线虫寄生虫18S rDNA和28S rDNA的分类鉴定和系统发育分析

摘要

分子标记物常用于分类鉴定和鉴定系统发育不同物种群的分析。rDNA的进化相对独立于形态的变化，这些遗传数据的分析已被证明提供了良好的系统发育分辨率。因此，决定对该属的物种进行系统发育分析阑尾草，Hammerschmidtiella indicus而且Schwenkiella icemi基于核糖体DNA(rDNA)序列。在本研究中，我们对小亚单位核糖体RNA基因(SSU rRNA)和大亚单位核糖体RNA基因(LSU rRNA)的部分片段进行了测序，以进行分子鉴定。在本研究中，研究了该属种间的系统发育关系核苷酸28S rDNA和18S rDNA区域的序列。对原始序列数据进行了系统发育分析，并使用邻域连接和最大简约方法。

关键字

线虫寄生虫，rDNA, 28S rDNA, 18S rDNA, LSU rRNA, SSU rRNA，系统发育分析

简介

近年来，线虫的种类描述和鉴定几乎都是通过形态学研究来完成的。然而，形态鉴定有时是基于非常微小的差异。引入DNA测序技术后，线虫的分类学和分类方法发生了很大的变化基因组研究[1-7］．近年来，分子标记已被广泛应用于不同种群的分类鉴定和系统发育分析。核糖体RNA基因是一种进化相对缓慢的保守基因。核糖体DNA基因组序列被广泛应用于许多不同生物群体的进化研究。核糖体RNA基因为重建系统发育提供了基因序列的效用，碱基组成和密码子使用的差异是目前比较基因组学研究的进展领域。随着目前的发展DNA测序在不久的将来，这种情况很可能会发生改变，研究生命周期变化和差异选择压力对从分子数据重建更深层次关系的影响将有一个新的机会。另一方面，这项比较rDNA基因组学的研究表明，线虫是研究遗传和进化各个方面的良好模型。rDNA的进化相对独立于形态的变化，对这些遗传数据的分析已被证明能提供良好的系统发育分辨率[8，9］．事实上，最近对真核生物的几项研究在系统发育分析中使用rDNA序列对祖先后代关系进行了强有力的推断，而对形态数据的分析只会导致更多未解的问题[10，11］．此外，rDNA核苷酸序列的分析最近已被用于研究高等生物和低等生物类群之间的系统发育关系[11-13］．核糖体RNA (ribosomal RNA, rRNA)基因的18S、ITS-1、ITS-2和28S等保守区是进行分子分类学研究、正确鉴定寄生虫及其系统发育研究的重要工具。所有这些工具都是可靠的，可以作为常用的分类鉴定的辅助工具。该基因的序列已被用于研究线虫种间的系统发育关系，该基因被证明是一种合适的线虫条形码标记。对线虫的不同研究表明，核rDNA的18S和28S区域为精确鉴定分类单元内的物种提供了有用的遗传标记。在有机体的基因组中选择合适的DNA片段是任何系统发育研究的关键步骤[12，14］．所选择的区域在所讨论的分类群之间应该有足够的可变性，以便对它们的历史关系进行估计。这种变异不能太大，以免掩盖过去的祖先-后代关系。在分子系统学中使用的rRNA基因是大亚基rRNA基因(28S)和小亚基rRNA基因(18S)。rRNA基因已被证明在估计系统发育中是有用的，因为它包含了进化缓慢的区域和其他进化较快的区域。因此，该基因已被选择来推断差异，利用rDNA来研究动物寄生线虫之间的进化关系。

在研究过程中，决定对该属的物种进行系统发育分析阑尾草，Hammerschmidtiella indicus而且Sckwenkiella icemi基于核糖体DNA (rDNA)序列。在本研究中，我们对小亚单位核糖体RNA基因(SSU rRNA)和大亚单位核糖体RNA基因(LSU rRNA)的部分片段进行了测序，以进行分子鉴定。在本研究中，利用28S rDNA和18S rDNA区域的核苷酸序列研究了该属种的系统发育关系。研究者相信，本工作的发现将为这些物种的分子分类学研究和验证它们的具体地位提供一个基线。文献综述表明，国外学者利用18S rDNA或28S rDNA分子工具进行了一些分类学研究。纳德勒等人[15]研究了18S rDNA含量t . krausi．此外，kubkova等人[16的18S rDNA含量Thelastoma gueyei。Spiridonov [17的28S rDNA和18S rDNA阑尾雷虫，L. portentosae, Hammerschmidtiella cristata而且h . diesingi最近，Spiridonov和Guzeeva [17]研究了猕猴桃28S rDNA的含量。

材料与方法

寄生虫小心翼翼地从消化道里切除了Periplaneta美国来自印度北方邦密鲁特。利用现有的分类学关键字和描述，将寄生虫鉴定到物种形态水平。发现的寄生虫有:Leidynema appendiculata［18奇伍德，1932，Hammerschmidtiella indicus辛格和马尔迪[19),Schwenkiella icemi［20.巴希尔，1956年。

DNA提取、扩增和测序

为了提取基因组DNA，将一个寄生虫标本固定在95%或100%乙醇中。根据制造商的说明，使用Qiagen DNeasy组织试剂盒从样品中提取DNA。聚合酶利用设计的引物进行链式反应(PCR)扩增18S和28S核糖体DNA。PCR反应总体积为25 μl。每个反应包含10X PCR缓冲液，0.4 mM dNTP，每对引物10 pM, 3 μl模板DNA, 1u Taq聚合酶(Biotools)和milliq水。PCR检测在Eppendorf Master Cycler Personal中进行35个周期。扩增曲线包括94℃下的3分钟，94℃下的30秒，56℃下的45秒，72℃下的1分钟，然后在72℃下最终延伸10分钟。用溴化乙酯在1.5%琼脂糖TBE凝胶上观察PCR产物。然后根据制造商的说明，用染色PCR清除试剂盒(# PCR 10)对产物进行纯化。两条DNA链都用大染色终结者进行测序。3.1 ABI 3130基因分析仪中的周期测序试剂盒。测序反应采用相同的PCR引物。

研究中使用的引物序列

正向引物5 ' - TTGGCGTCTCAGTGTGAAAG-3 '

反向引物5 ' - TTCACCATCTTTCGGGTCTC-3 '

正向引物5 ' - AAACGGCTACCACATCCAAG-3 '

反向引物5 ' - CCAAGCACATGAACCAAATG-3 '

系统发育分析

采用18S和28S rDNA序列对其进行系统发育分析。在NCBI上上传序列，搜索最相似的参考序列，并通过BLAST(可在www.ncbi.nlm.nih.gov上获得)确定18S和28S基因的位置。随后，使用对齐工具Clustal W[对不同物种的核苷酸序列进行对齐]11］．将序列输入MEGA构建系统发育树。数据分析采用最大简约(MP)和邻居连接(NJ)方法，采用MEGA 4.0版本[21］．采用Kimura-2参数模型进行两两比较[22］．文中还提供了相关序列的核苷酸序列和测序样品的电泳图。

提交NCBI

提交GenBank的寄生虫核糖体DNA小亚基和大亚基碱基对序列，登录号:GQ925910、GU968648、GU968649和GU968647。

型材料

寄生虫的全型和副型载玻片保存在兽医系博物馆动物学， Ch. C.S.大学，密拉特，北方邦，印度，在代金券号码下

•尾叶莴苣(Leidynema appendiculata Nem) /2009/01

•Schwenkiella icemi Nem/2010/02

•Hammerschmidtiella indicus Nem/2010/03

结果与讨论

奇伍德，1932年

阑尾莲28S rDNA序列[18，23]进行系统发育分析(表1而且2；图1-4)。本研究中使用的参考序列列于表1．两两比较显示在表2使用Kimura-2参数模型[22］．的系统发育从28S rDNA序列分析推断的重建结果显示，该线虫的种类具有很高的分辨率。测序样品的电泳图如图所示图1．利用NCBI BLAST程序对阑尾乳杆菌进行序列相似性搜索。在程序的帮助下进行了多个序列比对分析，并下载了近缘种的DNA序列并用于系统发育分析。

表1:本研究中使用的参考序列(28S)，它们的地理来源以及加入号(星号是由于相同的物种名称)。

表2:Kimura 2- 28S内物种间序列差异(%)的参数距离比较(星号表示相同的物种名称)。

系统发育分析采用MEGA ver进行。4.0 [21］．对于距离分析，使用Kimura 2参数模型来构建距离矩阵，并使用近邻连接(NJ)和最大简约(MP)方法来推断树，具有较高的置信度(图2而且3.)。进行了Bootstrap重采样(1000个伪重复)，并生成了一个Bootstrap共识树。这两种方法给出的树具有相似的拓扑结构和近似的相对自举值。这些序列与28S rDNA基因一致，表明不同物种的核苷酸序列存在明显差异(图4)。

不同的研究表明，核rDNA的28S区域为准确鉴定兄弟种和形态种提供了有用的遗传标记。之间的遗传关系l . appendiculata和其他物种基于28S rDNA基因序列的分子数据表明，它们之间的相似性最接近l . appendiculata来自印度和l . appendiculata来自俄罗斯。这两个物种是相同的，并且显示出99%的核苷酸相似性。它们之间有1%的相似度差异的原因可能是由于不同的大陆和地理分布。核糖体28S rDNA的分子系统发育分析表明，它有可能澄清形态相似的物种边界。这些发现强调了28S序列与其他形态特征结合在密切相关物种之间划分物种边界的效用。来自两个不同大陆的相同物种之间遗传相似性差异的原因仍然是一个具有挑战性的问题，有待进一步研究。

与世界不同地区记录的其他物种的遗传比较可能改变我们对该类群/属的分类概念，并为理解该物种的进化提供进一步的线索l . appendiculata．总之，这一工作证实了现代鉴定和理解该属的工作必须伴随着DNA分析。此外，还建议验证和鉴定物种的标准必须基于具有分类学重要性的基因的形态特征、遗传鉴定和序列比较。

Hammerschmidtiella indicus

从籼稻(H. indicus)标本中获得rDNA (18S)基因序列[24]， 18S序列用团簇W[11]比对进行系统发育分析(表3而且4；图5而且6；补充图1而且2)。本研究中使用的参考序列列于表3．将这些序列进行成对比较(表4)采用Kimura-2参数模型(Kimura)。从18S rDNA序列分析推断的系统发育重建显示了该线虫物种的显著分辨率。测序样品的电泳图也在附录中提供图1．我们还下载了近缘种的DNA序列，并用于系统发育分析。用MEGA ver进行系统发育分析。4.0 [21］．利用邻域连接(NJ)和最大简约(MP)方法构建了系统发育树，具有较高的置信度(图5而且6)。进行了Bootstrap重采样(1000个伪重复)，并生成了一个Bootstrap共识树。这两种方法得到的系统发育树具有相似的拓扑结构和近似的相对自举值。这些序列与18S rDNA基因进行了比对，结果显示不同物种的核苷酸序列存在明显差异(图2)。

表3:本研究中使用的参考序列(18S)，其地理来源以及登录号。

表4:18S种间序列差异(%)的木村2参数距离比较。

核糖体DNA序列被广泛应用于许多不同生物群体的进化研究中。rDNA提供了一个封闭的系统，在这个系统中基因组重排，基因顺序在重建系统发育中的应用，以及碱基组成的差异是目前比较基因组学研究的进展领域。核糖体比较基因组学和系统发育重建可以让我们深入了解包括寄生虫在内的动物rDNA进化的几个方面。

Hammerschmidtiella indicus是该属中第一个有小核糖体亚基rRNA基因区域测序的物种。然而，进一步的序列需要从该属的其他种Hammerschmidtiella来揭示线虫体内的位置。的位置h . indicus重建的系统发育树证实了其在Thelastomatidae科的位置。从rDNA序列推断出的分子证据也有力地支持了它们的有效性。根据18S rDNA数据集的系统发育分析得出的树拓扑结构一致认为它是亲缘关系密切的姐妹类群即，L. portentosae，t . icemi而且答:tetraptera．需要进一步的分子标记来确定H. indicus与其他线虫的差异。

这项研究还表明，分子标记，如rDNA提供的分子标记，是区分姐妹种的有用标记，有助于在同一确定宿主的物种重叠和共感染的情况下区分物种，特别是在形态差异往往难以确定的情况下。然而，线虫的分子系统发育研究仍处于早期阶段。

Schwenkiella icemi

在研究过程中，对核糖体DNA (rDNA)的18S、28S区核苷酸序列进行分析(表5 - 8而且图7而且8)。该序列与GenBank上发表的其他线虫序列的比对使用clustal W [25］．本研究中18S的参考序列列于表5和列于表7．使用Kimura-2参数模型进行两两比较，见表618S及表828S rDNA序列。从28S rDNA序列分析推断的系统发育重建显示了该种线虫的高分辨率。18S和测序样品电泳图如补充图3所示图928 s。我们还下载了近缘种的DNA序列，并用于系统发育分析。用MEGA ver进行系统发育分析。4.0.这些序列似乎是最密切相关的，但差异更大，具有良好的邻居连接(NJ)和最大简约(MP)支持的分支，具有较高的置信度(图7而且818岁;图10而且1128 s;补充图3和4)。

表5:本研究中使用的参考序列(18S)，其地理来源以及登录号。

表6:18S种间序列差异(%)的木村2参数距离比较。†本研究中已测序的物种。

表7:本研究中使用的参考序列(28S)，其地理来源以及登录号。

表8:树种间28S序列差异(%)的木村2参数距离比较。†本研究中已测序的物种。星号的使用是由于相同的物种名称。

引导值(表示内部节点的健壮性)设置为1000次复制。这两种方法给出的系统发育树具有相似的拓扑结构和近似的相对自举值。这些序列与18S和28S rDNA基因进行了比对，结果显示不同物种的核苷酸序列存在明显差异，见18S和的补充图4图1228 s。

最近几项关于线虫的研究在系统发育分析中使用rDNA序列对祖先后代关系进行了强有力的推断，而对形态数据的分析只会导致更多未解的问题。因此，决定对该属的种进行系统发育分析Schwenkiella基于核糖体DNA (rDNA)序列。rDNA的进化相对独立于形态的变化，这些遗传数据的分析已被证明提供了良好的系统发育分辨率。所选择的区域在所讨论的分类群之间应该有足够的可变性，以便对它们的历史关系进行估计。这种变异不能太大，以免掩盖过去的祖先-后代关系。在分子系统学中使用非常频繁的rRNA基因是小亚基和大亚基rRNA基因(18S和28S)。这些rRNA基因已被证明在估计系统发育中是有用的，因为它包含了进化缓慢的区域和其他进化较快的区域。在研究过程中，我利用18S和28S rDNA研究了动物寄生线虫与线虫的进化关系Schwenkiella icemi［26］．

在本研究中，S. icemi的系统发育关系[27用18S和28S rDNA的核苷酸序列对其他几种线虫进行了研究。本研究获得的序列已与GenBank中可用的其他线虫序列进行了比对。通过BLAST搜索比较18s序列，发现query-18S序列与的序列高度相似Hammerschmidtiella indicus(97%),Leidynema portentosae(96%),Paraspidoderasp。(96%),Aspiculuris tetraptera(96%),Thelastoma krausi(95%)。BLAST结果表明，query-28S序列与的序列非常相似Thelastomasp. (97%)， Cordonicola gibsoni(97%)。系统发育分析显示，较高的bootstrap值有力地证实了T. icemi在Thelastomatidae (图7，8，10而且11)。所有的系统发育分析结果清楚地证明了这一点美国icemi单分枝的:以单一分支为代表的，与其他相关线虫明显不同的但基因库和分子生物学数据认为它是Thelastoma icemi而不是美国icemi。进一步的研究需要更多的分子标记来确定两者之间的差异t . icemi和其他Thelastomatids。

确认

作者非常感谢密鲁特C.C.S.大学动物学系系主任提供的实验室设施。这项工作由科学技术部(批准号SR/SO/A543/2005)资助。

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