研究和评论:研究的生物雷竞技苹果下载学》杂志上
菜单ISSN: 2322 - 0066
ISSN: 2322 - 0066
Roshni Choubey1*Verma、Ram的恩2,拉维•普拉卡什米希拉3和Pooja沙玛4
3研究生学习和研究部门Biolo gical科学,王妃Du rgavati Vishwavidyalaya,贾巴尔普尔,印度
收到日期:14/12/2016;接受日期:13/06/2016;发表日期:15/06/2016
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本研究进行了分离碱性蛋白酶产生菌,其识别和优化文化条件的碱性蛋白酶酶的生产。初步筛选明胶琼脂培养基上进行。其次明胶液化试验进行了检查在碱性蛋白酶的生产功能博士研究相关流程开发涉及到不同的发酵条件的优化对提高酶产量的文化条件(物理和营养因素)在固态发酵黄曲霉分离碱性蛋白酶生产的进行。选择不同类型的基质对黄曲霉生长。碱性蛋白酶生产被发现最高温度(280 c), pH值8,孵化时间168小时,与金属离子(Mn),氮源(蛋白胨)和碳源(蔗糖)水解的最大区域。获得了最高的光密度和蛋白质浓度在上述条件。偏碱性蛋白酶酶的纯化培养滤液是由硫酸铵盐沉淀,使用海藻酸钠固定化的固定化技术。洗涤测试导致完全删除的血迹表明这种酶可以证明洗涤剂行业的关键。
停止壁垒;戒烟的理由;香烟;饮酒;并发
酶是催化生物反应的蛋白质(1]。蛋白酶分解产生氨基酸肽债券和其他小肽(2]。他们分类根据最大活动在一个特定的pH值范围为酸性,中性或碱性;或活性部位群特征为金属、天冬氨酸的cystein或丝氨酸蛋白酶(3]。尽管蛋白酶生产微生物、植物和动物有世界性的自然分布;微生物群落是优于其他的大规模生产蛋白酶因其快速增长和简单的生活新重组酶的生成所需的属性。碱性蛋白酶的微生物来源具有相当大的潜在工业由于其生化多样性和广泛应用在制革厂和食品行业,药用配方、洗涤剂和过程废物处理、银复苏与解散的氨基酸混合物(4]。微生物碱性蛋白酶发现他们的房子最大的使用洗衣与洗涤剂的全球年产量约130亿吨(5]。
土壤微生物/生物活动是一个动态的媒介。采用土传真菌生存在一个广泛的博士的工人提供信息指示大发生的真菌在土壤各种栖息地包括根际土壤,家禽养殖场土壤(5],花园土壤、砂质土壤,土壤样本屠杀等等。生产特定的产品,如蛋白酶酶,发酵模式(固体或淹没)是获得最高产量的关键(6]。酶的成本取决于它的生产策略和下游加工。深层发酵更广泛用于生产的酶在商业规模但固态发酵有几个优点在深层发酵最小需水量,减少复杂的下游加工等。在尝试不同的微生物群体,丝状真菌在社保基金取得了高商业接受(7]。
记住这一切,目前的工作是为了分离碱性蛋白酶生产从竹林土壤真菌和更高的酶生产各种培养条件优化。努力是为了固定产生的酶和保持活跃,以供将来使用。
选择样本网站的
竹林土壤被选为样本网站现状调查。三个网站选择即TFRI区域,SFRI区和GCF区中央邦的贾巴尔普尔地区。
样品采集和处理
收集土壤样本在不同采样点的不受干扰的地方采用无菌土壤螺旋输送器、手泥刀和聚乙烯袋。土壤是使用钻孔机挖出20厘米深度和立即被舀进无菌的塑料袋使用手泥刀。收集的样本在每个站点从5点,然后混合在一起以获得一个代表性样本,买了实验室进行进一步的研究。样本连续稀释105稀释使用。
隔离的真菌
马铃薯葡萄糖琼脂媒体和玫瑰红琼脂媒体准备(pH值调整到10)和热压处理过的。1毫升连续稀释样本接种到消毒前和预固化PDA和澳大利亚央行琼脂板倾注平皿法和孵化28°C 2 - 3天。
对真菌的分离鉴定
隔离是进一步接种无菌接种和孵化PDA板块的28°C 48小时为了获得纯真菌文化。真菌分离株的菌落形态和显微镜检查(图1)被用来确定生殖和营养结构。识别进行了使用的教科书真菌学(8]。
图1:显微图像的黄曲霉。
碱性蛋白酶的初步估计生产(明确区水解测试)
明胶琼脂媒体准备和消毒。真菌文化被点接种接种方法准备盘子和保持在28°C 72小时。经过24小时的孵化盘子被观察到清晰的区域使用10%柠檬酸溶液水解。区最高的真菌分离水解是用于进一步的研究(图2)。
图2:明确区水解明胶琼脂培养基。
明胶液化试验
明胶媒体准备,消毒和刺穿了准备。接种不同的真菌分离株进行了以垂直方式和孵化28°C 3天。管取出,放在冷藏30分钟,观察固化。
真菌生物量的测定
选定真菌文化在presterilized PDA培养基接种和孵化到5天在28°C。孵化后获得的真菌垫透过preweighed绘画纸滤纸# 1,使用烤箱和干重。
大规模生产
选中的真菌分离是由固态发酵大量生产的10 g的碎米摄于烧瓶和20毫升的矿物盐溶液(KH滋润2阿宝4-0.7 g、K2HPO4- 0.7 g, MgSO4.7H2O - 0.7 g, NH4没有3- 1.0 g,氯化钠- O。OO5 g, FeSO4.7H20 - 0.002 g, ZNSO4.7H20 - 0.002 g, MnSO4.7H20 - 0.001 g,蒸馏水- 1000毫升),灭菌,冷却后,接种和孵化28°C 120小时。
提取粗酶
10毫升的0.1%补间80解决方案添加到2 g的发酵基质和均质旋转瓶1小时的180 rpm。固体被离心去除在8000 rpm 40度15分钟,结果是得到上清液用于进一步的研究。
优化
优化培养条件进行了不同参数即pH值、温度、氮源、碳源、潜伏期和金属离子对蛋白酶生产。
pH值
3锥形烧瓶被带到每个10通用碎米和20毫升矿物盐溶液添加,灭菌和冷却。pH值调整为8、10、12使用0.1 N盐酸和0.1 N的氢氧化钠。烧瓶放在BOD孵化器在28°C 5天。
温度
再次执行相同的程序除了三个烧瓶孵化在不同的温度下即28°C, 40°C和60°C 5天。
氮源
3锥形烧瓶被带到每个10 g碎米和20毫升矿物盐溶液是添加补充不同氮源(0.5%)即蛋白胨,牛肉膏和硫酸铵、灭菌和冷却。选中的真菌接种和孵化了。
碳源
3锥形烧瓶每个包含10 g的碎米20毫升矿物盐溶液补充不同碳源(葡萄糖、蔗糖、淀粉)灭菌和冷却。所有的烧瓶注射选定的真菌。
金属离子
不同的金属离子MnSO的形式4,FeSO4,ZnSO4添加了三个锥形烧瓶每个包含10 g的碎米20毫升矿物盐溶液和孵化28°C 5天。
潜伏期
研究培养时间的影响蛋白酶生产三个锥形烧瓶与类似的底物和培养液在相同温度不同时间间隔即孵化24小时,72小时,168小时后,观察5天。
定量评估对蛋白酶的生产
定量评估对碱性蛋白酶生产执行按乔普拉和Mathur。2通用的方法发酵物质在试管中被10毫升的1%补间80的解决方案是补充道。这震动旋转瓶1小时180 rpm。在10000转离心进行20分钟在4°C。颗粒被丢弃在上层清液用作细胞自由提取(酶解)深造。1毫升2%酪蛋白被用作蛋白质样品,1毫升的酶解决方案是补充道。在40°C孵化后10分钟。这个反应是停止使用2毫升10%柠檬酸溶液在室温下保持不变,20分钟,在8000转离心10分钟。上层清液收集0.5毫升的阴暗的试剂添加I和II和孵化20分钟之后,光密度测量在650海里。
部分纯化蛋白酶酶
酶纯化的工业酶生产过程中关键步骤。本研究在碱性蛋白酶酶是由硫酸铵沉淀部分纯化的方法。浮在表面的饱和和20%、40%和80%硫酸铵的解决方案。
固定
免费完整的细胞和细胞固定化进行了真菌和蛋白酶酶分别。对整个细胞固定化真菌垫被,溶解在2%海藻酸钠溶液(1:1),而细胞免费固定在治疗与硫酸铵沉淀获得解决方案被过滤掉,在TrisHCl溶解。这个解决方案是与海藻酸钠混合在1:1的比例(2%)。这些混合物被扔进0.2 CaCl的冷却方案2连续摇晃在4°C。珠子用去离子水清洗3 - 4次,最后用50 mm TrisHCl缓冲和复查的活动(图3)。
图3:蛋白酶酶洗试验。
清洗测试
3块棉布拍摄和血迹是放在每个for15分钟。3 petriplates干燥成膜,在第一次petriplate蒸馏水(DW)补充说,在第二蒸馏水和洗涤剂添加第三petriplate包含蒸馏水、洗涤剂和碱性蛋白酶酶解。棉布衣服血现货被放置在每个pertiplates和离开15分钟。布被取出,清除血迹干并观察(图4)。
图4:固定化酶珠子。
不同土壤样本连续稀释的纯在马铃薯葡萄糖琼脂稀释接种和玫瑰红琼脂和孵化后30真菌分离得到的板块属于10个不同属包括曲霉属真菌青霉菌,镰刀菌素链格孢属、根霉、毛霉菌,Curvularia和三个身份不明的隔离。曲霉属真菌sp.被发现中占主导地位。的成员曲霉属真菌已报告广泛在自然土壤,因为他们允许他们有营养和水分对所有不同生命周期的研究。全球分销的出版工作曲霉属真菌土壤中被Domesch记录(9),占第二位属被发现在目前的调查镰刀菌素spp。
初级筛选蛋白酶生产每个真菌文化点接种在瑞茜·琼脂培养基其次是孵化28°C导致明确的水解带刚做好的10%柠檬酸的应用解决方案。的隔离测试6分离碱性蛋白酶生产商中被发现。真菌文化展示碱性蛋白酶生产黄曲霉,黑曲霉、物种的镰刀菌素,根霉、链格孢属和青霉菌。6文化测试前三个显示清晰的区水解明胶液化测试当别人给了积极的结果。曲霉属真菌flavus给最高区直径25毫米,因此它是用于进一步的调查。
优化
优化区域的直径曲霉属真菌flavus在不同大气条件如pH值、温度、潜伏期和使用不同的金属,氮源和碳源导致区域不同大小的存在与否。最高的区域被认为是直径为碱性蛋白酶生产的最佳条件(表1)。同样获得最高OD和蛋白质浓度在执行洛瑞的蛋白质分析评估被认为是最适合碱性蛋白酶生产由选定的真菌(表2)。
| 环境条件优化 | 清除区直径(毫米) | |
|---|---|---|
| 碳源 | 葡萄糖 | 5毫米 |
| 蔗糖 | 20毫米 | |
| 淀粉 | 新西兰 | |
| 培养时间 | 24小时 | 21.6毫米 |
| 72小时 | 噩 | |
| 168小时 | 噩 | |
| 金属离子 | FeSO4 | 新西兰 |
| ZnSO4 | 新西兰 | |
| MnSO4 | 8.0毫米 | |
| 氮源 | 蛋白胨 | 19.5毫米 |
| 牛肉膏 | 新西兰 | |
| 硫酸铵 | 新西兰 | |
| pH值 | 8 | 30.0毫米 |
| 10 | 08.0毫米 | |
| 12 | 新西兰 | |
| 温度 | 28°C | 10.0毫米 |
| 40°C | 新西兰 | |
| 60°C | 新西兰 | |
表1。定性分析清除区生产蛋白酶的水解测试。
| 环境条件优化 | 光密度 | 浓度(毫克/毫升) | |
|---|---|---|---|
| 碳源 | 葡萄糖 | 1.496 | 13.38 |
| 蔗糖 | 1.993 | 18.48 | |
| 淀粉 | 1.224 | 10.58 | |
| 培养时间 | 24小时 | 0.072 | 1.24 |
| 72小时 | 1.820 | 16.70 | |
| 168小时 | 2.378 | 22.43 | |
| 金属离子 | FeSO4 | 0.027 | 1.70 |
| ZnSO4 | 0.740 | 5.62 | |
| MnSO4 | 1.172 | 10.05 | |
| 氮源 | 蛋白胨 | 0.650 | 4.69 |
| 牛肉膏 | 0.238 | 0.46 | |
| 硫酸铵 | 0.603 | 4.21 | |
| pH值 | 8 | 1.621 | 14.66 |
| 10 | 1.553 | 13.96 | |
| 12 | 1.354 | 11.92 | |
| 温度 | 28°C | 1.115 | 9.47 |
| 40°C | 0.934 | 7.61 | |
| 60°C | 0.902 | 7.28 | |
表2。由洛瑞的方法定量测定蛋白酶生产。
pH值的影响
3即pH值范围测试。8、10和12日区被发现的直径30毫米,分别为8毫米和不带。在pH值最高的直径30毫米8表明它是最适合这种真菌隔离。同样获得了最高浓度14.66毫克/毫升的博士在一项由Kalpana碱性蛋白酶酶的最佳pH值黑曲霉10.0被发现。还Derhum [10得出蛋白酶的最适pH值芽孢杆菌sp塞尔马。年代aquaticus位于10.0 - 10.5之间。它表明碱性范围适合真菌的生长以及蛋白酶生产。
温度的影响
温度是一个关键因素影响最大的酶活性和优化工业酶生产是必要的。3测试温度范围即。28°C, 40°C和60°C的最高的区域被发现10毫米直径28°C,而没有出现在其他区温度范围。9.47毫克/毫升浓度最高的是在相同的温度。类似的结果是得到Chowdhary [11与碱性蛋白酶产量最高黑曲霉和镰刀菌素sp.在类似的温度范围。研究由Nasuno和呼唤显示最大真菌生物量和蛋白酶生产35°C使用黄曲霉,米曲霉和青霉菌godliwskii它支持目前调查的结果。
碳源的影响
添加不同碳源的影响形式的单糖和多糖能影响酶的生产。为此从3碳源测试即葡萄糖、蔗糖和淀粉、蔗糖的使用给最好的结果与20毫米的区域大小,光密度1.993和蛋白质含量18.48毫克/毫升。蛋白酶的生产是相对较小的对使用葡萄糖和淀粉作为碳源。Malathi和Chakraborty12)报道,蔗糖是一个有效的碳源黄曲霉而葡萄糖被观察到的是有效的Conidiobolous coronatus据拉(13]。
潜伏期的影响
设计一个实验来调查不同的潜伏期的影响对碱性蛋白酶生产黄曲霉。的时间是24小时,72小时和168小时。水解得到的最高地带在孵化24小时的瑞茜琼脂板的直径21.6毫米在执行洛瑞的化验蛋白质估计,蛋白质含量最高的光密度2.378和22.43毫克/毫升被发现的孵化168小时。
金属离子的影响
碱性蛋白酶的生产似乎随在媒体上使用不同的金属离子。3金属FeSO使用4,MnSO4和ZnSO4使用,最高的区直径8毫米,光密度1.172和10.05毫克/毫升浓度与MnSO获得4。在研究由Yuan-Chi-Su [14据报道,Mn2 +和Ca2 +激活酶活性。
氮源的影响
不同的有机和无机氮源进行了测试研究氮碱性蛋白酶生产的影响。发现的最佳氮源为蛋白胨的区域直径19.5毫米,光密度0.650和4.69毫克/毫升浓度。还Chinnaswamy报道蛋白酶活性与蛋白胨和牛肉膏加强蛋白酶酶的生产。
实国家发酵
获得的碱性蛋白酶生产黄曲霉大规模生产使用固态发酵。固态发酵提供了许多优点包括使用昂贵的基质,简单的下游加工和降低能源需求与深层发酵。为此碎米作为蛋白质底物和被证明是很好的固体基质种植真菌足够增长了7天后孵化。这一发现配合,沙玛(15)报道,固态发酵提供许多优势包括容积效率高,浓度较高的产品和要求简单的发酵设备。发酵产品也可以直接使用的酶。
局部净化和固定
酶在工业净化是一个至关重要的步骤酶的生产的过程。本研究在碱性蛋白酶酶是由硫酸铵沉淀部分纯化的方法。浮在表面的饱和和20%、40%和80%硫酸铵的解决方案。最好的沉淀得到正常80%饱和溶解在三羟甲基氨基甲烷-盐酸,液给最佳固定化后酶活性。
部分纯化蛋白酶酶在海藻酸钠固定化的珠子。珠子被重2.385通用。珠被发现功能在测试它们在酪蛋白汤之后,洛瑞的方法,光学密度增加。免费细胞固定化珠子的记录光密度是1.980而对整个细胞的固定化是1.432。这表明细胞固定更有益的自由和经济的蛋白酶生产黄曲霉。
清洗测试
除了一些商业应用的蛋白酶用于洗涤剂行业de-staining是最重要的潜力。在这个调查部分纯化碱性蛋白酶酶被用来除去棉布血痕。蒸馏水不删除任何污渍。洗涤剂溶液除导致小而洗涤剂的组合解决方案与纯化碱性蛋白酶酶完全移除棉布的血痕。这表明蛋白酶酶从孤立的黄曲霉菌株可以获得重要的使用和意义在洗涤剂和纺织工业。
蛋白酶酶是大工业的重要性。这项研究表明,黄曲霉是一个有效的蛋白酶产生菌。碱性蛋白酶生产与Aspergillu sflavus被发现在最高温度(28°C), pH值8,孵化时间168小时,金属离子(Mn),氮源(蛋白胨),碳源(蔗糖)区最大的水解,蛋白质含量最高的光密度和最大在上述条件。清洗测试导致完全删除的血迹表明,以及其他许多行业,这种酶可以专门为洗涤剂行业被证明是非常重要的。
