抗氧化剂的合成没食子酸丙酯酯通过磁铁Nanoparticles-bound Lipolase

文摘

合成了柠檬酸的银纳米粒子,通过化学还原法(Lee-Meisel方法)而tri-sodium柠檬酸作为降低和稳定剂。柠檬酸浓度的影响,反应时间和反应温度在纳米粒子的合成进行了评估。Ag)的属性NPs携带tri-sodium柠檬酸盐在不同浓度通过紫外可见和红外光谱进行了调查。紫外光谱显示,SPR乐队在418 nm和符合Ag NPs通过SEM球形的形状。的大小和结构AgNps通过x射线衍射确定。傅立叶变换红外光谱研究表明有机组成部分的存在tri-sodium柠檬酸负责减少银纳米粒子。ser光谱符合银表面之间的结合位点和氧原子tri-sodium citrat。

关键字

磁铁矿铁纳米颗粒固定,Lipolase 100 l,酶稳定、酯化、没食子酸丙酯酯。

介绍

各种nano-carriers,纳米粒子,纳米纤维、纳米管等显示更大的能力来模拟酶纳米环境相比传统支持运营商提供的微观和宏观经济环境,常用于固定化酶。多孔结构的珠子(硅、海藻酸等),膜和纤维(> 100μm)有一些固有的缺陷,包括低稳定性、酶浸出和较差的可分散性。在各种类型的纳米粒子;基于铁的磁性纳米粒子用于固定化酶由于其降解性和生物相容性。铁纳米粒子的磁行为结果的简单和快速复苏nanobiocatalyst从反应混合物和生物催化剂的可重用性。表面改性的磁NPs之前是一个很重要的问题,需要考虑NPs上的固定化酶。NPs功能化的硅烷是共价连接的先决条件的酶改性纳米粒子,从而防止酶浸出和结果在提高酶的稳定性和延长保质期。单体的稳定剂,无机材料二氧化硅(1,2,黄金3]或钆(III) [4,5)和聚合物稳定剂如右旋糖酐、羧甲基化右旋糖酐carboxydextran,淀粉、阿拉伯半乳聚糖,粘多糖,磺化styrenedivinylbenzene、聚乙二醇、聚乙烯醇、泊咯沙姆,polyoxamines [6,7)进行表面改性和功能化nano-carriers报告。脂酶(EC 3.1.1.1)占领的地方突出生物催化剂中一个快速增长的生物技术和制药市场由于其小说在合成化学和多个应用程序。

除了细菌,酵母和真菌也脂肪酶生产的好来源。脂肪酶水解优先的长链脂肪酸(8,9除了酯化等反应,酰胺化、醇解、氨解。然而,实现生物催化在工业规模,有必要采用一个稳定和更便宜的生物催化剂,无毒,稳定,轻松分离/可回收和水或有机媒体中可以重复使用。Lipolase 100 l来自嗜热真菌Thermomyces langinosus被选为固定在铁磁NPs由于其固有的热稳定性(60 oc), alkalophilic自然pH值(9)及其潜在的被称为一个工业生物催化剂(10]。的n-popyl酸酯(E310)、没食子酸丙酯是一个著名的抗氧化剂用于含有油脂的食物,食品包装材料,非食品物品,如头发产品、化妆品、润滑油等。没食子酸丙酯被认为是安全的抗氧化保护石油& fat-containing食品酸败和腐败,防止过氧化物的形成。没食子酸丙酯酯的生物效应包括抗菌活性,紫外线(UV)辐射防护,以免,antimutagenesis, antitumorigenesis, antiteratogenesis anticarcinogenesis(安全评估表没食子酸丙酯,2007)。在目前的研究中,Fe3O4 /γFe2O3纳米粒子被准备,对酶活性和随后用于实现正丙醇酯化和没食子酸合成没食子酸丙酯酯在有机介质。

实验

材料和方法

的化学物质包括FeCl₃.6H₂0,氯化钠,K₂HPO₄和氯化钾从s.d Fine-Chem购买。有限公司,海得拉巴,印度;FeCl tetraethoxy硅烷(teo)₂.4H₂啊,牛血清白蛋白(BSA)、对硝基苯棕榈酸酯(p-NPP)和p-nitrophenol (p - NP)从阿尔法购买蛇丘,Manchaster,英格兰。不₂阿宝₄和甲醇从HIMEDIA实验室有限公司购买,孟买,印度。氨水、乙醇、正己烷、正庚烷n-nonane,环己烷,DMSO,正丙醇,质子,丁醇,和三羟甲基氨基甲烷缓冲液从默克公司购买达姆施塔特,德国。本研究中使用的化学物质都是高解析的品位。一个商业Lipolase 100 lThermomyces lanuginosus是提供作为礼物,诺维信/ S (Bagsvaerd、丹麦)。Lipolase 100 l含有8202 U /毫升脂肪酶活性和蛋白质505.6毫克/毫升代表一个特定的酶活性为16.2 U /毫克的蛋白质。

铁的合成磁性纳米粒子

共同沉淀(11一个广泛使用的磁性纳米粒子的合成方法(Fe₃O₄或γFe₂O₃)是基于化学计量和铁盐亚铁混合物的摩尔比率和可能由化学反应;

菲^{2 +}+ 2菲^{3 +}+ 8哦^{- - - - - -}菲₃O₄+ H₂O

的摩尔比2:1 (Fe^{3 +}/铁^{2 +}pH值),8 - 14和非氧化性环境,啉酮的性能在铁的沉淀₃O₄获得了(12]。然而,菲₃O₄(磁铁矿)形式是不稳定的,因为它是γFe容易氧化₂O₃(磁赤铁矿)形式存在的氧气。

菲₃O₄+ 2 h⁺γFe₂O₃+铁^{2 +}+ H₂O

铁(III)的水溶液氯化六水合物(FeCl₃.6H₂O)(0.6米)和(2)四水氯化亚铁(FeCl₂.4H₂O)(0.3)摩尔比2:1。氨水drop-wise添加到混合物连续搅拌和通过N₂在反应中鸡尾酒。反应进行pH值10 - 12。此后,该解决方案在40°C搅拌30分钟,150 rpm之后通过加热在80°C下另一个30分钟。磁NPs是保留紧随其后广泛用蒸馏水洗涤。冷冻干燥的NPs完全干。

表面改性的磁NPs

总之,NPs (Fe₃O₄或γ铁₂O₃)是集的形式悬浮下降1.5 g的NPs在150毫升乙醇。悬架是ultrasonicated(35%幅度在室温下20分钟)。脱氧水(1毫升)和750μl teo上面添加了NPs悬挂。暂停了12 h在37°C和NPs收集通过使用磁铁,NPs是乙醇清洗去除游离硅烷的痕迹。这些NPs干在旋转蒸发器被存储在N₂有细颗粒粒径减少(13]。

绑定的lipolase silane-coated NPs

商业Lipolase 100 l(丹麦诺维信)共价固定化在磁NPs silane-coated修改。对脂肪酶固定化(14),磷酸的修改NPs停牌30毫克钠缓冲盐水(PBS, pH值7.4)和悬浮在室温下用了5分钟。Lipase-PBS解决方案(5毫升的某些浓度)添加到它的N2和悬架一直摇晃24 h在37°C下高效固定化脂肪酶在磁NPs。Lipase-immobilized NPs相隔一块磁铁,上层的收集。这些NPs有几个洗PBS和终于到达了PBS为进一步使用。

脂肪酶活力测定

脂肪酶活性的上层清液和固定化生物催化剂是衡量之前报道的方法15使用p-NPP作为衬底。期间p-nitrophenol释放反应的吸光度测量在410海里。Lipolase活动的一个单位(U)被定义为μmol (s)公布的p-nitrophenol p-NPP的水解1毫升每分钟可溶酶或1毫克的固定化生物催化剂(包括重量的NPs)在标准试验条件下在45°C。

承载能力的NPs lipolase和决心的蛋白质绑定效率

调查总负荷容量和蛋白结合磁NPs效率,各种稀释Lipolase PBS (pH值7.4)准备(图1)。每个Lipolase-PBS股票的5毫升(稀释)装上5毫升的NPs悬挂(30毫克NPs在5毫升PBS)和在37°C,隔夜温和搅拌。此后,上层清液从每个样本(s)的康复并于NPs用于确定蛋白结合,这是计算减去总蛋白用于绑定从上层清液中总蛋白的恢复16]。

适当稀释Lipolase-PBS股票混合5毫升的NPs悬挂(30毫克NPs在5毫升PBS pH值7.4)是保持在37°C下隔夜温和搅拌。上层清液从每个准备恢复和化验,以确定蛋白质绑定NPs,由减法计算蛋白质的数量恢复的上层清液中总蛋白用于绑定NPs。

描述合成和NPs-bound lipolase

的大小和形态合成和NPs-bound Lipolase被扫描电子显微镜(SEM)观察到的加速电压15千伏。

的Thermo-tolerance NPs-bound lipolase

确定的最大NP-Lipolase活动在不同的温度下,NPs-bound Lipolase化验在温度范围40 - 70°C下10分钟后在单独的反应混合物中孵化震动。之后获得的酶的活动记录。

不同溶剂对NPs-bound lipolase

理想情况下,生物催化剂必须能够在不同的有机溶剂工作为了有效执行各种合成反应。NPs-bound Lipolase pre-exposed不同纯溶剂如正庚烷,n-nonane,环己烷,DMSO,质子和丁醇- 45°C 10分钟。NPs-bound生物催化剂是用1 x PBS (pH值7.4)和检查脂肪酶活性。

的可重用性NPs-bound lipolase

可重用性和恢复成为非常重要的参数,当我们使用固定化酶。磁NPs了作为一个优秀的脂肪酶载体导致酶分子的稳定。了可重用性的生物催化剂回收NPs-bound Lipolase多达10个周期的水解p-NPP在45°C 10分钟,。每次循环后,NPsbound Lipolase分离使用磁铁和给出了三次PBS (pH值7.4)洗准备了新鲜的循环酶法测定p-NPP。

酶的正丙醇酯化和没食子酸

酯化反应涉及solvent-mediated系统中没食子酸丙酯的合成是由不同的摩尔比率正丙醇/没食子酸(100 - 500毫米)催化50μl均匀暂停NPs-bound Lipolase。最终的反应体积是2毫升DMSO在Teflon-capped玻璃瓶里(5毫升容量)。反应是在55°C 14 h连同各自的控制(没有酶)。样本分析高效液相色谱法(HPLC)对没食子酸丙酯酯的存在。

高效液相色谱分析

C18柱(250×4.6毫米,5米;英特锡尔、GL科学公司)是用来确定鸡尾酒中的丙酸酯合成反应的行动NPs-bound Lipolase。样本大小是20μl和化验都是在重复值和均值。一个权力平等主义的流动相组成甲酸(0.1%,v / v)和乙腈(80%,v / v)在比50:50使用1毫升/分钟的流量。参考曲线校准与没食子酸丙酯(0.1到0.5毫米)。

结果

各种实验的结果提出了在接下来的部分

装载能力lipolase磁铁矿纳米粒子和决心的蛋白质绑定效率

不同的稀释Lipolase(浓缩的。< 5% ~ 41.5毫克/毫升)和PBS (1 x, pH值7.4)准备确定负荷容量和蛋白质绑定Lipolase磁铁矿纳米粒子上的效率。酶NPs达到一个饱和的装载量约为6.1毫克每毫克Lipolase磁铁矿纳米粒子与绑定效率为97.4% (图1)。然而,发现加载任何进一步增加蛋白质,%绑定Lipolase到纳米粒子从而减少。

表征lipolase NPs绑定

合成纳米粒子的大小和形态和NPs Lipolase使用SEM观察(图2)。的平均大小不同的粒子被发现在30 - 90纳米的范围。的扫描电镜图像NPs-bound Lipolase显示结果nano-biocatalyst NPs-Lipolase的凝聚结构的组成部分。

的Thermo-tolerance NPs-bound lipolase

温度的影响和thermos-tolerance NP-immobilized Lipolase评估(图3)。结果表明,最大NP-Lipolase活动获得了在温度45°C (148 U /毫升)。然而,发现NPs-bound脂肪酶活性,即使在温度70°C (135 U /毫升)因此NPs-bound生物催化剂能够在更广泛的工作温度范围即40到70°C。

的NPs-bound Lipolase孵化在40到70°C以下10分钟在单独的反应混合物摇晃之后,残留的脂肪酶活性化验。

不同溶剂对活动的NPs-bound lipolase

NPs-bound Lipolase的活动比烷烃比醇的存在当用作溶剂。的最高活动NPs-bound生物催化剂被发现后暴露在正庚烷(158.7 U /毫升)其次是正己烷(151.1 U /毫升),n-nonane (128.5 U /毫升)和环己烷(121.4 U /毫升)。这是观察到越来越度c连锁店醇的长度,水解NPs-bound生物催化剂酶活性降低(图4)。

的可重用性NPs-bound生物催化剂

或多或少的水解活性NPs-bound Lipolase原始Lipolase活动(~ 99%)保留10周期重复性的水解(图5)。此外,NPs-bound生物催化剂很容易清洗和保留的磁性吸引力。

NPs-bound Lipolase pre-exposed到每个纯溶剂在45°C 10分钟。生物催化剂用PBS (pH值7.4)每次使用后残留的脂肪酶活性化验。

合成没食子酸丙酯酯通过NP-bound lipolase

的能力NPs-bound Lipolase进行酯化反应的反应是通过高效液相色谱法分析测试产品。结果(表1)丙酸酯在反应混合物的存在。为了确定最佳反应物的比例获得最高产量的产品,不同的反应物浓度由不同一个反应物的浓度和其他保持不变,使最终的反应混合2毫升DMSO溶液的体积。克分子数相等的(500毫米)concentartion正丙醇、没食子酸的最大合成没食子酸丙酯酯的转换~ 81.4%。另一方面,过度的正丙醇或没食子酸丙酯的形成减少酸酯反应系统。似乎多余的酸或酒精可能负责denauration蛋白质/酶催化活性下降的勒达NP-bound Lipolase。

表1:合成丙酸酯在不同的反应物摩尔浓度。

反应混合物含有不同比例的正丙醇和没食子酸在DMSO在55°C 14 h在孵化的存在NPsbound生物催化剂。

讨论

近年来纳米技术的进步导致了各种纳米结构材料的发展,酶和生物催化剂的固定化。表面化学(17)和不同的理化性质如表面积与体积的比率,aquaphilicity,疏水性,粒子大小形状、地形和化学反应耦合固有化学、电和磁性纳米粒子使他们适合固定主机的一些重要的工业酶,18]。有益的纳米粒子的性质,成功合成了铁的磁性纳米粒子,有效地绑定到商业酶Lipolase, NPs拥有卓越的稳定性和可重用性(19,20.]。在一个固定的另一个实验假丝酵母玫瑰脂肪酶在烷基硅烷涂层铁₃O₄纳米颗粒的脂肪酶固定化脂肪酶被发现大约0.20毫克每毫克的纳米颗粒(14]。在目前的研究中,NPs-bound酶达到饱和量约为6.06毫克每毫克Lipolase磁铁矿纳米粒子绑定效率为97.4%,明显高于先前的报道。减少蛋白质%观察绑定,同时增加加载很可能饱和的账户绑定的脂肪酶/蛋白质分子NPs表面。此外,它也可能因为模糊的酶分子放置在酶分子的顶层或硬脂阻碍酶催化底物分子的网站(s)。

一个毛霉菌javanicus脂肪酶,有效地固定在二氧化硅纳米粒子21]显示优化的pH值在9.0工作范围8到10比自由酶优化8.0博士固定化脂肪酶在EDA-GA或EDA-NCS激活纳米粒子在60 oc保留62%或68%的初始活动120分钟孵化后,分别。在另一项研究中,(22)从一种细菌脂肪酶节细菌属sp。(ABL: IIIM查谟,印度菌株,MTCC 5125号)在非磁性固定化(A型)和磁场(B型)支持来自共聚3-aminopropyltriethoxysilane和teo显示增强的pH值稳定在5 - 9保留65 - 95%活动后48 h孵化与自由酶相比,在这种情况下是不稳定的(23]。非磁性和磁溶胶-凝胶复合材料保留60 - 70%活动1 h孵化后70°C。然而,在当前的工作中,NPs-bound Lipolase能够在更广泛的pH值和温度范围内工作,与pH值6.5到9.5好活动在极端pH值和显示温度公差范围在40°C到70°C。此外,NPs-bound Lipolase保留了几乎80 - 85%的最初活动即使28 h 70°C的孵化远高于先前的报道(14,22,24]。固定化酶的可重用性和恢复在很大程度上需要和重要参数,必须考虑,以确保高效和有效的固定。固定化脂肪酶在烷基trimethoxysilane-coated菲₃O₄纳米粒子(C18-Fe₃O₄)保留65%的最初活动7个周期后(14]。活动的减少可能是由于变性或浸出(分离)脂肪酶分子从纳米粒子。猪胰脂肪酶的共价固定化silica-coated修改磁铁矿纳米颗粒表面的固定化脂肪酶保留63.5%的初始活动6周期后(24]。然而,NP-Lipolase显示巨大的稳定性和重复使用。活跃,保留99%的活动甚至在10^th周期。这证实了脂肪酶绑定到silane-coated NPs是高度稳定,克服了enzyme-leaching问题早些时候报道了工人。

DMSO可溶于水,溶解酶,这总是导致蛋白质的失活的兴趣(25]。在不同溶剂的宽容NPs-bound Lipolase暗示其可能用于有机合成,选择性和相关应用程序。的NPs-bound Lipolase烷烃和DMSO显示增强的活动。它显示最高的活动向p-NPP (C16酰基集团)在各种测试正庚烷的存在。当NPsbound Lipolase受雇的合成酯即“没食子酸丙酯酯”的最大合成没食子酸丙酯酯在DMSO ~ 81.4%的转换可以实现。然而,过多的正丙醇或没食子酸丙酯的形成减少酸酯的反应系统及因为denauration勒达的蛋白质/酶催化活性下降的磁性铁NPs-bound Lipolase。

结论

磁铁矿和磁赤铁矿纳米颗粒(Fe₃O₄/γFe₂O₃通过使用FeCl)合成₃和FeCl₂在摩尔比2:1与teo修改。一个商业的脂肪酶Thermomyces lanuginosus即“Lipolase 100 l”是用于固定。Nano-biocatalyst高度稳定在广泛的温度范围和显示的活动增加了烷烃的存在。NP-Lipolase高度稳定和enzyme-leaching此前报告的问题是解决了。NPs-bound Lipolase仍几乎活跃在10个周期的水解和保留~ 99%的初始水解活动。没食子酸丙酯酯是有效地合成了NPs-bound Lipolase 55°C。一个克分子数相等的(500毫米)正丙醇反应混合物和没食子酸在DMSO给产品的最高产量。研究显示的稳定性和可重用性NPs-bound生物催化剂不仅在水和有机溶剂,而且成功地采用NPs-bould Lipolase没食子酸丙酯的合成酯的转化率为81.4%在一个相当短的时间内指示的适用性NPs-bound Lipolase实现生物催化在有机溶剂体系。没食子酸丙酯酯是一种抗氧化剂通常用于含有油和脂肪的食物,食品包装材料,非食品物品,如头发产品、化妆品、润滑油等。

确认

生物技术的金融部门的支持,科学技术部,印度政府部门生物技术、喜马偕尔邦大学,西姆拉(印度)是值得庆幸的是承认。此外,作者没有任何的利益冲突在他们工作的地方。

引用

1. Tartaj P, et al . Langmuir.2002; 18:4556 - 4458。
2. 张C等al.Silica——alkoxysilane-coated ultrasmallsuperparamagnetic氧化铁粒子:一个有前途的工具为磁共振imaging.Langmuir标记细胞。2007;23:1427 - 1434。
3. 陈M, et al .金色涂布铁纳米颗粒的生物医学应用。J: Phys.2003;93:7551 - 7553。
4. XuHK等al.J板牙杂志1992;77:12 - 716。
5. MorawskiAM等al.Targeted纳米颗粒与MRI.MagnetResonanMed稀疏的定量成像分子抗原表位。2004;51:480 - 486。
6. LacavaLM, et al .磁共振dextran-coated磁性流体在mice.BiophysJ静脉注射。2001;80:2483 - 2486。
7. ZhangY, et al。超顺磁的磁铁矿纳米粒子的表面改性及其细胞内吸收。生物材料。2002;23:1553 - 1561。
8. ArpignyJL Jaeger客。细菌分解脂肪的酶:分类和属性。BiochemJ。1999;343:177 - 183。
9. FojanP等al.What区分的酯酶脂肪酶:小说结构approach.Biochimie2000; 82:1033 - 1041。
10. Fernandez-LafuenteR J摩尔Catal B酶。2010;62:197 - 212。
11. 白蛋白的CanK等al.Immobilization aminosilane修改超顺磁的磁铁矿纳米粒子及其表征。胶体冲浪b . 2009;71:154 - 159。
12. Jolivet JP等al.Ironoxidechemistry。Frommolecular集群以extendedsolid networks.ChemCommun2004;5:481 - 487。
13. GuptaAK和水井。基团,超顺磁的纳米药物输送:制备、表征和细胞毒性的研究。IEEE TransNanobiosci。2004;3:66 - 73。
14. WangJ等al.Immobilization脂酶的烷基硅烷改性磁性纳米颗粒:烷基链长对酶活性的影响。PLoS ONE。2012;7:e43478。
15. WinklerUK StuckmannM。透明质酸盐,糖原和其他一些多糖Serratiamarcescens大大增强exolipase的形成。J Bacteriol 1979; 138:663 - 670。
16. 洛瑞哦,et al。蛋白质测量Folin酚试剂。J BiolChem 1951;193:265 - 275。
17. 拉森G,等。方法使无机和混合有机/无机纤维和囊泡直径在亚微米千分尺范围通过溶胶−凝胶化学和电迫使液体喷射。J是ChemSoc 2003;125:1154 - 1155。
18. 金正日K等al.Nanobiocatalysis及其潜在的应用。生物科技趋势》2008;26:639 - 646。
19. VaidyaBK等al.Immobilization假丝酵母的玫瑰脂肪酶在保利(allylglycidyl ether-co-ethylene乙二醇利用)大孔聚合物粒子。BioresourTechnol 99:3623 2008; 3629年。
20. 吴Y等al.In原地Fe3O4-chitosan磁性纳米颗粒的制备对脂肪酶固定化的交联及水溶液中氧化。BioresourTechnol 100:3459 2009; 3464年。
21. Kim MI et al .摩尔Catal BEnzym。2006;39:62 - 68。
22. Chaubey, et al。过程。2009;44:154 - 160。
23. Chaubey, et al .节细菌属sp.脂肪酶固定化的改进稳定性和选择性。ApplMicrobiolBiotechnol 273:598 2006; 606年。
24. Ranjbakhsh E, et al。增强稳定性和催化活性的固定化脂肪酶silica-coated修改后的磁铁矿纳米颗粒。ChemEng J 179:272 2012; 276年。
25. 匈牙利语CJ,等。新孤立的有机溶剂宽容杆菌sphaericus 205 y生产有机solvent-stable脂肪酶。J BiochemEng 2003; 15:147 - 151。