液相色谱-质谱法同时测定橄榄牙鲆中敌百虫和敌敌畏残留:验证和药代动力学应用

摘要

敌百虫是一种有机磷杀虫剂，在水产养殖中用于控制寄生生物。本研究建立了一种快速、灵敏、特异性的液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)法测定橄榄牙鲆组织中敌百虫和敌敌畏残留量。采用Eclipse Plus C18色谱柱，水乙腈- 0.1%甲酸梯度洗脱，流速为0.3 mL / 1。以氮气为碰撞气体，采用正离子模式电喷雾电离检测。在多反应监测(MRM)模式下，在m/z 259→109(敌百虫)和m/z 221→108.9(敌敌畏)处检测到离子跃迁。所得线性校正曲线具有良好的相关系数。敌百虫和敌敌畏的检测限(LOD)分别为0.5和1.2 μg kg-1，定量限(LOQ)分别为1.7和4.0 μg kg-1。在3种加标浓度(5、10和100 μg L-1)下，平均加标回收率为88.2% ~ 114%，血浆、肌肉和肝脏的相对标准偏差(rsd)低于13.8%。将所建立的分析方法应用于敌百虫和敌敌畏以1或5 mg kg-1浓度浸渍后在橄榄牙鲆体内的药代动力学研究。

关键字

敌百虫，敌敌畏，LC-MS/MS，药代动力学，橄榄比目鱼。

缩写

MRM:多重反应监测;疼痛:乙酰胆碱酯酶;MRL:最大残留限量;DP:去簇势;信噪比(S/N);AUC:等离子体浓度-时间曲线下面积;λ2: λ z;(t1/2)消元半衰期;Cmax:最大血浆浓度;Tmax:到达Cmax的时间; MRT: Mean Residence Time; CL/F: Total Body Clearance (CL/F); Vz/F: Volume of Distribution.

简介

由于水产养殖中寄生虫感染的增加，鱼类疾病和生产力引起重大关注[1］．为了减少经济损失，养鱼户采用了其他措施来控制感染，例如使用化学试剂。

有机磷化合物在世界范围内被广泛用作农药或除草剂。敌百虫(二甲基(2,2,2-三氯-1-羟乙基)膦酸盐)(图1)是一种有机磷杀虫剂，用于消灭各种害虫，例如水产养殖中的鱼类寄生虫，以及控制水生物种的体外寄生虫和内寄生虫[2］．此外，敌百虫是若干国家最常用的化学药剂，用以控制海虱、吸虫、杀线虫剂、带绦虫和棘头虫[3.，4］．最常建议的治疗方法包括使用0.1至1mg L^－1使用敌百虫1天[5］．敌百虫也被称为敌百虫酸酯，用于治疗人类的阿尔茨海默氏症和血吸虫痢疾[6］．敌百虫在不稳定条件下使用时，如高温或pH<5.5 [7]，在阳光下[8]，或在充气水中[9]，可迅速分解为敌敌畏，敌敌畏对水生动物，包括鱼、蟹和虾，都是危险和有毒的[10］．此外，敌敌畏是一种广谱杀虫剂和杀螨剂，比母体化合物具有更高的毒性，而且更具有脂溶性。

敌百虫的主要作用是抑制骨骼肌突触和神经肌肉连接处的乙酰胆碱酯酶(AChE)活性，从而改变生物体的抗氧化防御系统[11］．此外，据报道敌百虫可有效治疗鲤鱼的各种鱼类疾病[12]、尼罗罗非鱼[10]、海鲈鱼[13]，鲑鱼[14]和欧洲鳗鱼[15]，养鱼户经常在水生环境中大量使用敌百虫进行处理。因此，敌百虫及其分解产物可能以高浓度存在，进而可引起人红细胞中毒和损伤[16］．鉴于上述可能对人类健康造成的危害，粮食及农业组织/世界卫生组织(粮农组织/卫生组织)确定了管制水平。2000年，粮农组织/世卫组织建议敌百虫在动物肌肉、肝脏、肾脏和脂肪中的最大残留限量(MRLs)为50 mg kg^－1［17］．然而，只有少数国家确定了鱼类中敌百虫的最高限量。因此，需要一种监测非法储存在鱼类组织中的敌百虫和敌敌畏的方法，以确定与人类食用有关的危害。

在过去几年中，已发展出几种方法来测定水果、虾、小麦、蔬菜、植物和水中的敌百虫和敌敌畏，例如气相色谱法[18-20.]、高效液相色谱法[21-23]、电化学发光[24]，以及化学发光[25]，以及安培型AchE生物传感器[26]和电化学生物传感器[27］．然而，由于敌百虫在加热喷射器中的热降解，气相色谱监测可能导致不正确的定量。此外，水、土壤和油样品的HPLC分析对有机磷农药残留的定量灵敏度不高。此外，由于敌百虫的不完全吸收性，使用高效液相色谱-紫外检测法测定敌百虫的灵敏度较低[28］．为了尽量减少这些问题，液相色谱-质谱(LC-MS)和LC-MS/MS在农药分析中已得到普及，特别是对极性化合物，包括生物液体，这在GC或GC-MS分析中是有问题的[29］．多项研究表明，LC-MS分析可为食品和人血清中农药残留的测定提供较高的灵敏度[29-31］．川崎等人。[32]采用LC-MS对血液中21种有机磷农药进行了筛选，Klein和Alder [33]使用基质匹配标准，通过LC-MS/MS筛选了一系列农药残留。特别是，[17]建立了一种同时测定动物组织中敌百虫和敌敌畏残留量的LC-MS/MS方法。然而，迄今为止，LC-MS/MS在水生生物中测定这两种农药的研究很少发表。因此，需要一种灵敏、快速、快速的方法来识别和定量水生生物中的农药残留。

橄榄比目鱼(Paralichthys olivaceus)是东亚(包括韩国、日本和中国)最常见的商业养殖鱼类之一[34］．虽然韩国的一些水产养殖场使用敌百虫来控制橄榄比目鱼或海鲷中的海虱，但只有少数官方研究监测其在海鱼中的剂量和使用情况。

本研究的目的是开发和验证一种新的、快速的、选择性的LC-MS/MS方法，用于同时检测橄榄比目鱼中的敌百虫和敌敌畏残留。采用特异性、选择性、线性、灵敏度、准确度、精密度、基质效应和稳定性等质量标准对方法进行验证。此外，我们还评估了将该方法应用于敌百虫浸渍给鱼后药代动力学研究的可行性。

材料与方法

试剂和化学品

敌百虫(C4H8Cl3O4P)和敌敌畏(C4H7Cl2O4P)标准采购自Sigma化学公司(圣路易斯，密苏里州)和Fluka(布赫斯，瑞士)。给药用敌百虫购自大成微生物实验室有限公司(韩国首尔)。hplc级甲醇、正己烷、乙腈和水从Merck公司(Darmstadt, Germany)获得。

标准溶液的制备

敌百虫和敌敌畏的单独标准原液的浓度为1 mg mL^－1在-20°C的密封小瓶中储存。多种标准工作溶液(2,5,10,50和100 μg L)^－1)，用0.1%甲酸的高效液相色谱-水稀释上述原液。这些溶液被用来刺穿空白样品，并制备基质匹配的校准溶液。

动物

平均重量为302±5克的橄榄比目鱼，之前未接触抗生素，来自韩国釜山当地的一家养鱼场。在实验中，分析中使用的鱼类被养在圆形水族箱(容量为2吨)中，并在22°C的条件下使用经过过滤的海水。

样品提取和清理

等离子体

首先，在200 μL血浆样品中加入0.5 mL乙腈，然后涡旋混合10 min。其次，样品在4°C下以9,000 rpm离心10 min。第三，用0.2 mm膜过滤上层透明层(Advantec, Tokyo, Japan)，然后转移到自动采样瓶中进行LC-MS/MS分析。

肌肉还是肝脏

取2克肌肉或肝脏样本，加入含有20毫升乙腈的试管中。将这些样品均质2分钟后，使用旋涡混合器将试管震动10分钟，然后在4°C下以13000转/分的速度离心10分钟。将上清液倒入200 mL梨形烧瓶中，并使用旋转蒸发器(Eyela, Tokyo, Japan)在40°C下蒸发至干燥。将得到的干渣用10 mL乙腈饱和正己烷重新配制两次，转移到试管中，摇10 min，使混合溶液分离，去除正己烷层。收集洗脱液，使用旋转蒸发器在40°C下重新蒸发至干燥。用1ml 50%甲醇重组残渣，在4°C下以12000 rpm离心10分钟。在制备24小时内，在LC-MS/MS分析之前，使用0.2 mm膜过滤上清液(Advantec, Tokyo, Japan)。

色谱和质谱仪的工作条件

样品的LC-MS/MS分析是在Agilent液相色谱系统(Agilent 1290 Infinity)和Agilent 6430三重四联LC/MS系统(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)上进行的。敌百虫和敌敌畏的分离采用Eclipse + C18色谱柱(2.1 × 100 mm, 1.8 μm, Agilent Technologies)。流动相A和B分别用0.1%甲酸进行hplc -水和乙腈脱气。A和B根据所示的梯度被使用表1，总运行时间为17 min。进样器温度为10℃，柱温为40℃，流速为0.3 mL min^－1注射量为10 μL。

表1:同时测定敌百虫和敌敌畏的洗脱梯度。

分析物通过配备电喷雾电离(ESI)源的质谱仪在正电离模式下进行鉴定和定量。采用多反应监测(MRM)模式对敌百虫和敌敌畏进行定量，前体产物离子跃迁和相应参数:敌百虫，m/z 259→109，聚簇电位(DP)为70 V，碰撞能(CE)为11 eV;敌敌畏，m/z 221→108.9,DP为80 V, CE为12 eV。第一个也是最丰富的MRM跃迁用于量化，而其他跃迁用于定性。表2总结敌百虫和敌敌畏的最佳耐药残留条件和保留时间。采用以下电离源参数:毛细管电压，4000 V;雾化器气体，N2;雾化器气体流量，11l min^－1；喷雾器压力，40.0 psi;气体温度350°C。数据采集和处理是使用Mass Hunter软件进行的。A.00.06.32;安捷伦科技)。

试验验证

选择性

为了评估内源性化合物的干扰，利用色谱-质谱/质谱条件筛选并比较了6种鱼类来源与空白血浆或肌肉样本的保留时间。在空白血浆或肌肉样本中加入敌百虫和敌敌畏的混合物。

校准

以0.1、1、2、5、10、20、50和100 μg L的浓度构建校准曲线^－1，通过连续稀释含有敌百虫和敌敌畏的混合物获得。使用矩阵匹配标准构建的校准曲线与从整齐样品中获得的校准曲线进行了比较。使用质量控制(QC)样品估计整齐的样品校准曲线。QC样品用0.2 mL空白血浆在3种浓度(10、50和100 μg L)下制备^－1敌百虫和敌敌畏。

灵敏度

检测限(LOD)和定量限(LOQ)被确定为加标空白血浆中标准分析物的最低浓度。敌百虫和敌敌畏的限效值和定量限分别定义为信噪比(S/N)为3.3和10时的响应。

准确性和精密度

通过测定标准溶液的日内和日间精密度来检验方法的精密度。在10、200和2000 μg L浓度下添加敌百虫和敌敌畏混合物的QC样品进行了5个重复的日间精密度测定^－1在同一天(可重复性)，而日间精密度是在连续五天内确定的(可重复性)。这两个参数用结果的相对标准偏差(RSD%)表示。数据可接受性的基准是精度在理论浓度的±15%以内，精密度在±15%以内。

萃取回收率和基质效应

敌百虫和敌敌畏的回收率是通过比较经分析程序后提取的QC样品的平均峰面积来获得的，名义浓度为10、50和100 μg L^－1敌百虫和敌敌畏。通过分析溶解在流动相中的两种化合物的标准物和加入血浆、肌肉和肝脏这三种基质提取物的标准物来评估基质效应。比较了各基质组中两种化合物的响应峰面积比。

稳定

为了确定原液的稳定性，新配制了三个重复敌百虫和敌敌畏原液。比较了在不同温度条件和时间下的反应与新鲜原液在等离子体中的反应。血浆样本进行了三次冻融循环，以及利用短期和长期条件进行的研究。通过重新分析提取的分析物来评估自动进样器的稳定性，以确定在4°C下24或48小时的分析延迟的影响。所有稳定性研究均在10、200和2000 μg L浓度水平下进行^－1使用三个重复的QC样本。如果存储样品和新鲜样品的反应差异小于15%，则分析物被认为是稳定的。

应用于药代动力学研究

为评价优化方法的适用性，采用浸渍法对敌百虫和敌敌畏在橄榄比目鱼体内的药代动力学进行了分析。在驯化期间，将鱼在22°C的海水中饲养3周，以确保所有个体健康和摄食。这些鱼每天用商业饲料(韩国大田市Woosungfeed)喂养两次，但在进行研究前将它们饿死1天。对照鱼在相同条件下分别放在干净的鱼缸中。每个处理组在100 L的水箱中饲养10条鱼，敌百虫浓度分别为1和5 mg kg^－122°C下1小时。给药后，将每条鱼从浸泡槽中取出，立即转移到清洁的海水中。每个试验箱采用10个重复进行评估，分别在6 h、12 h、24 h、2天、4天、7天、14天和21天从每条鱼身上采集血液。用药后1分钟内，使用肝素化3ml注射器从尾血管采血。血浆样品在4°C下以9,000 rpm离心10分钟立即分离，并在-70°C的冰箱中保存，直到分析。

根据制造商说明书，使用WinNonlin 5.1 (Pharsight Corporation, Mountain View, CA)计算药代动力学参数。使用线性梯形规则和辛普森规则计算给药后0 - 720 h的血药浓度-时间曲线(AUC)下面积(Pharmacologic Calculation System, Version 5.1, 2006)。所有实验数据均以均数±标准差表示。

结果与讨论

LC-MS/MS的优化

优化了LC-MS/MS分离并同时测定两种目标农药的方法。为了获得良好的峰形和短的运行时间，我们在初步实验中测试了不同的流动相，如乙腈和甲醇作为有机相。我们考虑了水的添加剂，如甲酸，这有利于电喷雾工艺;这种添加剂导致农药的高离子化和极性化合物的良好保留时间。利用流速和梯度洗脱来获得每个化合物的对称峰和足够的数据点。含0.1%甲酸的水-乙腈流动相在流速为0.3 mL min时具有高效分离的对称峰^－1，总运行时间为17分钟。使用C18色谱柱进行分离，因为据报道这种色谱柱可以增加敌百虫的保留时间[28-30.］．

通过MRM验证性分析，阐明了靶标的分子结构，并进行了定量分析。图2所示为在正离子模式下获得的目标分析物的MS/MS产品扫描光谱。为了监测产物离子和两个或三个前体离子的最大响应，我们在全扫描模式下选择了母体离子，并利用聚簇势和碰撞能来寻找碎片离子。表2总结了敌百虫和敌敌畏的最佳质谱分析条件。敌百虫和敌敌畏的电喷雾电离[M+H]⁺在正电离模式下，分别为259和221的离子，用于定量和确认。敌百虫和敌敌畏的质子化形式被监测为前体离子，从m/z 109和m/z 108.9的光谱中分别识别出的片段离子作为显著的产物离子产生(图2)．为了观察最大响应，对每种分析物的破碎条件和碰撞能量进行了优化。因此，在MRM模式下进行定量分析，可获得较高的灵敏度和选择性:敌百虫为m/z 259→221和79，敌敌畏为m/z 221→79.1。

提取

表2:敌百虫和敌敌畏分析的最佳MS/MS操作条件。

由于生物组织中有机物含量高，农药的选择性提取较为复杂。由于目标化合物的极性和热不稳定性，选择乙腈作为溶剂，由于其极性，萃取效果较好。由于鱼的肌肉和肝脏中含有脂肪基质，有必要用清洁萃取法去除脂肪。最常用的溶剂是正己烷，正己烷能溶解脂肪，该溶剂对样品均质后的农药有较好的回收率。敌百虫在高温下很容易转化为敌敌畏，因此实验在4°C进行。

试验验证

特异性和选择性

进行了特异性研究，以确认在所研究的分析物保留时间内不存在内源性物质。图3显示了添加敌百虫的空白鱼血浆或肌肉样本的典型色谱图，以及浸渍后用于药代动力学研究的橄榄比目鱼样本。敌百虫和敌敌畏的滞留时间分别约为4.6分钟和6.1分钟。此外，空白血浆和肌肉样品的保留时间与浸入剂量为1 mg kg的样品相同^－1．敌百虫和敌敌畏滞留时间空白血浆和肌肉的色谱图中未见内源或外源化合物的干扰峰。

校正及线性度

通过分析色谱图中被分析物的峰面积得到校准曲线。连续稀释敌百虫和敌敌畏的混合物，得到0.1 ~ 100 μg L的样品^－1，采用优化后的方法进行了分析。敌百虫的校正曲线方程为y= 295.5x + 144.2 (y:峰面积，x:敌百虫浓度，n=5)，确定系数r2=0.999;敌百虫的校正曲线方程为y=690.8x + 111.4 (y:峰面积，x:敌百虫浓度，n=5)，确定系数r2=0.999。结果表明敌百虫和敌敌畏呈良好的线性关系。

灵敏度

敌百虫和敌敌畏的限用值和限用值分别采用最小可接受S/N值3.3和10 (表3)．敌百虫和敌敌畏的LOD值分别为0.5和1.2 μg kg^－1,分别。敌百虫和敌敌畏的LOQ值分别为1.7和4.0 μg kg^－1,分别。我们的实验得到的LOD值低于Hem等人的研究得到的LOD值。[29]和朱等。[30.]而LOQ值高于Wang等人在先前研究中得到的结果。[17］．虽然使用极灵敏的质谱仪可以获得更高的灵敏度，但这些限制足以分析橄榄牙鲆中的目标化合物。

表3:在敌百虫和敌敌畏中分析加标血浆样品的验证结果

准确性和精密度

三种不同浓度(10,200和2000 μg L)的QC样品^－1)进行5个重复评估，以确定日内和日间的精密度和准确度。表4总结了橄榄牙鲆血浆样品的日内和日间精密度和准确度。敌百虫的日内精度为98.8% ~ 101.4%，日内精度≤2.1%。敌百虫日间精密度为99.1% ~ 112%，精密度≤3.2%。敌敌畏日间精密度为97.7% ~ 114%，日间精密度≤2.6%。敌敌畏日间精密度为96% ~ 101.9%，精密度≤3.1%。准确度和精密度值均在较好的范围内(80%-120%)，令人满意。

表4:敌百虫和敌敌畏在橄榄牙鲆血浆中的准确性和精密度。

萃取回收率和基质效应

在MS/MS检测不到的样品中，内源干扰引起的基质效应会降低或增加被分析物的离子强度。为了定量评估基质对分析的影响，将纯溶液所获得的面积与提取后添加农药的空白基质样品所获得的面积进行比较。通过评估这些响应比，可以定量评估信号的抑制或增强[35］．通过将绘制区域与三种基质(血浆、肌肉和肝脏)提取物的浓度进行比较，在5个重复中使用三种不同浓度的分析物(表5)．

表5:敌百虫和敌敌畏在加标样品中的回收率和基质效应(n=5)。

如果观察到响应和精度的变化(即绘制的峰值面积<85%或>120%)，则认为存在矩阵效应。敌百虫在血浆中的回收率为98.8% ~ 105.0%，在肌肉中的回收率为88.4% ~ 98.8%，在肝脏中的回收率为98.1% ~ 108.3%。敌敌畏在血浆中的加样率为108.2% ~ 115.2%，肌肉中的加样率为95.8% ~ 102.1%，肝脏中的加样率为88.2% ~ 93.7%。在每种情况下，RSD范围均<14%，表明不存在基质效应。因此，该方法适用于不同样品的残留检测，使用该方法可以节省时间和成本。

稳定

表6显示了在3种浓度水平(10、200和2000 μg L)的不同储存条件下，敌百虫和敌敌畏在橄榄牙鲆血浆样品中的稳定性^－1)分3个重复。三次冻融循环后血浆样品稳定，敌百虫浓度为99.2% ~ 103.6%，敌敌畏浓度为98.6% ~ 104.2%。对自动进样器在不同时间内的稳定性进行了考察，24 h时敌百虫和敌敌威的浓度分别为83% ~ 99.4%和90.4% ~ 104.7%。48 h时敌百虫和敌敌畏的浓度分别为92.7% ~ 109.5%和103.1% ~ 113.47%。敌百虫和敌敌畏的短期稳定性分别为86.4% ~ 107.6%和87.1% ~ 110.9%;敌百虫和敌敌畏的长期稳定性分别为100.5% ~ 114.7%和98.4% ~ 97.0%。这些结果表明，血浆样品没有发生敌百虫和敌敌畏的任何显著损失，表明这些化合物在典型的处理、加工和储存条件下是稳定的。

表6:敌百虫和敌敌畏在不同贮存条件下的稳定性(n=3)。

应用于药代动力学研究

将所建立的方法应用于实际样品中敌百虫残留的检测和测定。图4显示施用1或5 mg kg剂量农药后敌百虫和敌敌畏的血药浓度-时间曲线^－1．表7总结了药代动力学参数，如λ z (λ₂)，由终端数据点的线性回归估计，消去半衰期(t_1／2)，由t计算_1／2= 0.693 /λ₂，最大血浆浓度(C_马克斯)，时间到达C_马克斯(T_马克斯)，平均停留时间(MRT)，从0到无穷远的等离子体浓度-时间曲线下面积(AUC_{0 -∞})、机体总间隙估计(CL/F)、分布体积(V_z/ F)。

表7:用1和5 mg kg剂量浸渍法测定敌百虫对橄榄牙鲆的药代动力学参数^－1(平均值±SD;n = 10)。

优化后的检测结果证实处理后的橄榄牙鲆中存在敌百虫和敌敌畏残留。给药后1毫克千克^－1敌百虫、C_马克斯敌百虫含量为3.1±0.5 ng mL^－1和T_马克斯(6.0±0.0)h_1／2和AUC_{0 -∞}值为19.6±4.1 h, 93.3±15.7 ng mL^－1分别h。然而，施用1 mg kg后，未检测到敌敌畏残留^－1敌百虫。随后给药5毫克千克^－1C .敌百虫_马克斯敌百虫含量为31.8±3.7 ng mL^－1和T_马克斯(6.0±0.0)h_1／2和AUC_{0 -∞}值为14.4±2.8 h, 616.2±25.2 ng mL^－1h^－1,分别。C_马克斯敌敌畏含量为4.36±0.8 ng mL^－1和T_马克斯(6.0±0.0)h_1／2和AUC_{0 -∞}分别为6.7±1.3 h和42.37±8.5 ng mL^－1h^－1,分别。

这些结果表明，在施用低浓度或高浓度敌百虫时，均可在血浆样品中检出敌百虫和敌敌畏残留，敌百虫主要用作有机磷杀虫剂。目前，关于敌百虫残留在橄榄比目鱼体内的药动学性质的研究数据很少。然而，ekinja [36]报道，给药300 mg kg后60 min，大鼠血液样品中未检测到敌百虫和敌敌畏残留^－1敌百虫和2.5毫克公斤^－1敌敌畏静脉注射。小山(37]报道了敌百虫在犬注射200 mg kg后6小时血液中的浓度比敌敌畏高10倍^－1敌百虫。虽然1和5毫克公斤^－1本研究中敌百虫在活比目鱼中的用量小于以往的研究，结果证实了药代动力学参数方面的相似观察结果。这些结果表明，经验证的方法适用于评估敌百虫和敌敌畏在海鱼体内施用的药代动力学研究[36，37］．

结论

建立了一种同时测定橄榄牙鲆中敌百虫和敌敌畏含量的高效液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)方法。分析方法采用特异性、选择性、线性、灵敏度、准确度、精密度、基质效应和稳定性等标准进行验证。该方法运行时间短，样品制备过程简单。

使用这种方法，在给药1或5 mg kg后进行药代动力学研究^－1敌百虫对橄榄比目鱼的浸渍剂量。虽然最初在血浆中检测到敌百虫和敌敌畏，但这些化合物的作用时间很短(<96 h)。而且，LOQ足以在终止时间内检测到残留。

有必要获得有关有机磷化合物对不同鱼类的应用的数据。从监测中获得的数据可用于确定鱼类中残留物的最大残留限量。我们的研究结果证实了持续监测海鱼中敌百虫残留的必要性，这些结果有助于制定在水产养殖中使用该农药的指南。

确认

本研究得到了2015年食品药品安全(韩国)的14162MFDS856和14161MFDS853补助金的支持。

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