线虫分类鉴定和系统发育分析使用18 s rDNA和28 s rDNA寄生虫

文摘

分子经常被用于分类识别和标志系统发育分析在不同的物种群体。rDNA的发展是相对独立形态的变化,并分析这些基因数据已被证明提供良好的系统分辨率。所以,这是决定执行一个属的系统发育分析物种Leidynema appendiculata Hammerschmidtiella indicus和Schwenkiella icemi基于核糖体DNA(rDNA)序列。在当前的研究中,小亚基核糖体RNA基因的部分片段(半导体存储器rRNA)和大亚基(LSU rRNA)核糖体RNA基因测序的分子识别。在目前的研究中,属的物种的系统发育关系进行调查核苷酸序列的地区28 s rDNA和18 s rDNA。系统发育分析的主要序列数据以及使用neighbour-joining maximumparsimony方法。

关键字

线虫寄生虫,rDNA 28 s rDNA 18 s rDNA LSU rRNA,四rRNA,系统发育分析

介绍

在最近的过去,物种的描述和识别线虫几乎是通过形态学研究。然而,形态识别有时是基于和微小差异很小。分类学和线虫分类引入DNA测序和后发生了显著变化基因组研究[1- - - - - -7]。最近,分子标记经常被用于分类识别和系统发育分析在不同物种群体。核糖体RNA基因代表一个保守基因的发展相对缓慢。核糖体DNA基因组序列广泛应用于许多不同团体的生物体的进化研究。核糖体RNA基因提供基因秩序重建的发展史的效用,以及不同的碱基组成和密码子使用目前进步的使用比较基因组学的研究领域。与当前的发展DNA测序很可能在不久的将来,这将会改变,会打开一个新的机会研究生命周期变化的影响和微分选择压力从分子数据重建更深的关系。另一方面,这对rDNA比较基因组学研究,表明线虫代表一个好的模型来研究遗传与进化的各个方面。rDNA的发展是相对独立形态的变化,并分析这些基因数据已被证明提供良好的系统解决方案(8,9]。事实上,最近的一些研究真核生物rDNA序列用于系统发育分析做出强烈的祖先后代关系推论的形态分析数据时只导致更多的悬而未决的问题(10,11]。此外,最近rDNA核苷酸序列的分析用于访问类群之间的系统发育关系的高等和低等生物11- - - - - -13]。守恒的地区像18岁,1、2和28 s核糖体RNA (rRNA)基因,分子分类研究是非常有用的工具,正确识别寄生虫及其系统发育研究。所有这些工具是可靠的,并可能作为协助装备在主流的分类识别过程。这个基因的序列最近被用于研究解决线虫种类之间的系统发育关系,这证明是一个合适的标记基因条码的线虫。不同线虫的研究已经表明,18岁和28 s地区核rDNA提供有用的遗传标记的准确识别分类单元内的物种。选择合适的部分在一个生物体的基因组DNA是一个关键的步骤,任何系统发育研究[12,14]。选择的区域应该有足够的变化问题,允许一个估计的分类单元之间的历史关系。这种变化不能太大,以掩盖过去ancestor-descendant关系。核糖体rna基因被用于分子系统学是大亚基rRNA基因(28)和小亚基rRNA基因(18岁)。核糖体rna基因已被证明是有用的在评估系统因为它包含地区和其他地区发展缓慢地发展更快。因此这种基因已经被选择来推断差异rDNA用来检查动物寄生线虫之间的进化关系。

研究过程中,它是决定执行一个属的系统发育分析物种Leidynema appendiculata Hammerschmidtiella indicus和Sckwenkiella icemi基于核糖体DNA (rDNA)序列。在当前的研究中,小亚基核糖体RNA基因的部分片段(半导体存储器rRNA)和大亚基(LSU rRNA)核糖体RNA基因测序的分子识别。在目前的研究中,属的物种的系统发育关系进行了28 s rDNA使用区域的核苷酸序列和18 s rDNA。研究者相信,目前的工作将提供一个基线的发现这些物种的分子分类学研究和验证他们的特定的状态。回顾文献显示,一些分类研究使用分子工具进行外国工人使用18 s rDNA或28 s rDNA。纳德勒et al。15]研究了18 s rDNA内容t . krausi。此外,Koubkova et al。16]18 s rDNA内容Thelastoma gueyei。Spiridonov [17]28 s rDNA和18 s rDNALeidynema appendiculata, l . portentosae Hammerschmidtiella cristata和h . diesingi最近,Spiridonov Guzeeva [17]研究了28 s rDNA Thelastoma sp的内容。

材料和方法

寄生虫仔细切除了消化道的Periplaneta美国从密鲁特,印度。寄生虫被确定水平的物种形态使用现有分类键和描述。发现的寄生虫是:Leidynema appendiculata(18过,1932年,Hammerschmidtiella indicus辛格和Malti19),Schwenkiella icemi(20.Basir, 1956年。

DNA提取、扩增和测序

对于基因组DNA提取,线虫寄生的一个标本是固定在95%或100%乙醇。从样本中提取的DNA使用试剂盒DNeasy组织装备按照制造商的指示。聚合酶连锁反应(PCR)扩增的18岁和28 s核糖体DNA进行使用专门设计的引物。总容积为25μl用于PCR反应。每个反应包含10 x PCR缓冲,0.4毫米核苷酸,10点每一对引物的3μl模板DNA, 1 U Taq (Biotools)和Milli-Q水。PCR试验进行了在一个埃普多夫主周期计个人35周期。放大概要文件组成的3分钟在94°C, 30年代在94°C, 45 s 56°C和1分钟在72°C,紧随其后的是最后在72°C扩展10分钟。PCR产品可视化使用溴化乙锭1.5%琼脂糖此种凝胶。产品是由铬的纯化PCR清理工具(# PCR 10),根据制造商的指示。两股DNA测序使用染料终结者版本。3.1循环测序工具ABI 3130基因分析仪。同样的PCR引物被用于测序反应。

研究中使用的引物序列

正向引物的5 ' - TTGGCGTCTCAGTGTGAAAG-3”

反向引物的5 ' - TTCACCATCTTTCGGGTCTC-3”

正向引物的5 ' - AAACGGCTACCACATCCAAG-3”

反向引物的5 ' - CCAAGCACATGAACCAAATG-3”

系统发育分析

18岁和28 s rDNA序列被用来执行序列的系统发育分析。序列上传在NCBI寻找最相似的参考序列和位置的18岁和28 s基因测定的帮助下爆炸(可以在www.ncbi.nlm.nih.gov)。随后,各种物种的核苷酸序列对齐使用校准工具Clustal W (11]。序列进入大型建筑的系统发育树。数据分析使用最大吝啬(MP)和邻居——加入(NJ)方法通过使用大型版本4.0 (21]。两两比较使用Kimura-2参数模型是由(22]。核苷酸序列测序样品的相关序列和Electropherogram也提供的论文。

提交NCBI

大小亚基的碱基对序列下寄生虫提交基因库的核糖体DNA加入数字:GQ925910, GU968648, GU968649 GU968647。

型材料

正模标本和副模式幻灯片的寄生虫已经存入的博物馆动物学密拉特,Ch。C.S.大学U.P.、印度、凭证号码

•Leidynema appendiculata Nem / 2009/01

•Schwenkiella icemi Nem / 2010/02

•Hammerschmidtiella indicus Nem / 2010/03

结果与讨论

Leidynema appendiculata过,1932年

28 s rDNA L appendiculata序列(18,23使用clustal W)是一致的执行系统发育分析(表1和2;图1- - - - - -4)。在这项研究中使用的参考序列中列出表1。所示的两两比较表2使用Kimura-2参数模型(22]。的系统发育重建推断从28 s rDNA序列分析显示大分辨率的物种线虫。的Electropherogram测序样品也提供所示图1。序列相似性搜索l . appendiculata使用NCBI BLAST程序执行。分析多重序列比对是完成项目的帮助下,Clustal w .密切相关的物种的DNA序列也下载并使用的系统发育分析。

表1:参考序列(28)在这项研究中,使用他们的地理起源以及加入数字(星号由于相同的物种名称)。

表2:木村2 -参数距离序列差异比较(%)28年代物种间(星号由于相同的物种名称)。

使用大型版本的系统发育分析。4.0 [21]。距离分析,木村出现模型被用来构造距离矩阵和树推断从这个使用neighbour-joining (NJ)和最大吝啬(MP)方法与高度的信心(图2和3)。引导重采样(1000 pseudoreplicates)完成和引导树产生共识。方法给树相似的拓扑和近似相对引导价值。这些序列与28 s rDNA基因核苷酸序列在不同物种和显示明显差异(图4)。

不同的研究已经证明,28 s地区核rDNA提供有用的遗传标记的准确识别鉴定了总共兄妹物种和个变种。遗传reltaion之间l . appendiculata基于分子数据和其他物种从28 s rDNA基因序列表示最近的相似性l . appendiculata来自印度和l . appendiculata来自俄罗斯。相同物种和显示,99%核苷酸相似性。1%相似的差别的原因可能是由于不同的大洲和地理分布。核糖体的分子系统发育分析28 s rDNA表明其潜力澄清物种界限,形态相似,sympatrically发生。这些发现强调了28个年代的效用序列与其他形态特征描述物种密切相关的物种之间的界限。遗传相似性这些差异的原因来自两个不同大洲的同一物种,仍然是一个挑战性的问题进行进一步的调查。

基因与其他物种记录来自世界不同地区的可能改变我们的分类概念,这组/属和提供进一步的线索的演化的理解l . appendiculata。总之,这项工作证实,本属现代的识别和理解,工作应该是必然伴随着DNA分析。除此之外,它还建议的标准来验证和识别物种必须基于形态特征、基因鉴定和基因序列比较有分类的重要性。

Hammerschmidtiella indicus

rDNA(18岁)基因序列获得的标本indicus [h .24),18 s序列对齐使用clustal W[11]执行系统发育分析(表3和4;图5和6;补充图1和2)。在这项研究中使用的参考序列中列出表3。两两比较的序列是由(表4)使用Kimura-2参数模型(木)。的系统发育重建推断分析18 s rDNA序列表现出重要的解决这个物种的线虫。测序的Electropherogram示例所示还提供了补充图1。DNA序列的密切相关的物种也下载并使用的系统发育分析。系统发育分析使用大型版本。4.0 [21]。系统发育树构建从这个使用neighbour-joining (NJ)和最大吝啬(MP)方法与高度的信心(图5和6)。引导重采样(1000 pseudoreplicates)完成和引导树产生共识。产生了相似的系统发育树拓扑结构的方法和近似相对引导价值。这些序列是与18 s rDNA基因核苷酸序列在不同物种和显示明显差异(相比图2)。

表3:参考序列(18岁)在这项研究中,使用他们的地理起源以及加入数字。

表4:木村2 -参数距离序列差异比较(%)在18世纪的物种。

核糖体DNA序列广泛应用于许多不同团体的生物体的进化研究。rDNA提供一个封闭的系统内的机制基因组基因的重排,效用秩序重建的发展史,和碱基组成的差异目前进步的使用比较基因组学的研究领域。核糖体比较基因组学和系统发育重建可以让我们获得洞察几个方面rDNA进化的动物包括寄生虫。

Hammerschmidtiella indicus是第一种的属有小核糖体亚基rRNA基因区域测序物种歧视的目的。然而,需要进一步的序列从其他属的物种Hammerschmidtiella揭示线虫纲内的位置。的位置h . indicus系统发育树的重建在家庭Thelastomatidae证实了它的位置。他们的有效性也强烈支持的分子证据推断rDNA序列。树拓扑结构的系统发育分析推断18 s rDNA气候资料的协议,它是sister-taxa基因密切相关即,l . portentosae,t . icemi和答:tetraptera。与其他分子标记需要进一步的研究来确定h . indicus和其他线虫之间的分歧。

这项研究还表明,分子标记,比如rDNA所提供的,是有用的标记区分姊妹物种和有助于辨别物种,物种重叠和合并感染相同的终宿主尤其是形态差异往往很难确定。然而,线虫的分子系统发育研究仍处于初级阶段。

Schwenkiella icemi

研究过程中分析核苷酸序列的18岁,28 s地区核核糖体DNA (rDNA)是由(表5 - 8和图7和8)。的对齐序列与其他线虫序列发表在基因库是使用clustal W (25]。在这项研究中使用的参考序列18 s中列出表5和28 s中列出表7。两两比较是由使用Kimura-2参数模型所示表618岁,表828 s rDNA序列。的系统发育重建推断从分析28 s rDNA序列表现出极大的解决这个物种的线虫。提供的测序样品也是Electropherogram补充图3所示为18岁图928 s。DNA序列的密切相关的物种也下载并使用的系统发育分析。系统发育分析使用大型版本。4.0。序列似乎最密切相关,更发散良好支持进化枝的邻居加入(NJ)和最大的吝啬与高度的信心(MP) (图7和818岁;图10和1128 s;补充图3和图4)。

表5:参考序列(18岁)在这项研究中,使用他们的地理起源以及加入数字。

表6:木村2 -参数距离序列差异比较(%)在18世纪的物种。本研究对此物种测序。

表7:参考序列(28)在这项研究中,使用他们的地理起源以及加入数字。

表8:木村2 -参数距离比较序列之间的差异(%)28年代物种。本研究对此物种测序。由于相同的物种名称使用星号。

引导值,表明内部节点的可靠性,是设置在1000复制。方法给了系统发育树相似的拓扑和近似相对引导价值。这些序列是与18岁和28 s rDNA基因核苷酸序列在不同物种和显示明显差异补充图4所示为18岁图1228 s。

最近的一些研究线虫rDNA序列用于系统发育分析的强有力的推论祖先后代关系形态的分析数据时只导致更多的悬而未决的问题。因此,它是决定执行一个属的系统发育分析物种Schwenkiella基于核糖体DNA (rDNA)序列。rDNA的发展是相对独立形态的变化,并分析这些基因数据已被证明提供良好的系统解决方案。选择的区域应该有足够的变化问题,允许一个估计的分类单元之间的历史关系。这种变化不能太大,以掩盖过去ancestor-descendant关系。经常使用核糖体rna基因在分子系统学是小型和大型单元(18岁和28 s)核糖体rna基因。这些核糖体rna基因已被证明是有用的在评估系统因为它包含地区发展缓慢和其他地区更快的发展。在研究过程中,我使用了18岁和28 s rDNA检查动物寄生线虫之间的进化关系Schwenkiella icemi(26]。

在目前的研究中,系统发育关系的美国icemi [27)与其他物种的线虫进行了使用18岁和28 s rDNA的核苷酸序列。在这项研究中获得的序列与序列的其他线虫基因库。比较18岁通过爆炸序列搜索,query-18S序列被发现高度相似的序列Hammerschmidtiella indicus(97%),Leidynema portentosae(96%),Paraspidoderasp。(96%),Aspiculuris tetraptera(96%),Thelastoma krausi(95%)。此外,爆炸结果表明query-28S密切相似序列的序列Thelastomasp。(97%)、Cordonicola gibsoni (97%)。系统发育分析显示,高引导值强烈确认的位置在家庭Thelastomatidae (t . icemi图7,8,10和11)。所有的系统发育分析的结果清楚地表明美国icemi由一个分支,显然是不同于其他相关线虫。但基因库和分子生物学数据识别它Thelastoma icemi而不是美国icemi。与其他分子标记需要进一步的研究来确定之间的分歧t . icemi和其他Thelastomatids。

确认

作者感谢头,C.C.S.大学生态学系密鲁特,提供实验室设备。这项工作由科技部资助(批准号SR /那么/ A543/2005)。

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