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P - ISSN: 2347 - 2286
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帅王1#刘,宏伟1#杨,李1,粉丝1伊恩•w•威尔逊2羌族,王3*和德友邱1*
1国家重点实验室的树遗传学和繁殖,林业研究所,中国林业科学院,北京,中国
收到日期:08年7月2014;接受日期:07年9月2015;发表日期:2015年9月10
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(E, E) -geranyllinalool (GL)可以作为一个中间几个药物的化学合成以及昆虫信息素和香料。传统上,(E)橙花叔醇用作基质(E, E) - geranyllinalool但收益率很低由于多重和复杂的化学合成过程。在这项研究中,(E, E) -geranyllinalool合成酶基因(atg At1g61120)从拟南芥插入大肠杆菌向量pET30a (+)。含有质粒的大肠杆菌菌株pir, pGG启用(E, E) -geranyllinalool前体的合成,当与atg co-transformed时,能够合成(E, E) - geranyllinalool收益率31.42 mg / L。这是第一次报告的生产(E, E) -geranyllinalool通过操纵多个基因在大肠杆菌的生物合成途径。我们的结果可能会促进代谢工程向更具成本效益的生产(E, E) -geranyllinalool的微生物。
(E, E) -Geranyllinaloolsynthase,大肠杆菌表达、代谢工程、gc - ms。
Geranyllinalool (GL)是一个线性二萜具有特殊香味,和广泛用于装饰化妆品和洗涤剂1]。在不同的植物物种,包括拟南芥,geranyllinalool报告可能成为昆虫信息素吸引食草动物捕食者(2]。Geranyllinalool也是药房作为一个中间几个teprenone等药物。
(E)橙花叔醇通常用作化学合成的前体(E, E) -geranyllinalool通过八个步骤的反应,包括保护官能团,氧化反应,卤化反应,等。然而,这些复杂过程限制(E, E)的收益率-geranyllinalool合成化学(3]。有可能产生(E, E) -geranyllinalool通过代谢工程方法,使用特制的微生物。只有少数(E, E) -geranyllinalool合成酶(GES)基因包括atg [4在a .芥MtTPS3 [5在Medicago truncatula, PITPS2[6]在菜豆lunata克隆和表征。在植物,(E, E) -geranyllinalool是由(E, E, E) -geranylgeranyl二磷酸(GGPP)电气,而geranylgeranyl二磷酸合酶(GGPPS)催化isopentenyl二磷酸(IPP)和dimethylallyl二磷酸(DMAPP)前体形成GGPP [7]。IPP可以互换和DMAPP isopentenyl二磷酸异构酶(伊迪)来平衡他们的使用生产长链类异戊二烯前体(8]。甲基磷酸赤藓糖醇(MEP)通路在原核细菌和植物质体可能导致IPP (9),是由两个病原反应酶的产量,1-deoxy-D-xylulose-5——phosphatesynthase (dx)和1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate还原酶(DXR) [10]。截断E。杆菌基因伊迪,dxr和dx pCDFDuet向量构建重组质粒中插入pir并成功地提高了IPP的收益率和DMAPP11]。此外,GGPPS也表达E。杆菌为二萜产量提供GGPP前体代谢工程、一个质粒,pGG,包含截断冷杉属茅GGPPS基因,成功构造(12]。
在这项研究中,atg克隆,插入pET30A (+) (pET30a-AtGES)和co-transformed大肠杆菌pir和pGG获得的菌株(E, E) -geranyllinalool生产。值得注意的是,(E, E) -geranyllinalool收益率大肠杆菌应变C41窝藏pir (DE3)压力,pGG和pET30a-AtGES 8倍大肠杆菌应变BL21 (DE3),达到31.42毫克1 l结核病培养基。据我们所知,这是第一次报告的生产(E, E) -geranyllinalool通过操纵多个基因的生物合成途径大肠杆菌。
材料与试剂:拟南芥的哥伦比亚(Col-0)生态型是获得国家重点实验室的树在中国林业科学院遗传和育种。他们生长在土壤中生长室18°C 6周工作时间长条件下(16-h-light / 8-h-dark光周期)。a .芥治疗100μM甲基jasmonate (MeJA) 12 h。树叶从幼苗和收获就在液态氮冷冻RNA提取和后续分析。原生质pir和pGG获得教授鲁本·j·彼得斯(爱荷华州立大学)。
构建原核表达载体的atg:总RNA提取的a .芥叶使用RN38 - EASYspin + (Aidlab,北京)。合成第一链cDNA与3μg总RNA进行了使用PrimeScript™II第一链cDNA合成装备(豆类、大连)。濒死经历我和Xho限制性位点被用于克隆到向量pET30a(+)(泰和,北京)。根据规范的无缝组装克隆工具(泰和,北京),相应的结束(强调序列),建立了。atg的ORF (TPS04;At1g61120),上游引物AtGES-F (TTTAAGAAGGAGATATACATATGGCCACTCTCCTGCAAATAGGT)和下游引物AtGES-R没有终止密码子(CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGATCTAAAGGAATCGGATTGA)被设计使用Primer5软件。atg基因克隆使用底漆明星马克斯预混料(豆类、大连)、和插入pET30a(+)生产pET30a-AtGES结构用无缝组装克隆工具(泰和,北京)。
构建和表达(E, E) -geranyllinalool发酵工程应变:所有三个质粒含有0.5μg质粒DNA, pir, pGG和pET30a-AtGES(或pET30a (+)), co-transformed进大肠杆菌BL21 (DE3) (CWBIO,北京)大肠杆菌C41 (DE3)羌王教授(四川农业大学)。由此产生的重组菌株选择性条件下种植使用抗生素、氯霉素、壮观霉素,和卡那霉素浓度的34μg /毫升,50μg /毫升,分别50μg /毫升。表达式是证实了一个克隆测序和克隆被接种到60毫升液体结核病媒体根据莫龙et al(报道的方法11]。的摇动烧瓶文化,最初的增长记录阶段进行了37°C (OD600 ~ 0.6)。那么文化被转移到18°C瓶,和6毫升磷酸盐缓冲剂和660年μL 50%甘油补充道。摇晃举行200 rpm,文化被添加0.2毫米isopropy-β-D-thiogalactoside诱导(IPTG)继续增长48小时(11]。
10毫升文化是离心机为8分钟8000转/分钟,和细菌沉淀,这是resuspended 2毫升细菌蛋白分离设备(CWBIO,北京),孵化后和离心机在37°C 3 h。上层清液收集在sds - page分析atg重组表达。
gc - ms分析和量化的产品:剩下的50毫升文化提取使用50毫升己烷(费舍尔)8 h,然后用超声波提取进一步10分钟。己烷提取浓缩为1毫升,温柔相前的氮气流。分析了gc - ms分析,所有样品在一个安捷伦7890 a气相色谱仪配备安捷伦5975 c质量选择检测器和HP-5MS毛细管柱(30 m×250μm ID×0.25μm膜厚度)。1μL示例被注射离模式,是由氦气与1毫升/分钟流量。样本分析以下温度程序:2分钟80°C,紧随其后的是一个10°C /分钟增加到210°C,然后3°C /分钟增加到240°C。注射器和四极女士检测器温度为250°C和150°C,分别。标准曲线的使用(E, E) -geranyllinalool与不同浓度标准,100μg /毫升,50μg / mL, 25μg / mL, 12.5μg /毫升,6.25μg /毫升。(E, E) -geranyllinalool标准购买σ(中国,北京)。
构建原核表达载体的atg:ORF atg基因的2634个基点(图1),放大和插入pET30a(+)向量通过限制消化使用濒死经历我和Xho即重组结构转化为DH5α获得重组质粒pET30a-AtGES并通过测序证实。
图1:ORF的PCR产物atg。
融合蛋白的分析:atg表示在E。通过pET30a-AtGES转换为大肠杆菌大肠杆菌BL21 (DE3)和大肠杆菌C41 (DE3),空向量pET30a(+)作为消极的控制。sds - page分析表明,atg成功表达大肠杆菌与大约104 kD重组蛋白分子量(MW),符合预测兆瓦(图2)。
图2:页面的分析atg重组蛋白质。黑色的箭头强调的重组蛋白atg。
gc - ms分析:描述(E, E) -geranyllinalool生产、pET30a-AtGES, pir pGG co-transformed进大肠杆菌。工程应变文化的有机提取,并用gc - ms分析,这表明atg反应与GGPP (E, E) -geranyllinalool通过比较真实的保留时间和质谱标准。表示在图3,没有(E, E) -geranyllinalool生产控制应变与atg没有改变,和清晰的(E, E) - geranyllinalool峰值检测atg表达文化与相同保留时间(17.623分钟)和质谱的真实(E, E) -geranyllinalool (图4)。
图3:gc - ms的分析控制,发酵的产物atg在大肠杆菌和(E, E) -geranyllinalool标准。
图4:质谱(E, E) -geranyllinalool标准和发酵产品(E, E) -geranyllinaloolatg在大肠杆菌。
(E, E)的量化-geranyllinalool产生通过代谢工程方法:进行的定量分析(E, E) -geranyllinalool生产、外部标准曲线是通过注射一系列(E, E) - geranyllinalool标准与不同浓度。标准曲线的方程是Y = X + 5.804 * 8.636, R2为0.997,表明良好的可靠性量化。使用标准曲线和方程,(E, E) -geranyllinalool的收益率大肠杆菌BL21 (DE3)工程测量是3.74 mg / L。产量进一步改进进行使用大肠杆菌C41 (DE3)应变,据报道,有较高的蛋白质表达水平(13]。值得注意的是,8折产量增加C41检测工程应变产量为31.42 mg / L (E, E) -geranyllinalool获得。
(E, E) -geranyllinalool调药的中间,昆虫信息素和香料,通常合成(E) -橙花叔醇通过复杂的化学反应,这限制了产量。代谢工程方法被广泛用于合成各种化合物,但是需要的重要表征所需的生物合成基因合成所需的产品。atg特点是催化(E, E)从GGPP -geranyllinalool形成,可以利用通过代谢工程方法(E, E) -geranyllinalool。
在这项研究中,我们的重组表达构建atg并成功表达大肠杆菌压力。Coexpression pET30a-ATGES pir和pGG窝藏上游基因提供前体(E, E) -geranyllinalool导致一个好的(E, E) -geranyllinalool的收益率大肠杆菌BL21工程应变(3.74 mg / L)。优化使用大肠杆菌C41压力,增加了收益率为31.42 mg / L,这表明潜在的进一步提高产量,如整合甲羟戊酸(MVA)通路和前体喂养。进一步优化,我们的表达系统可能提供足够的商业合成(E, E)收益率-geranyllinalool生物反应器在不久的将来。
这项工作是支持的基础研究基金RIF (RIF2014-01)。
