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国际创新研究期刊》的研究在科学、工程和技术

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研究睾丸精子的特征和产生畸形的方面血管闭塞后的丙烯苯乙烯马来酸酐- RISUG及其逆转老鼠

R K辛格1F W Bansode2和a . k .之一Meena1
  1. 分工毒理学,中央药物研究所,印度勒克瑙
  2. 内分泌学分工,中央药物研究所,印度勒克瑙
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文摘

无激素避孕,名叫RISUG(缩写可逆抑制精子的指导下)将提供一个有价值的当前选项之外的男性避孕。目前的研究来确定生殖功能成功,安全的血管阻塞RISUG及其逆转由二甲亚砜(DMSO),其次是多基因(F1-F3)在大鼠致畸性研究。RISUG——苯乙烯马来酸酐的共聚物(SMA)溶解在0.01毫升DMSO溶液被注入腔输精管双边的剂量水平的0.25,0.50和1.00毫克/血管/老鼠。控制老鼠注射0.01毫升DMSO溶液。结果表明,由RISUG-injection vas-occlusion导致射精精子和精子异常抑制在雌鼠怀孕。但是,这并不影响睾丸精子发生,每日精子产量(DSP)和附睾的精子数量(ESC) post-injection段后70天。血管闭塞的逆转60天恢复精子形态学和生育能力不会造成任何重大身体和生殖器官重量的变化,DSP, ESC和胚胎学/畸形学方面分析该病例F1-F3后代。结果表明,intra-vasal注入RISUG抑制怀孕的雌性老鼠可能是由于影响精子的特征而不是睾丸功能。

关键字
RISUG避孕,血管闭塞,DMSO溶液。

介绍
无激素避孕,名叫RISUG(缩写可逆抑制精子的指导下)将提供一个有价值的当前有限的选项之外的男性contraceptio1 (Ananthaswamy, 2002)。RISUG(马克sans制药,孟买,印度)由丙烯苯乙烯马来酸酐(SMA)溶解在99.9%的纯二甲亚砜(DMSO) (Guha (1996)。一个注入(治疗剂量的60毫克SMA在DMSO溶液120毫升)双边男性的输精管微创的方式已被证明导致精子的解体,导致necrozoospermia(乔杜里et al ., 2004)。SMA就是这样的一个代理,当放置在输精管内腔的pH值降低腔的微环境,抑制精子在射精前的3 h post-injection acrosomal反应人类(古哈,2007;Sharma et al ., 2008)。血管闭塞的逆转研究报道已被证明导致normospermia正常精子能动性和可行性后30天逆转叶猴猴子(Lohiya et al ., 1998)。
RISUG明确二期临床试验表明,生活没有精子不是被解释为一个总输精管阻塞的获得与输精管切除术(古et al ., 1997)。Mishra et al .,(2003)也研究精子发生和精子的状态参数与RISUG叶猴猴子后长期血管阻塞。射精的精子被发现necroasthenoterato-zoospermic,暗示即时不育。残留的细胞被认为可能是由于膜系统的中断(Guha (1996)。这种技术的另一个优点是,它会引起局部的输精管堵塞伴随流的功能活性细胞(Sharma et al ., 2001;乔杜里et al ., 2002)。RISUG保留折叠的内壁输精管的很长一段时间,尽管没有被组织附着。第一阶段(古et al ., 1993)和二期临床试验(古et al ., 1997)已经成功完成,目前三期多中心试验正在进行中(Guha (2007)。短期研究精液和附属腺体功能之间的III期临床试验受试者证实精子缺乏1 - 4个月post-injection时期和没有怀孕6个月的研究期间(Chaki et al ., 2003)。男性介导无毒畸形形成的潜在的兔子中演示了Sethi et al ., (1990)。 Teratogenic safety on reversal (Sethi et al., 1990b) and reversibility has also been confirmed in rats previously (Koul et al., 1998; Guha, 1999).
然而,信息缺乏生殖功能和多基因致畸性的研究。因此,本研究对睾丸功能和各个年代的致畸性,以检查的功能状态和安全的逆转RISUG DMSO的血管阻塞,基于生殖器官重量、睾丸组织学,估计每日精子产量,附睾的精子数量、精子形态、生育比率,embryo-toxicity和畸形学的变化(如果有的话)分析该病例在F1, F2和F3后代/逆转老鼠的后代。

材料和方法

化学物质
苯乙烯马来酸酐、苯乙烯和马来酸酐的共聚物(1:1的比例),由这些化合物的辐照剂量的0.2 - -0.24兆拉德每40 g的共聚物,沉淀,干并存储在一个真空干燥器(商品名- RISUG)车辆溶解在溶剂DMSO(光谱级)请提供的美国教授k·古医学科技、印度理工学院(IIT) Kharagpur,印度。在这项研究中使用的所有其他化学物质均为分析纯,购自西格玛奥德里奇化工公司(印度)。

动物
八十只成年雄性白化病老鼠(体重180 - 200克)和160名女性的生育率(体重140 - 150克)查尔斯快应变研究中使用从研究所获得的动物屋。动物适应了1星期,保持在标准实验室条件(±20 c) 24日12:12 h光明与黑暗周期在个人聚丙烯的笼子里。动物喂养与颗粒状标准鼠饮食(立顿印度有限公司、班加罗尔)和水随意提供。实验协议制度动物伦理委员会的批准(IAEC),符合“科学研究动物保健和使用指南(印度国立科学院,2000)。

实验设计

血管闭塞
显然健康无病的老鼠在本研究中选择。成年雄性大鼠分为四组(Gr I-IV)包含20个动物都受到双边乙醚麻醉下血管阻塞。“瓦萨”号受到由单一切口手术中值略高于尿道口按前面描述的方法(Sethi et al ., 1990 b)。远端输精管壶腹部分位于脂肪的身体下有更大直径的管道,SMA的腔注入每个输精管。老鼠注射0.01毫升DMSO输精管的腔,作为控制在Gr (Gr)。老鼠。II, III和IV注射0.25毫克,0.50毫克和1.00毫克SMA溶解在0.01毫升DMSO (SMA-DMSO复杂)每脉管老鼠,分别。治疗的瓦萨号正常老鼠被放置在原来的位置,关闭切口用肠线缝合内部和上层皮肤切口用尼龙线。术后护理与Neosporin抗生素被酱粉和汞溴红溶液2% (w / v)和消炎药。抗生素,土霉素(辉瑞制药有限公司、孟买)肌内注射到每个老鼠连续5天按Sethi等方法,(1989)。动物在观察观察总行为变化(如果有的话)为70天。确定由一个intra-vassal注入血管阻塞的影响SMA-DMSO复杂的睾丸精子发生周期,睾丸横截面研究,每日精子生产(DSP)率计算,尾附睾的精子计数和生育测试完成了与正常雌性post-occlusion 71 - 74天。 The sperm morphology was checked microscopically in vaginal smears of mated rats for functional success of vas occlusion. After fertility test ten vehicle-control and ten vas-occluded rats by SMA-DMSO were necropsied for organ weight/histology/DSP/sperm counting studies. The remaining ten animals, each from control and vas-occluded groups, were subjected to vas occlusion reversal.

血管闭塞的逆转
血管闭塞的逆转在SMA-treated雄性老鼠在乙醚麻醉后70天的血管阻塞。“瓦萨”号被暴露和注射0.01毫升DMSO双边输精管的腔冲洗出SMA以类似的方式进入血管腔的血管阻塞一段3 - 4分钟正常溶解SMA在DMSO和洗诸侯管(Sethi et al ., 1992)。“瓦萨”号又被放置到原来的位置,关闭切口用肠线和尼龙线和术后护理是如前所述(Sethi et al ., 1989;1990 c)。功能成功确保了occlusion-reversal生育测试post-reversal段后60天。五动物control-reversal集团(Gr.I)和脉管occlusion-reversal组(Gr II-IV)与雌性老鼠交配和尸体剖检做了器官重量/组织学/ DSP /精子计数研究。

F1-F3后代
F1后代交配了车辆控制和SMA-treated(0.25、0.5和1.0毫克RISUG)脉管occlusion-reversal雄性大鼠与正常雌性老鼠在1:2的比率。后第二天早上,阴道涂片/插头观察精子的存在和确认怀孕第一天post-coitum。还精子形态学检查。
怀孕的大鼠观察整个妊娠期(21天),任何改变食欲和总行为变化如愤怒、抑郁和阴道出血。- 26天的妊娠期交付之前,剖腹产了50%的怀孕的老鼠记录数量的吸收,植入/植入网站,黄体,生活和死产的胎儿,尺寸和重量,性和总异常(如果有的话)在每个胎儿按前面描述的方法(Sethi et al ., 1989;1992)。
剩下的50%用于接下来generartion生育测试怀孕的老鼠。妹妹或弟弟幼崽分离和生育测试没有使用相同的父母。由此产生的后代F1的后代(n = 320)长大后维持了90天。第二代,F2和F3后代中获得类似的礼仪从同一组分别和维护在不同组(Gr I-IV)他们最初接受DMSO和SMA-DMSO复杂的描述获得F1的后代。结果小狗保持成长到成年生育能力测试。50%的后代又用来记录吸收的数量,植入,黄体,生活和死产的胎儿,尺寸和重量,性和总异常(如果有的话)。验尸器官重量和精子生育的特点是完成后测试使用五从每组动物。

参数
车辆控制的动物,血管闭塞,逆转车辆控制,血管闭塞逆转和F1, F2和F3后代从最初获得逆转老鼠后,进行评估

身体和器官重量
最初身体重量记录(0)天,70天post-injection和60天后脉管occlusion-reversal雄性老鼠。身体重量的F1、F2和F3后代也记录在天90(假定为0),160(如注射后70天期)和220(60天逆转时期)的年龄。生殖器官的重量也记录在每一个预定的牺牲,即60天post-reversal为所有三个F1, F2和F3后代。

睾丸组织学
从车辆控制和SMA-treated Bouin固定睾丸(血管闭塞)和逆转组织(Gr I-IV)的老鼠在分级系列乙醇脱水,清除在二甲苯和渗透/嵌在石蜡(580 c)。连续的横截面(5μm)是组织病理学苏木精和伊红染色。

每天在睾丸精子的产生率
测量睾丸的精子生产(DSP)匀浆进行了按前面描述的方法(阿曼et al ., 1976)。简单地说,睾丸实质是切成小块,放在0·25 mol / l蔗糖溶液(pH值7·5)和均质流体包含150毫米生理盐水/ l, 3·8毫米NaN3 / l, 0·05% (v / v)特里同X - 100使用一个超Turrax®(Janke和Kunkel, Staufen,德国)。匀浆进一步稀释相同的介质,和homogenization-resistant精细胞细胞核阶段IV-VIII步骤17 - 19的奥林巴斯显微镜三目的下的精子发生的周期数(日本奥林巴斯)使用纽鲍尔的血球计(阿曼et al ., 1976;阿曼& Lambiase, 1969)。DSP计算每克睾丸实质除以精细胞细胞核的数量与实质的重量和时间的乘积因子6.3天的鼠报道之前(Johnson et al ., 1980)。的值被表示为平均值±标准偏差(SD),每组五个动物。

附睾的精子数量
附睾的精子数量的估计,尾附睾切除,重,切成小块悬浮介质包含140更易与氯化钠,0.3更易与氯化钾,0.8更易Na2HPO4, 0.2更易KH2PO4和1.5更易与葡萄糖(pH值调整到7.3加上0.1 (N)氢氧化钠)和精子在100×g离心收集的2分钟。合成沉淀resuspended在新鲜的悬浮介质,稀释和精子计数在重复使用血细胞计数器相衬奥林巴斯三目的显微镜下每一个老鼠在x 200放大。的值被表示为平均总精子数量每毫升的悬架(罗伯et al ., 1978)。

生育能力测试
生育能力的测试,每一只雄鼠对照组(Gr。I)和SMA-injected组(Gr II-IV)完成post-injection时期71 - 73天。一夜之间,这些治疗的老鼠被选择同居的proestrous雌性比率(1:2)和积极的交配证实了精子在阴道栓或阴道涂片。交配的雌性分离和维护在单独的笼子里记录在分娩后幼崽在F1的后代的数量。百分之五十的怀孕女性被用于植入记录,viz.黄体数、数量的植入和吸收的数量(如果有的话)的评估胚胎毒性和致畸性。其余50%的怀孕女性被允许完成对F2后代和明智的F3后代进行了研究。

骨骼的评价
选中的幼崽/后代从控制⁄逆转,vas-occluded⁄逆转群动物被固定在70%的酒精,进行外部检查和内脏畸形的方法威尔逊和Warkany(威尔逊,1985)。一些胎儿清除了0.1%氢氧化钾(KOH)和茜素红染色技术(Sethi et al ., 1990 c;基督教et al ., 2003)为骨架的评估。

统计分析
学生的“t”测试和单向方差分析(一个因素方差分析)申请统计学意义和比较控制和治疗组大鼠。P值< 0.1和0.2被认为是作为非重要和P值< 0.05被认为是重要的。

结果

一般的行为
证明生育的雌性老鼠交配与早些时候SMA-treated男性没有任何食欲的变化,水的摄入量和总体上可观察到的行为,抑郁/刺激,在妊娠期。输精管堵塞控制和SMA -注射和逆转动物采取了手术的一周内正常行为。没有一个显示海波,超兴奋性紧张在植入,术后逆转和处理。在治疗大鼠妊娠期为20.5±0.71天与控制老鼠(20.00±1.41天)。在雌性动物没有阴道出血。没有异常影响分娩的雌性老鼠被注意到。没有观察到对泌乳的影响。没有观察妊娠期间死亡率。没有任何影响在发情周期(正常发情周期持续时间4.5±0.5天)和交配行为。

身体和生殖器官的重量
身体重量和生殖器官重量的数据从不同的群体(viz.控制和SMA-treated脉管occlusion-reversal)的老鼠和F1, F2和F3后代总结在表1 - 3。结果显示无显著变化(P < 0.1 - -0.2)在身体的重量由SMA-injection血管闭塞(0),与单一血管闭塞后SMA-injection(70天)和血管闭塞后逆转(60天)相比,作为控制雄性老鼠注射0.01毫升DMSO溶液。身体重量在F1, F2和F3后代也没有显示任何显著变化(P < 0.1 - -0.2)在不同治疗组大鼠的后代获得比控制在90天(0),160(70天post-injection)和220(60天逆转)年龄(表2),生殖器官重量viz.睾丸、附睾、腹侧前列腺,精囊,输精管没有任何明显的改变(P < 0.1 - -0.2)在treated-reversal比相应的控件在F1, F2和F3后代(表3)。
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每日精子产量和附睾的精子数量
DSP /通用在SMA-injected睾丸实质(血管闭塞)和occlusion-reversal老鼠相媲美,在车辆控制老鼠。尾的附睾的精子数量被观察到相似的车辆控制、SMA-injected逆转组大鼠模拟的(图3)。睾丸DSP率和尾附睾的精子数量也观察到类似的在F1, F2和F3两个相应的对照组大鼠相比(图4 A, B)。
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生育记录
生育前测试在正常成年大鼠注射SMA在DMSO溶液注入控制(Gr。我)大鼠与正常雌性交配1:2比率,显示100%的生育按显微观察的雌性老鼠的精子在阴道涂片/插头。在老鼠身上注射了SMA在剂量0.25,0.5和1.0毫克/血管(Gr II-IV)显示,0%生育正常成年雌性老鼠交配时。血管闭塞的逆转与雌性老鼠鼠交配显示100%的生育能力。生育记录F1、F2和F3后代显示比较正常的生育指标的控制(表4)。
畸形学参数观察分析该病例的黄体数、数量/植入物植入网站,活产,吸收,胎儿身长平均胎儿体重,平均和平均胎儿身体宽度的后代。这些畸形学的观察分析该病例SMA-reversal老鼠比较(P < 0.1 - 0.2)与对照组大鼠血管阻塞时逆转大鼠与正常循环雌性老鼠交配在所有三个(F1、F2和F3后代)代(表5)。

总值的观察
在胎儿,扭结等异常的尾巴,翻转爪和外翻畸形的控制以及在治疗组动物。这些都是常见的胎儿交付在研究所的繁殖生长。

内脏和骨骼形态
没有内脏异常的胎儿从F1, F2, F3后代控制或SMA-treated逆转大鼠组。骨骼形态的F1、F2和F3后代,茜素红染色显示没有检测到异常控制和脉管occluded-reversal动物。

讨论
外科输精管切除术,男性避孕方法阻碍了精子永久,没有进一步输精管切除术的逆转。这种手术避孕方法也引起附睾的功能障碍,精子异常,无法恢复生育能力(斯利瓦斯塔瓦et al ., 2000)。最近,化学的输精管阻塞RISUG(指导下可逆抑制和精子)已经被认为是理想的男性避孕方法在三期临床试验成功完成I和II期临床试验。聚合物SMA可以用来屏蔽腔的输精管超过一段时间。在我们的实验室中,系统性毒性评价RISUG-injection详细进行鼠,兔子和恒河猴之前(Sethi et al ., 1989;1990 a, b, c, d;1991)。结果表明,SMA-injection没有造成任何系统性毒性,男性介导致畸性和致癌性实验动物的潜能。
代致畸性,本研究在查尔斯·福斯特老鼠注射RISUG没有可观察到的变化性腺的函数(viz.器官重量、睾丸精子发生、DSP, ESC)、发情周期、交配行为,怀孕率,妊娠的早期阶段,器官形成,妊娠期、分娩、大小垃圾,垃圾重量不同天的断奶和哺乳期间不受影响。血管闭塞的SMA-injection接受70天期后大鼠100%抑制生育治疗雄性交配时引起的正常的女性。睾丸精子发生,每日精子的产生率和附睾的精子数量不受血管闭塞。精子形态学观察异常扰动在SMA-treated雄性70天后post-injection时期。它显示破损的头和尾,八卦,弯曲的尾巴,acrosomal赔偿,精子核变性等。类似的变化特点和形态导致损害头(顶体)和中段已报告在短时间内导致不育的血管阻塞RISUG-injection老鼠(Lohiya et al ., 1998;2010)。这种聚合物的本征性质通过降低pH值会导致抑制功能的精子卵子已经受精的能力早些时候报道(Sethi et al ., 1992;Misro et al ., 1979;古et al ., 1985)。进一步说,先前的研究已经清楚地展示了polyelectrolytic RISUG性质,表面电荷不平衡对人类精子膜系统和完整性对sperm-oocyte交互至关重要(乔杜里et al ., 2004; Sharma et al., 2008; Jha et al., 2009). In-Vitro studies with RISUG (at the concentration of 1.0 mg SMA dissolved in 100 ml of DMSO) have been shown to cause significant damage to the acrosome and its contents indicating loss of functional ability of sperms as evidenced by decreased levels of hyaluronidase, proacrosin and acrosin enzymes activity (Chaudhury et al., 2004). In the present study 0.01 ml DMSO is a very small dose and it did not cause any toxic effect even at 0.03 ml (Sethi et al., 1989; 1990b). This polymer injection reacts with cellular secretion and forms a stable precipitate within the lumen of vas and makes the microenvironment by lowering pH as well as enzymatic profile of sperms leading to sperm cell death. Moreover, magnetic field-directed Fe3O4–Cu–SMA–DMSO Cuproferrogel drug interaction with sperm cells that may open new dimensions in the field of biomagnetic technology. RISUG action on sperm cells had not altered by higher pulse magnetic field (PMF). But, PMF of 760 mT or above, causes 30% decrease in the sperm count and 70% decrease in sperm motility that induce the spermicidal enhancement potential (Jha et al., 2009). In females, effects SMA-injection in intra-fallopian tube / oviduct have been shown to cause oocyte abnormality, enlargement of zona, membrane disintegration and viability within 72 h (Jha et al., 2010).
输精管阻塞逆转(SMA-injected Gr II-IV)与雌性老鼠交配,显示非显著(P < 0.1 - -0.2)的变化身体和生殖器官重量、数量的干椰子肉lutea /植入网站/吸收和垃圾大小与对照组相比(DMSO-injected控制反转男性)的老鼠在F1, F2和F3后代相比,适当的控制。精子形态恢复和睾丸精子产量和附睾的精子数量类似于控制老鼠。内脏和骨骼形态相同,control-reversal治疗组与最近报道的研究Lohiya et al .,(2010)然而,在胎儿的异常,如弯折的尾巴,翻转爪和外翻畸形偶尔出现在控制以及在治疗组动物。这些异常是非常常见的胎儿分娩在我们研究所的繁殖生长。没有观察到除了内脏异常小的发现等骨骼形态学nonossified骷髅骨头,肋骨弯曲或肋间隙内,偶尔在所有组。它没有相关性在胎儿致畸作用SMA从F1, F2, F3进行控制或SMA-treated逆转组大鼠。后的分析数据中生成三个节段三代研究,得出RISUG——注射没有造成任何致畸效应在查尔斯·福斯特老鼠剂量(0.25、0.5和1.0毫克/血管/鼠)用于本研究。因此,逆转RISUG血管闭塞和DMSO是安全的,可行的和有效的生育导致100%的逆转。因此,它对人类可能表明一个重要的非侵入性的方法。此外,multi-centric III期临床试验在人类进步。

确认
作者感谢教授美国k·古医学科技、印度理工学院(IIT),提供RISUG Kharagpur、印度。作者感谢博士(太太)n Sethi优秀指导和技术援助r·k·斯利瓦斯塔瓦先生。这个项目是由I.C.M.R. C.S.I.R.,新德里。

结论
总之,我们的结果表明,saraca籼稻抑制自由基的形成的老鼠显示潜在的抗氧化作用。也表现出显著的保护血液参数。Saraca籼稻可能有效的治疗在治疗补血的相关疾病,因为它们具有抗氧化和Hematoprotective潜力。

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