Deinoxanthin的细胞毒性效应之间的比较和Mitomycin-C MCF7细胞系和暴露后的伯灵顿和BCL2基因变化

文摘

背景:Deinoxanthin,类胡萝卜素提取分离耐辐射球菌。Mitomycin-c癌症化疗剂,已被用于治疗大范围的恶性肿瘤包括但不限于子宫、肺癌、胸部、腹部和膀胱癌30多年了。

目的:本研究的目的是调查的凋亡效应deinoxanthin mitomycin-c MCF7细胞株相比。

方法:凋亡在MCF效果进行评估₇细胞形态变化并通过细胞生存能力和测量结果。细胞的生存能力是衡量使用MTT测定和凋亡和抗凋亡基因的表达被实时PCR化验。

结果:half-maximal抑制浓度(IC₅₀)值对MCF7 deinoxanthin细胞系24后,治疗后48和72小时分别为18.18,22.18,21.18μg /毫升和集成电路₅₀mitomycin-c值分别为2.26,0.96,1.96μg /毫升。此外,在MCF BCL2和伯灵顿表情₇细胞系增加mitomycin-c治疗,deinoxanthin和这两种细胞毒性药物。

结论:目前发现展示小说的功能属性deinoxanthin隔绝抗放射性的细菌作为一种强有力的细胞凋亡的诱导MCF₇乳腺癌细胞系。这些数据表明,deinoxanthin可能是有用的作为一个chemopreventive克他命的代理人。

介绍

耐辐射球菌是一个著名的细菌抵抗活性氧的暴露于电离辐射和氧化应激。这种细菌的抗氧化作用是高度相关的类胡萝卜素提取(1]。中提取类胡萝卜素,deinoxanthin已被证明有很强的保护和恢复对DNA的影响2]。这种化学物质的结构也有几个共轭双债券和一个羟基位置1 c。deinoxanthin的优越的抗氧化效果可以与提到的独特的化学结构(1,3]。癌症可以被看作是一个细胞生长和死亡之间的不平衡。减少细胞死亡是由于抗凋亡基因的过度表达和抑制细胞凋亡基因的表达。伯灵顿和BCL2已确定具体细胞凋亡的重要蛋白质,其不平衡的表达式,以及血管生成因子的存在,将加剧体内稳态的decrementation [4- - - - - -8]。此外,损坏伯灵顿和BCL2基因和抗凋亡基因的过度表达,包括BCL2曾被观察到在各种癌症包括黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌、慢性淋巴细胞白血病,以及抵抗癌症治疗。(4,9,10]。在许多研究中,为了消除癌细胞选择性,强大的抗氧化剂以及常用化疗药物的使用提出了(2,7,11,12]。同时,在先前的研究中,癌症细胞的诱导凋亡deinoxanthin调查和凋亡和生存能力的影响,形态变化,DNA碎片被氧化剂(测量2,13- - - - - -15]。研究的结果表明,deinoxanthin减少活动促进酶的水平半胱天冬酶3的表达BCL2,一个已知基因对细胞凋亡在肿瘤细胞的表达增加伯灵顿基因表达,凋亡基因(2,9]。本研究的目的是调查mitomycin-c和deinoxanthin的凋亡特性的可能性。由于不同的因素参与细胞凋亡,两个基因BCL2家庭被视为变量。的细胞毒性效应mitomycin-c和deinoxanthin评估乳腺癌MCF7细胞线。

材料和方法

材料和设备

蓝色、黄色和水晶技巧从QC实验室购买()。样本来自Nichipet II。96孔板从SPL购买()。猎鹰(15 - 50毫升)和瓶(25 t)是获得JetBioFil(中国)。板、超小型电子管、瓶、纽鲍尔钱伯斯和离心管(5毫升)都从Biologix购买()。MTT试验设备是获得Biosera(法国)。Deinoxanthin购买从化学和化学工程研究中心的伊朗(德黑兰,伊朗)。MCF7(人类乳房腺癌(IRBC代码:C10682)细胞系从伊朗获得生物资源中心(德黑兰,伊朗)。胎牛血清(的边后卫),DMSO, DMEM和RPMI文化获得Bio-Idea(德黑兰,伊朗)。PBS(磷酸缓冲盐)和EDTA-Trypsin买来Biosera(法国)。 Mitomycin- C, penicillin and streptomycin were purchased from Sigma-Aldrich (Darmstadt, Germany). DEPC Treated Water and Rnx_Plus were acquired from Cinnagen (Tehran, Iran). Laminar flow cabinet (by KimyaGen, Tehran, Iran), Incubator (SCI FINETECH, Seoul, Korea), centrifuge (CENTURION, West Sussex, United Kingdom), Invert microscope made by Sunny (Japan). Cooling system, ELISA reader, Real-Time PCR by Bioneer, autoclave, and nanodrop device were used in this study.

方法

deinoxanthin的决心和准备

派生deinoxanthin特征进行比较与预注册数据这种化合物细胞毒性的影响。有各种各样的技术来研究这种物质的性质。最常用的技术之一是deinoxanthin的紫外光谱和吸收光谱。在这项研究中,耐辐射球菌文化是购买的化学化工工程研究中心。然后,在实验室里,用分光光度法测定其技术,根据参考;deinoxanthin的存在被证实。因此,吸收光谱的峰值在220 nm证明deinoxanthin (图1)。在15毫升猎鹰deinoxanthin的准备后,浓度的0.5,1、5、10、20、30、40和50μg /毫升准备用去离子水稀释。

不同浓度的mitomycin-C做准备

完整的mitomycin-c粉瓶(2毫克)是完全溶解在4毫升水(500μg /毫升)的浓度。测量mitomycin-C的细胞毒性效应和比较deinoxanthin, 0.5, 1、2、5、10、20μg /毫升浓度准备解决方案的准备。

DMEM培养基的制备

基于MCF7纹理的规范从伊朗获得生物资源中心,这一类的适当环境DMEM,含有人体所必需的氨基酸,维生素,和盐。为了营养,900毫升的去离子水加入1 L锥形烧瓶和一块磁铁。然后放在一个电磁搅拌器,37.16 g DMEM粉和碳酸钠粉317克重和添加到容器作为一个缓冲区。解决方案后,pH值在7.2 - -7.4的范围调整,这是与0.26微米过滤器在层流消毒柜。防止细菌生长在营养培养基,7.5毫升penicillin-streptomycin抗生素添加到解决方案。然后100毫升去离子水添加到培养基到达最后一个1000毫升的体积。最后,在层流柜、培养基的筛选和运输两个500毫升的眼镜和转移到冰箱储存。的培养基的稳定时间是2周在冰箱里。

细胞培养

DMEM培养基制备10%牛血清和penicillin-streptomycin 1%为一个完整的细胞培养基。一些细胞产生大量的内源性二氧化碳。每24至48小时,细胞培养基代替。覆盖瓶底后骨髓细胞和实现confluency 70% - 87%在最初的文化,相应的是:1。在每个瓶培养基被清空,2。细胞表面洗了大约2毫升磷酸缓冲盐PBS, 3.1毫升瓶trypsin-EDTA酶添加到2厘米,3。瓶转移到孵化器增加酶功能3分钟,4。瓶是太容易了一点单独的细胞从烧瓶楼,5。胰蛋白酶影响中和通过添加培养基含有17%的边后卫7.5毫升瓶和移液和创建细胞悬液,6。暂停被转移到15毫升要求和离心机在1500 rpm 25°C 1.37分钟。 The supernatant was removed [7细胞培养基中含有17%的边后卫加入1毫升的沉淀。移液和创建细胞悬液后,它被转移到两三个新烧瓶内的细胞密度,8.4毫升细胞培养基含有17%的边后卫被添加到每个瓶和新水瓶被转移到孵化器,9。台盼蓝了悬架和细胞数之前将烧瓶的孵化器。

冷冻细胞

冻结,瓶中的上层清液必须被移除,细胞必须与PBS洗。这些细胞被培养几分钟在37°C和移液纯化。制备细胞悬液后,进行细胞计数和细胞的可行性。根据统计,所需的cryovials决心和细胞的数量特征,包括细胞系的名称,细胞的数量,通过数字,和冻结日期,插入到cryovials。然后,cry-vials被放置在冰和借助微量滴定;中包含DMSO的边后卫,DMEM是并添加到cryovials准备的。cryovials被转移到一个freezer-20°C 1 - 2小时。当时冻结在80°C 24小时并最终转移到氮罐(196°C)。

溶化的细胞

文化所需的冷冻细胞系,氮的cryovial被坦克和继续谨慎的行动和速度:10毫升含有20%的牛血清和80%的DMEM培养基与抗生素混合添加到瓶中。然后,在cryovial打开释放氮气。然后放在双层蒸锅,融化了旋转运动。然后,它被转移到瓶。最后,烧瓶在37°C的环境中含0.05%二氧化碳。

计数细胞

细胞悬液的制备的卷1毫升,用移液器吸取20μl 25%台盼蓝和同样体积的细胞悬液在96孔板坑了。10毫升的混合物放在一个纽鲍尔室。

细胞治疗与丝裂霉素C和deinoxanthin

后计数1毫升的MCF7细胞体积,三列的96孔板被分配与3000细胞MCF7细胞和两个井从第四列的-控制。24小时的潜伏期后,deinoxanthin和丝裂霉素C的解决方案添加到行1和2和一行被处理材料。也没有治疗被认为是消极的控制。然后改变了细胞的颜色在MTT测定和分析了使用伊丽莎读者。

MTT试验

5毫升的RPMI1640添加到粉瓶12毫升的MTT的解决方案,这是涡和悬浮粒子被离心和过滤。然后,明确解决方案也同样分为5瓶。每个瓶足以在100口井进行测试。瓶是稳定在4°C为4周。其他瓶准备后续测试存储12个月的-20°C。准备细胞后,10μl 12毫米MTT解决方案是每个好,认为是一个消极的控制。然后,10毫升的股票的解决方案添加到non-cell培养基。盘子被转移到37度培养箱4人力资源。孵化后,板被撤的孵化器和50μL异丙醇的解决方案是添加到每个好并放置在一个孵化器10分钟。然后,在每个被转移到一个解决方案ELISA读者分析570海里。

实时聚合酶链反应

互补脱氧核糖核酸分子变性4分钟的95°C。然后,温度保持在94°C 30秒直到变性阶段完成后,然后30秒,温度降至57°C到DNA链搭配,在30秒内,温度增加到72度允许DNA链延长。不同温度的存在步骤提供了40个周期的传播。

结果与讨论

分布的可行性试验3组deinoxanthin, mitomycin-C和混合后24、48和72小时中可以看到表1- - - - - -4。在这些表可以看出,他们都有一个正态分布。

表1:正常MCF7癌细胞的生存数据暴露在各种mitomycin-C剂量在24、48和72小时后接触毒品。

表2:正常MCF7癌细胞的生存能力deinoxanthin在24日接触不同剂量后48和72小时暴露于药物。

表3:正常的可行性MCF7癌症细胞暴露于不同剂量mitomycin-C和deinoxanthin 24日48和72小时后接触毒品。

表4:正常的表达上的数据变化的伯灵顿和2 bcl基因在接触Mitomycin-C -, deinoxanthin并结合接触毒品后24小时

细胞接触后mitomycin-C的可行性

比较不同浓度的影响在24日mitomycin-C 48和72小时暴露后,MCF7癌症细胞与对照组相比表明,细胞暴露在浓度最高的三倍。最高的可行性率为观察20μg / cc和最高浓度的0.5μg / cc。计算集成电路₅₀24、48和72小时是2.6,0.96和1.96μg /毫升,分别。mitomycin-c浓度的增加导致减少的可行性MCF7细胞癌细胞。从0.5μg / cc的浓度,细胞的生存能力与对照组有显著差异。另一方面,通过增加治疗时间与mitomycin-C癌细胞,细胞的生存能力会降低。控制负面细胞越来越72小时后,细胞的生存能力大大减少与其他两组相比在不到72小时

比较不同浓度的影响在24日deinoxanthin 48和72小时后暴露MCF7癌细胞deinoxanthin对照组相比表明,细胞在最高浓度的三倍(50μg / cc)比例最低的生存能力和集成电路计算₅₀24、48和72小时为18.18,22.18和21.18μg / cc,分别。增加的浓度deinoxanthin浓度的25μg / cc 24小时内导致MCF7细胞的生存能力的增加,但由于deinoxanthin用量的增加和细胞暴露在细胞毒性药物的时候,细胞死亡率增加。根据图10μg / cc的浓度,细胞的生存能力在所有三次对照组相比显著降低。另一方面,随着时间的增加与deinoxanthin治疗癌症的细胞,细胞减少,细胞的生存能力的负对照组72小时后变得更加图1和2。

治疗效果与mitomycin-C和deinoxanthin MCF7的可行性

细胞暴露在细胞毒性药物的浓度最高(20μg / cc mitomycin-c, 30μg / cc deinoxanthin)在最高浓度三次,计算IC₅₀曝光后24小时10.9μg /毫升细菌提取和5.45μg /毫升的药物。48小时后接触IC₅₀9.4μg /毫升细菌提取和4.28μg /毫升的药物。在72小时后接触IC₅₀10.88μg /毫升细菌提取和5.44μg /毫升的药物。deinoxanthin的浓度增加到25μg / cc在24小时内的浓度导致MCF7细胞的生存能力的增加和减少mitomycin-C的影响。然而,由于细菌提取和药物的剂量增加和曝光时间,细胞毒性细胞的死亡率增加。根据图表,从10μg / cc的浓度deinoxanthin mitomycin-c 5μg / cc,细胞的生存能力在所有三次对照组相比显著降低。

伯灵顿和BCL2基因表达中可以看到图3- - - - - -5。

评价细胞的形态学变化

为了调查MCF7细胞的凋亡属性后24小时接触细胞毒性物质,在细胞显微结构变化明显的细胞的细胞形态从轴轮包含小细胞形状和囊泡的存在。也不同于正常状态的细胞如上皮组织生长在一个常规的方式,细胞凋亡后,细胞已经形成一个不规则的分散在一个紧凑和执着的态度。也变化,如细胞收缩、屈曲和胞质损失,膜污染,色素沉着发生在IC₅₀浓度(图6)。

RNA定量分析

这部分是Nanodrop机器的帮助下完成的。230纳米波长与苯酚、乙醇和异丙醇污染,和260海里的波长与核酸污染和280 nm波长与蛋白质污染有关,这意味着分子在相应的波长光学吸收最多。在理想条件下,大量的污染与蛋白质、酚、乙醇应该很低。800 ng /μl提取RNA的浓度在260 nm波长导致表5。

表5:deinoxanthin和mitomycin-C RNA定量测定。

融化曲线

融化曲线开始逐渐增加的温度温度低于产品和继续的熔点温度高于熔点。融化的温度变化曲线的范围可调,产品用在不同的温度下基于乘法部分的长度和guanine-cytosine他们会融化(变性)。融产品变性时,荧光降低。然后,它的测量设备。融化曲线数据将定性结果显示产品的最后cyberrine测试。温度分离分析(融化曲线)的PCR确定只有一个产品是乘以策划-一阶导数曲线(使用荧光强度与温度的曲线;所绘制的软件的机器)。精确的Tm PCR决定的产物。这个值应该是接近预期的Tm的PCR产物。融化的结果曲线以下基因来源于细胞系相比,这项研究中,存在几个融化曲线只有一个快递显示PCR产物的特异性。 It should be noted that the melting point measured for the BAX gene is 14/78 and the melting point for theBCL2基因相当于22.27 (图7- - - - - -9)。

结论

根据研究结果,发现deinoxanthin自然有细胞毒性显著降低MCF7细胞的生存能力,这减少了可行性率完全依赖于剂量和持续时间的暴露在剂量高于30μg /毫升,生存能力降低在暴露在不同的时间不到20%。Mitomycin-C浓度导致了一个剂量的细胞生存能力和减少10和20μg / ml,一起使用这两种物质的观察效果,丝裂霉素单独是相似的。因此,可以看出,两物质的细胞毒性的剂量和持续时间取决于曝光。在检查表达基因,伯灵顿基因诱导的材料,但与预期相反,BCL2并没有减少。的表达的结果BCL2和伯灵顿诱导细胞凋亡的丝裂霉素表明mitotic-c比deinoxanthin和使用更有效的组合与deinoxanthin减少的严重程度由这个基因,诱导细胞凋亡,这很重要,因为它可以创建一个新方法来治疗恶性肿瘤和降低并发症的发生率高和选择性化疗药物的细胞毒性。

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