少的副作用。商业生产的酶,选择优良菌株和收获协议确保足够数量的酶总是至关重要的步骤。

管理这样一个酶蛋白质很长一段时间,一般来说,产生相应的抗体在组织,导致过敏性休克或中和药物的效果。因此,使用新的血清学不同的L -天冬酰胺酶具有相似的治疗效果是非常可取的(10]。因此,尝试导致血清检查发现新L-asparaginase生产商与之前报道的不同,但也有类似的治疗效果是非常可取的和被鼓励。

材料和方法

材料

所有使用的化学品均为分析纯和采购从Rankem Himedia,新德里,孟买和默克,孟买,印度。十八微生物培养物经常用于各种研究在我们的实验室被用于这个调查筛选L-asparaginase活动增长他们各自维护媒体(细菌培养的营养肉汤,汤(YDB)酵母酵母发展文化和Sabouraud葡萄糖肉汤(SDB)真菌的文化。除了这些,五种不同的微生物分离的局部孤立在我们实验室也被用于筛查L-asparaginase的文化活动。两个厌氧财团(收集和维护从蚯蚓肠道和白蚁肠道内)也一起使用与维护的另一个财团耗氧蚯蚓肠道产生L-asparaginase的筛选能力。

微生物

十八微生物培养物(2 11细菌、酵母和真菌文化5日)被用于当前调查旨在生产L-asparaginase文化的能力。除了这些标准的文化中,5名当地分离株(3酵母和细菌隔离2)和三个联盟(两个无氧和有氧财团之一)也被调查。纯粹的文化都是在各自维护维护媒体(如上所述细菌即营养肉汤,YDB为酵母真菌文化文化和深发展)琼脂斜面文化。三种酵母分离(两个(BIT-23和一些74)土壤样品中分离的一个来自甘蔗pressmud按标准隔离程序(连续稀释和电镀)保持在码琼脂偏。两个本地细菌隔离(海水隔离和油饼隔离)保持在淀粉分别酪蛋白琼脂偏和营养琼脂偏。三个联盟(两个从蚯蚓肠道内获得,一个从内部白蚁肠道微生物隔离程序)使用标准分别保持在螺帽瓶生长在糖蜜培养基(比重1.020与1% (v / v)玉米浆)。有氧财团在瓶(120 rpm)和厌氧财团保持静态文化。

定性筛选L-asparaginase生产板试验

天冬酰胺酶活动的隔离筛选使用的方法Gulati et al。11]。成年文化从偏(一个循环完整的文化的财团)镀是在标准petriplates无菌。中使用被修改M9培养基(pH值5.9)合并酸碱指示剂(酚红)。盘子被孵化48小时30ºC。L-asparaginase活动被粉色的区域在殖民地的形成。

筛选的微生物培养物(定量)L天冬酰胺酶的活动

26微生物培养物(包括财团)最初生长在摇动烧瓶(20毫升媒体举行的100毫升EM烧瓶)使用各自的文化媒体(细菌的营养肉汤,YDB酵母文化,深发展真菌分离株,为海水隔离和玉米淀粉酪蛋白肉汤培养基Rhodosporidium)。文化是维持在120 rpm和30ºC。发酵样本后72小时的生长和细胞通过离心(5000 rpm, 10分钟,10ºC)。免费细胞培养基配方进行测试的能力利用天冬酰胺酶测定天冬酰胺为底物。

测定L-asparaginase活动(定量分析)

使用的方法本质上是Mashburn和Wriston [12]。在这个试验,水解率L-asparagine决心通过测量氨的释放使用奈斯勒的反应。0.1毫升的酶提取的混合物,0.2毫升的0.05米Tris-HCl缓冲区(pH值8.6),和1.7毫升0.01 L-asparagine孵化了10分钟37ºC。的反应是停止添加0.5毫升的1.5 m三氯乙酸。在10000转离心后,0.5毫升的上层清液稀释至7毫升蒸馏水和处理1毫升的奈斯勒试剂。颜色反应10分钟才得以发展和吸光度是读480海里(对试剂空白)使用分光光度计(日本岛津公司、日本)。氨解放从标准曲线外推得到不同浓度的硫酸铵。一个单位(IU) L-asparaginase被定义为酶的释放量1μ摩尔的氨在试验条件下每小时。

检测峰值L-asparaginase活动在板化验的文化给了一致的积极成果

七文化固氮菌sp Azospirillum sp,海水隔离,酿酒酵母- 74,美国非洲酒,pressmud隔离(酵母),Pacelomyces sp.给了一致的板测定颜色变化生长在50毫升的各自的媒体(细菌培养营养肉汤,YDB酵母和真菌文化深发展)分别在250毫升玻璃瓶。两个循环的各自文化琼脂偏被用作起动剂。他们生长在30ºC 166小时的120 rpm。周期样本提取和处理定量L-asparaginase化验如上所述。

比较评估L-asparaginase生产使用选定的微生物培养物

列出的四个短文化基于L-asparaginase生产各自的表现媒体在一段时间内,这些酶浓度增长直到72 h的培养他们第一次在同一介质。M9培养基(50毫升每250毫升EM烧瓶)。水瓶都维持在120 rpm 30ºC 72小时。样品每隔24小时收集和加工L-asparaginase活动如前所述。

结果

定性筛选L-asparaginase生产板试验

氨的释放的天冬酰胺M9琼脂板导致当地pH值增加,因此红色外观(由于存在酚红指示剂)板块窝藏积极的文化(图1)。

筛选(定量)的微生物样品L天冬酰胺酶的活动

在我们调查的16 26文化测试给了相当大的酶活性(超过0.300 U /毫升/小时。)在定量分析。海水隔离和地方酵母分离BIT74给酶活性最高的0.710 U /毫升/小时和0.884 U /毫升/小时(分别表1)。没有5真菌文化测试,产生明显的L-Asparaginase活动。的三个联盟测试,只有白蚁肠道财团显示酶活性的0.466 U /毫升/小时。

检测峰值L-asparaginase活动在板化验的文化给了一致的积极成果

为了找出L-Asparaginase活动高峰,7个选择文化从上述26文化出了166小时。海水分离显示一致的淀粉酪蛋白酶浓度的增加到160个小时汤(图2)。当地酵母分离BIT74, s .非洲酒pressmud酵母隔离& Paceliomyces sp.显示酶活性在72小时在各自的媒体。

比较评估L-asparaginase生产使用选定的微生物培养物

当的四个选择文化生长在同一介质,M-9汤含有天冬酰胺作为氮源,酶浓度的速度积累被发现高在所有的文化中表现出最大的海水分离株酶活性在48小时(1.401 U /毫升/ hr。) (表2)。

讨论

微生物是代谢物的视为未开发的来源和产品的新属性。他们有各种各样的催化各种生物化学反应的酶活性。有巨大的范围的调查旨在探索的可能性产生新产品潜在的生物的经济重要性。酶,L-asparaginase已经深入调查在过去的二十年里作为抗肿瘤的药物由于其重要性。细菌、放线菌和真菌也是L-asparaginase[生产的良好来源13,14]。

人们普遍观察到L-asparaginase生产是伴随着文化滤液的pH值的增加。板试验被设计使用这个原则通过合并酸碱指示剂酚红的培养基含有天冬酰胺(唯一氮源)。酚红在酸性pH值是黄色和碱性pH值变成粉色,因此微生物菌落周围形成粉红色区域生产L-asparaginase。板试验是有利的方法是快速和L-asparaginase生产可以直接可视化的盘子没有执行耗时分析(15,16,17]。

表示两边王妃et al。18]报道了在深层发酵生产L-asparaginase在3.8 U /毫升的最大达到96 h的潜伏期。进一步增加在潜伏期没有显示任何显著增加酶生产而降低。因此酶合成的最佳时间是96 h后接种。这是符合我们的发现在大多数通过浸没培养(见7微生物测试图02)。本文的作者,当与曲霉属真菌terreus最大酶活性得到石榴皮粉作为底物时在固体培养120 h的培养(19水解)和豆渣强化L-asparagine给63.89 U /毫升的活动在水下120 h培养(20.]。Sarquis et al。13)报道,在液体培养基中最高的a . terreus L-asparaginase活动被发现在48 h在固体培养基的最佳时期酶生产96 h。只有在海水隔离,我们发现增加酶活性的积累直到160小时的培养(图2)。

Siddalingeshwara和Lingappa21]表明,L-asparaginase生产最大6.05 IU 72人力资源发酵周期。虽然Khamna et al。22)报道,最大L-asparaginase生产7.0 pH值和温度30ºC发酵期的178小时。这是更一致,我们发现在淀粉酪蛋白肉汤的海水隔离在160小时给最大的酶活性。

底物结合M9培养基给L-asparaginase活动积累文化的速度测试在我们的研究中。酶生产报告为复杂的链式反应和支持的结果,由合适的基质。青霉菌sp.首选L-asparagines作为衬底。这一特点的特异现象sp.与Dunlope证实和1975房间吧23)指出,增加酶生产中由于添加L谷氨酰胺和谷氨酸发酵培养基。从这项研究中,清楚地表明,许多常规微生物培养物有能力生产L-asparaginase。两个隔离具有产生大量L-asparaginase酶的能力。然而,需要更详细的调查描述这种微生物酶,它可以有效地用于大规模生产在未来商业和医药用途。

的利益冲突

作者没有利益冲突声明。

确认

作者感谢Bannari安曼理工学院的管理,Sathyamangalam给机会执行这项研究中,通过提供研究工作实验室设施和不断的鼓励。这项工作被执行死刑作为一个创业计划BIT-TBI (DST的合资公司,新德里和,Sathyamangalam)。

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