饲粮中添加亚麻籽和乳酸益生菌对断奶猪细胞免疫的影响

摘要

益生菌和PUFAs都属于众所周知的免疫调节剂。在这项工作中，以益生菌奶酪和亚麻籽(欧米茄-3 PUFAs的来源)的形式应用益生菌乳酸菌对猪细胞介导免疫反应的影响进行了研究。将88头猪分为4组，在断奶前10天开始至断奶后21天期间，分别饲喂:对照组饲喂含葵花籽油的对照奶酪，L组饲喂含葵花籽油的益生菌奶酪，FA组饲喂含整个亚麻籽碎的对照奶酪，LFA组饲喂含整个亚麻籽碎的益生菌奶酪。监测猪的吞噬活性、吞噬细胞代谢活性、淋巴细胞增殖、外周血淋巴细胞亚群比例和空肠Peyer斑块(PP)。应用益生菌和/或亚麻籽的免疫调节作用主要在局部肠道水平上观察。断奶当天空肠PP中分离的淋巴细胞亚群(CD4+、CD8+、CD3+、CD21+)比例无显著差异，但断奶后第7天，L组和FA组的t淋巴细胞比例明显高于LFA组。相比之下，LFA组CD21+的比例明显高于其他各组。断奶后21 d，各组PP淋巴细胞比例基本相同。亚麻籽对淋巴细胞数量和增殖的抑制作用尚未得到证实。添加亚麻籽后，只有吞噬活性受到抑制，而添加乳酸菌则消除了这种作用。

关键字

细胞免疫，亚麻籽，乳酸菌，益生菌奶酪，断奶猪

简介

断奶后综合征(PWS)对养猪户来说是一个严重的健康、养殖和经济问题。断奶时，暴露在固体饮食和其他压力下，可能导致胃肠道(GI)微生物群、形态和生物化学发生巨大变化，使仔猪可能容易受到病原体增殖的影响，从而容易受到所描述的PWS [1］．在2006年欧盟禁止使用促进生长的抗生素后，PWS无法通过这些手段控制，因此一直在寻求其他更安全的替代饲料抗微生物药物。还必须设法改善到达消费者的动物产品的健康和安全，因此安全的天然物质(例如益生菌、多不饱和脂肪酸(PUFAs)、植物提取物等)是该领域关注的中心。

胃肠道原生菌群被认为是人体的自然防御机制之一，由一种复杂的非致病性细菌组成，通常存在于胃肠道(GIT)中。它在形成对病原体的定殖抗性中起着重要作用。刺激这种本地微生物群可以通过控制饮食的组成，或添加不同的天然成分，特别是益生菌来实现[2-5］．使用益生菌来促进肠道健康的建议已经提出了很多年。益生菌在预防和治疗腹泻病以及调节免疫反应方面具有良好的疗效[6-9］．这些有益的影响可以通过促进肠道屏障功能来解释。

尽管在这一领域进行了深入的研究，但到目前为止，益生菌并不是抗生素的有效替代品。因此，有必要寻求提高其有效性的方法和手段。其中一种方法似乎是将益生菌微生物与天然来源的协同作用成分(如某些寡糖、PUFAs、植物成分或微量元素)结合起来，从而加强益生菌微生物的作用方式或扩大益生菌制剂对宿主的有益作用范围[4］．

亚麻籽(FS)富含PUFAs(尤其是omega-3)、木脂素和粘液性水溶性多糖，所有这些都被发现对健康有益[10］．omega-3 PUFAs对乳酸菌黏附的刺激作用，提示其可用于增强益生菌抑制消化道病原体的效果。Kankaanpää等人证实了这些发现。[11在在体外林戈等人的实验[12]在鱼类和我们实验室的猪中[4，13］．PUFAs也是已知的免疫调节剂。更多的研究充分证明了omega-3 PUFAs对免疫系统细胞的抗炎和抗增殖作用，但一些作者也得到了相互矛盾的结果[14-17］．PUFAs在免疫系统细胞中的组成反映了其在生物受体、信号转导和淋巴细胞增殖等方面的潜在作用。食用富含鱼源ω-3多不饱和脂肪酸的饮食，特别是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，已被证明可以减少炎症反应[18]，并改变免疫参数，包括抗体产生和淋巴细胞比例及反应性[19-21]家禽和猪。

本研究旨在探讨以益生菌奶酪和/或亚麻籽为来源的益生菌乳酸菌作为-3 PUFAs和纤维的来源对断奶仔猪细胞介导免疫反应的影响。并研究了接种环状病毒疫苗的效果。

材料与方法

益生菌

益生菌乳杆菌菌株是在科希奇兽医和药学大学微生物学和免疫学系分离的。植物乳杆菌- Biocenol™LP96菌株是从健康哺乳仔猪肠道内容物中选择的。发酵乳杆菌- Biocenol™LF99从成年鸡胃肠道中分离得到。

切达干酪被用作益生菌菌株的载体。益生菌奶酪含有益生菌(每个奶酪含有一个益生菌)，每克奶酪(CFU/g)有1 × 109个菌落形成单位(简称为益生菌奶酪)。将益生菌与2%的发酵剂乳酸乳球菌亚种一起加入芝士乳中。乳酸菌(Lyofast MO 041 SACCO srl，意大利，冷冻干燥)在典型的切达奶酪生产过程中。作为对照的奶酪是类似的切达奶酪，但没有添加益生菌菌株(称为对照奶酪)。

动物、住房、饮食和疫苗接种

斯洛伐克共和国国家兽医和食品管理局批准了第2108/07-221号实验议定书，并以人道的方式处理和牺牲了这些动物。试验选用72头临床健康仔猪(杂交约克夏×皮特兰)。仔猪被安置在典型的室内围栏中，并被分为4组，每组18只，饲料的补充情况如图所示表1．

表1。对照组和试验组分别添加仔猪饲料。

益生菌奶酪和对照奶酪以磨碎的奶酪涂抹在饲料表面的方式饲喂仔猪。同期动物们随意访问水和饲料的混合物对早期断奶仔猪-02 OŠ(CP 187.9通用,我12.8 MJ,纤维38.3通用,赖氨酸11.6通用、蛋氨酸和半胱氨酸6.4通用、苏氨酸7.6通用,色氨酸2.3通用,胆碱1352毫克,11530 IU维生素A、维生素D3 1500 IU维生素E 68.7毫克,维生素B2 7.1毫克,维生素B12 26.4μg,钙7.5 g、P 6.2 g,钠1.9克,铜10毫克、铁163.4毫克,锌125.8毫克、Mn 72.7毫克;Spišské kÅ (mne zmesi，斯洛伐克)。对FA组和LFA组，在饲料混合物中添加含有高含量omega-3 PUFAs的全碎亚麻籽品种弗兰德斯(Agrola Kožuice，捷克共和国);对对照组和L组，在饲料混合物中添加对照油(仅含有omega-6 PUFAs的葵花籽油)，浓度均为10% (表2)．

表2。亚麻籽油，葵花籽油和饲料混合物的脂肪酸组成(百分比)OŠ-02。

仔猪28日龄断奶。第29天，根据制造商的指示，每组6头猪(断奶后第21天宰杀)肌肉注射1ml猪圆环病毒2 (PCV-2)疫苗(Ingelvac®CIRCOFLEX™，Böehringer Ingelheim, Germany)。

生物材料

各组仔猪分别于28日龄断奶当天和断奶后第3、7、21天心内注射T61 (Intervet International B.V. Boxmeer，荷兰，剂量:0.3 ml/kg体重)。立即从牺牲的仔猪中取出胃肠道。

采用Solano-Aguilar等人改进的方法从空肠Peyer ' s patches (PPs)中分离纯化淋巴细胞亚群用于FACS分析。[22］．简单地说，从空肠中取出PPs，在冰冷的PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 6.4 mM Na2HPO4, 1.2 mM KH2PO4, pH 7.3)中洗涤，并置于冰冷的Hanks平衡盐溶液- HBSS (137 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.1 mM Na2HPO4.2H2O, 0.4 mM KH2PO4, 5 mM D-glucose, 4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, pH 7.1 - 7.3，过滤0.22 μm)中。PPs在30 ml HBSS-二硫苏糖醇(HBSS中2 mM二硫苏糖醇(Sigma))中在37°C的水浴中孵育20分钟。然后对样品进行涡流处理，去除介质。PPs在HBSS-EDTA (HBSS中的1 mM EDTA (Lachema，捷克共和国)中重悬，并在37°C的水浴中孵卵20分钟。去除培养培养基后，将PPs浸泡在培养皿中少量HBSS中，用一次性塑料细胞刮板刮粘膜(Costar，美国)。悬浮液通过70 μm尼龙细胞过滤器(BD Falcon, USA)过滤到50 ml锥形管中，HBSS加入到30 ml中。管子在600 xg下离心10分钟。用8 ml 40% Percoll (Sigma) HBSS溶液重悬颗粒(Percoll原液:9份Percoll+1份HBSS)，然后将悬浮液分成两个15 ml的玻璃管，下面铺上等体积的70% Percoll HBSS溶液。试管在1000xg下离心30分钟。淋巴细胞从40-70%层界面收集到新管中。 Cells were washed twice with HBSS by centrifugation at 600 × gm for 5 minutes, then counted after the staining with Türk solution in a Bürker chamber and adjusted at 1.106 cells per 50 μl.

从眶后静脉窦采集外周血，放入含有不同抗凝剂的管中(肝素用于流式细胞术分析，EDTA钠盐用于淋巴细胞增殖试验)。采用改良的红细胞渗透休克法从外周血中分离用于淋巴细胞增殖试验的白细胞[23］．

免疫分析

流式细胞术分析血液或空肠黏膜分离的淋巴细胞亚群如下:50 μl血液或分离的淋巴细胞含有约。1.106细胞用一抗(2 μl CD4a、2 μl CD8a、10 μl CD45、1 μl CD3ε-FITC或1 μl CD21-RPE)在暗室温度下孵育15分钟。孵育后，向未偶联MoAb (CD4、CD8和CD45)的试管中加入800 μl溶出液(8.29 g NH4Cl、1 g KHCO3、0.393 g Na2EDTA / 1L H2O)，向偶联MoAb (CD3ε-FITC和CD21-RPE)的试管中加入1 ml BD FACS溶出液(BD Biosciences, USA)。然后试管在实验室温度下在黑暗中孵育20分钟。试管用0.5 ml PBS (250g 5分钟)冲洗两次。对CD4a、CD8a和CD45分别加入PBS 1:50稀释的二抗25 μl，在实验室温度下暗处孵育15分钟。再用0.5 ml PBS (250g, 5分钟)冲洗两次，每管中加入1%多聚甲醛PBS 200 μl。使用以下单克隆抗体进行分析:小鼠抗猪CD4a MCA 1749 (AbD Serotec，英国)、小鼠抗猪CD8a MCA 1223 (AbD Serotec，英国)、小鼠抗猪CD45 MCA 1222 (AbD Serotec，英国)、小鼠抗猪cd3 - fitc缀合物BB23- 8E6 (SouthernBiotech，美国)和小鼠抗猪CD21 r - phycolythrin BB6-11C9.6 (SouthernBiotech，美国)。二抗选用FITC标记的山羊抗鼠IgG (Sigma, USA)。采用BD FACS DivaTM软件，在BD FACS CantoTM流式细胞仪(Becton Dickinson Biosciences, USA)上进行流式细胞分析。 Fluorescence measurements were carried out using the 488 nm blue laser with FITC filter (530/30 nm) or RPE filter (585/42 nm). Proportions of lymphocytes in PP are expressed in percentage, and those in blood as absolute numbers calculated from total number of CD45 positive leukocytes.

通过Phagotest®(ORPEGEN Pharma，德国)分析单核细胞和中性粒细胞的吞噬活性，通过Bursttest®(ORPEGEN Pharma，德国)分析吞噬细胞的代谢爆发活性。

采用淋巴细胞增殖试验(LPT)测定PCV-2刺激后外周血淋巴细胞的刺激指数(SI)。基于DNA合成过程中5-溴- 2′-脱氧尿苷(BrdU)掺入量的测定，采用比色免疫分析法定量淋巴细胞增殖(细胞增殖ELISA试剂盒，BrdU-比色法，Roche Diagnostics, GmbH, Germany)。简单地说，100 μl 2 × 106细胞/孔的白细胞悬液在RPMI 1640和10%胎牛血清(PAA Laboratories, Inc)中，用50 μl滴度为104.3/ml的PCV-2病毒(PCV-2 Stoon 1010菌株;由Gordon Allan教授提供，农业食品和生物科学研究所，贝尔法斯特)，并在96孔微量滴度测试系统中无病毒，在37°C的潮湿大气中，5% CO2。每个处理设5个重复。培养结束前24小时，加入终浓度为10 μM的BrdU，孵育24小时。去除培养液，DNA变性，细胞固定于孔底后，加入抗brdu -过氧化物酶标记偶联物100 μl, 25℃反应90 min。随后用100 μl底物溶液在室温下孵育30 min，检测免疫复合物。用25 μl 1 M H2SO4停止反应，用ELISA-multiwell读写器(BIO-RAD Laboratories, Inc.， USA)在450nm (OD450)处测量光密度(OD)。

细胞激活率表示为刺激指数(SI)，根据受刺激细胞与未受刺激细胞的吸光度之比计算，公式如下:

统计分析

所有分析均使用GraphPad PRISM 3.00版统计程序进行。Tukey´s和Dunnett´stests(方差分析后，ANOVA)用于识别组间的差异。

结果

局部肠道免疫反应

而在断奶当天，观察到的淋巴细胞亚群(CD4⁺, CD8⁺, CD3⁺和CD21⁺在断奶后第7天，从空肠PP中分离的t淋巴细胞(CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺)，与LFA组比较，L组和FA组均有显著性差异(图1 - 3)．相比之下，CD21的比例⁺在第7天，LFA组显著高于其他各组(图4)．断奶后21 d, L组t淋巴细胞百分率最低，CD21百分率最低⁺PP淋巴细胞最多。

全细胞免疫反应

在整个实验过程中，FA组的吞噬活性最低(表3)．对照组在断奶后第7天和第21天的吞噬活性最高，并伴有较长时间的腹泻。同样，对照组在断奶后第7天和第21天的吞噬细胞代谢爆发活性也高于实验组(数据未显示)。PCV2疫苗接种的猪在PCV2刺激后测量的淋巴细胞SI在所有实验组中均显著高于对照组，但各组间无显著差异(图5)．

表3。益生菌和亚麻籽对外周血吞噬活性的影响(n=6)。

血液中CD21的比例相似⁺和CD8⁺与空肠Peyer斑块分离的淋巴细胞相比，发现了淋巴细胞，但组间差异不明显(数据未显示)。CD21的绝对数目⁺仅在断奶当天受显著影响，L组的仔猪数量低于对照组(p<0.01)。最高的CD8绝对值⁺FA组在断奶当天显著高于L组和LFA组，在断奶后第7天显著高于L组。

从断奶那天起，CD3的绝对数量没有显著差异⁺在断奶后第7天，FA组和LFA组的淋巴细胞数量显著高于L组(p<0.05和p<0.001)和对照组(p<0.05)，且在第21天，FA组的淋巴细胞绝对数量最高(6.9±2.2 × 106/ml)，但L组和LFA组的淋巴细胞数量也显著高于对照组(p<0.05 ~ 0.001)。CD4的绝对值⁺淋巴细胞与CD3的比例相对应⁺淋巴细胞。CD4:CD8比值与CD4的最高数量相关⁺对照组在断奶当天(p<0.01 ~ 0.001)、断奶第21天(p<0.001)、LFA组在断奶第7天(p<0.05 ~ 0.001)均显著高于对照组。

讨论

在集约化生猪生产系统中，断奶过程会给仔猪的生活带来许多环境和物理因素的突然变化。这些突然的变化，特别是饮食变化加上其他压力，会对猪的免疫功能和肠道菌群平衡产生负面影响[24］．

有一种坚定的观点认为，饮食中的PUFAs在一定程度上通过调节免疫系统来显著影响健康。许多动物研究的数据表明，脂肪酸，具体地说，omega-3，具有抗炎和抗增殖作用，但一些研究没有证明或相互矛盾的结果[14，16，25］．在我们的实验中，我们发现在给予亚麻籽的组中，吞噬活性显著降低，但从空肠PP中分离出的淋巴细胞百分比以及血液中淋巴细胞亚群的绝对数量在该组中没有降低。现有证据表明，膳食脂肪酸可以通过以下三种主要分子机制中的一种或多种调节免疫反应:改变膜的组成和功能，改变类二十烷素的产生，改变细胞因子的生物合成[16］．吞噬作用等依赖于膜的功能的改变被认为是添加PUFA引起的膜组成和流动性改变的直接结果[26］．此外，n-3 PUFAs抑制一些细胞因子(IL-1, TNF-α和IFN-γ)，这些细胞因子是PMNL的已知刺激物，可导致吞噬活性降低[27］．本实验中施用亚麻籽后的吞噬活性降低与Thies等的结果一致。[28]，他们在断奶猪的日粮中添加了5%富含n-3 PUFAs的鱼油。然而，在一些研究中，n-3 PUFAs对猪吞噬活性的抑制作用未被注意到[29-31］．更多研究描述了n-3 PUFAs对淋巴细胞增殖和反应性的抑制作用[28，32-34]在我们的实验中没有得到证实，这与Thies等人的结果相似。[28］．相反，我们注意到一些淋巴细胞群有一定程度的活化，特别是CD3⁺和CD8⁺子集。

在亚麻籽组的空肠PP和外周血中观察到这些亚群的比例增加，并伴有CD21的最低百分比⁺断奶后第7天血中无明显变化。与引用的仅使用富含n-3 PUFAs的油的研究相反，我们使用了整个粉碎的亚麻籽，其中还含有其他生物活性化合物，特别是木脂素前体分异梨脂醇二糖苷(SDG)和膳食纤维。先生等人。35他们的研究比较了全亚麻籽和脱脂亚麻籽对淋巴细胞增殖的影响。脱脂亚麻籽或低浓度亚麻籽对淋巴细胞增殖无影响，而高亚麻籽日粮(占日粮的40%)对淋巴细胞增殖有抑制作用。由于许多研究表明，补充不同的抗氧化剂可显著增加淋巴细胞增殖[36-]38］．李及布朗特[39]推测，从亚麻籽壳中分离出来并具有抗氧化活性的SDG也可能具有相同的效果。他们对SDG进行了测试在体外与之前的几项研究相比，未观察到SDG对淋巴细胞增殖的显著影响。在本研究中，亚麻籽组体外检测的淋巴细胞增殖略高于其他组，但这一差异不显著。从临床角度来看，更重要的是淋巴细胞在机体不同腔室中的分布和数量，这些参数不仅在添加亚麻籽后受到显著影响，而且在添加乳酸菌或两者的组合后也会受到显著影响。亚麻籽膳食纤维，特别是其含有多糖的可溶性部分，如上文所述，可以积极影响肠道菌群的组成，有利于有益的乳酸菌或双歧杆菌。大多数益生菌都属于这两种，免疫调节活性也是益生菌的作用方式之一。由于大多数抗原通过黏膜进入人体，黏膜免疫系统在对病原体的防御反应中起着至关重要的作用。肠道菌群是微生物刺激的最大来源，可对健康产生有害和有益的影响，因此它参与了出生后免疫系统的发育以及口服耐受和免疫[40］．有益细菌参与免疫排斥，保护宿主免受病原体的粘附，它们刺激特定抗体的产生，影响肠道相关淋巴组织中淋巴样细胞的分布和数量，确保肠道菌群组成的平衡，并通过它们的活性维持肠道粘膜的完整性[41］．

与亚麻籽组相比，乳酸菌组具有更高的吞噬活性。乳酸菌与亚麻籽联合组猪外周血吞噬活性高于亚麻籽组，低于L组。这些结果与许多其他研究结果一致[42-44］．不同的动物实验结果表明，吞噬细胞功能的增强取决于细菌的种类或品系。能够在胃肠道中存活，能够粘附在肠粘膜上，能够在临界极限下存活的菌株对吞噬细胞的刺激更有效[45，46］．正如我们的微生物学结果所示，我们的乳酸菌菌株具有良好的定殖特性，不仅可以积极影响吞噬作用的激活，而且还可以积极影响它们的总免疫调节作用[13，47］．

从健康的角度来看，关键的时间是断奶后的第一周。在此期间，我们可以观察到断奶生理学和猪免疫反应的最重要变化。它对死亡率有影响，在这段时间死亡率最高。空肠PP和血液中淋巴细胞比例变化最显著的时间是在断奶后第7天。乳酸菌的加入增加了CD3的比例⁺和CD4⁺在局部肠道水平上有子集，但在断奶后第7天的血液中没有。只有在断奶后的第21天，我们才记录到CD3的显著增加⁺血液中的淋巴细胞。与我们的研究相似，我们使用了L. plantarum和L. brevis，还有Perdigon等。[48]表明，L. plantarum能够与Peyer的贴片细胞相互作用，CD4水平升高⁺细胞。有趣的结果出现在联合LFA组，在第7天我们发现CD21的比例最高⁺空肠PP和血液中的淋巴细胞。在PP中，这种增加伴随着t淋巴细胞(CD3)的最低百分比⁺, CD4⁺和CD8⁺)，但血中T细胞数量未减少，与CD3相反⁺和CD4⁺子集在这组中最高。肠道和血液中相同亚群比例的差异可以解释为，根据生物体的需要，免疫细胞在肠道相关淋巴组织和血液之间的重新分配，因为局部存在的免疫系统的所有化合物都与整个生物体[40]有关。益生菌作用对不同淋巴细胞亚群的激活或抑制也是种或株依赖性的，Delcenserie等人的研究详细综述了这一点。[40Herich和Levkut [41］．

结论

综上所述，本研究表明，在断奶仔猪日粮中添加益生菌乳酸菌和/或亚麻籽后，可消除亚麻籽对吞噬细胞的抑制作用，局部肠道有中度至显著的激活作用，细胞免疫应答有显著提高，环状病毒疫苗的效果有所改善。

ACKNOWLEGEMENT

本研究由ERDF资助的研发业务计划项目，由欧盟结构基金ITMS 26220220185 (MediPark)资助。

参考文献

1. Pluske JR等。给猪断奶:概念和结果。瓦赫宁根学术出版社，瓦赫宁根，2003年。432.
2. Jensen BB，等。饲料添加剂对幼猪肠道微生物生态的影响。动物饲料科学1998;7: 45 - 64。
3. Gil A，等。特定膳食成分对肠道菌群的调节。Microb生态健康D补充剂。2000;2: 31 - 39。
4. Bomba A等。微生物与麦芽糊精、低聚果糖和多不饱和脂肪酸结合对益生菌作用的改善。Br J Nutr, 2002;88: 95 - 99。
5. 杨Y，等。饲粮对肉鸡肠道菌群的调节:六种饲料内抗生素替代品的作用综述。世界家禽科学，2009;65: 97 - 114。
6. Reyed MR等。益生菌:防治腹泻病的新策略。应用科学，2007;3: 291 - 299。
7. Sanz Y，等。肠道菌群和益生菌在调节上皮细胞和肠道相关淋巴组织功能中的作用。国际免疫杂志2009;28: 397- 413。
8. 西蒙O等人。益生菌在猪体内作用模式的跨学科研究。动物饲料科学2010;19日:230 - 243。
9. Corcionivoschi N，等。益生菌对动物健康的影响。动物科学与生物技术。2010;43: 35-41。
10. Pauletti总理等。铁苯乙烯(Styrax ferrugineus, Styracaceae)叶片中的木脂素具有抗菌和抗真菌活性。Phytochem。2000;55岁:597 - 601。
11. Kankaanpää PE，等。多不饱和脂肪酸对益生菌生长和粘附的影响。微生物学杂志2001;194: 149 - 153。
12. 林戈E，等。研究了饲料中添加脂肪酸对北极沙鳅(Salvelinus alpinus)粪便中与上皮粘膜相关的乳酸菌的影响。应用微生物学杂志1998;85: 855 - 864。
13. Nemcova R，等。添加亚麻籽油对无菌仔猪肠道植物乳杆菌- Biocenol™LP96与大肠杆菌O8:K88ab:H9相互作用的影响。兽医科学2012;93: 39-41。
14. 黄德明。人体必需脂肪酸与免疫反应的关系，美国生物医学工程研究所，1989;3: 2052 - 2061。
15. 考尔德电脑。N-3多不饱和脂肪酸，炎症和炎症性疾病。Am J clinin Nutr, 2006;83: 1505 - 1519。
16. 脂肪酸作为免疫反应的调节剂。纳特出版社，2006;26: 45 - 73。
17. 杨霞，等。饲粮鱼油对脂多糖刺激鸡脾脏NFκB基因表达及相关信号的影响动物饲料科学2011;20: 206 - 223。
18. 科沃尔博士，等。膳食鱼油可以改变雏鸡的特异性免疫反应和炎症免疫反应。纳特，1997;127: 2039 - 2046。
19. 王玉文，等。饲粮中多不饱和脂肪酸可改变雏鸡淋巴细胞亚群比例和增殖、血清免疫球蛋白G浓度和免疫组织发育。家禽科学2000;79: 1741 - 1748。
20. Kastel R，等。提高n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)含量的油脂对无菌仔猪和常规仔猪某些代谢和免疫参数的影响。捷克动物科学2003;48: 233 - 238。
21. 王明哲，等。n-6:n-3多不饱和脂肪酸配比对扬州鹅血清蛋白和免疫球蛋白的影响。动物饲料科学2012;21日:383 - 391。
22. Solano-Aguilar GI，等。新生猪肠道相关淋巴组织淋巴细胞亚群的分离纯化。中华免疫杂志2000;241: 185 - 99。
23. Karlson GP等。牛外周血中白细胞的分离。1973年生物医学研究;142: 853 - 856。
24. Modesto M，等。双歧杆菌菌株和益生元作为新生断奶猪天然生长促进剂的新策略。生命科学2009;122: 248 - 258。
25. Svedova M，等。亚麻子和鱼油对蛋鸡代谢和免疫指标的影响。兽医学报2008;77: 39-44。
26. 脂质与免疫功能的相互作用II:脂质与免疫的实验和临床研究。《生物化学学报》1995;5: 466 - 478。
27. Calder PC，等。脂肪酸和淋巴细胞功能。Br J Nutr, 2002;87: 31-48。
28. Thies F，等。控制生长猪消耗的脂肪类型会影响血浆和单个核细胞脂肪酸组成以及淋巴细胞和吞噬细胞功能。动物科学1999;77: 137 - 147。
29. Kastel R，等。多不饱和脂肪酸增强益生菌对无菌仔猪免疫系统的影响。伯尔·蒙克·蒂拉尔茨尔·沃琛施，2007;120: 221 - 225。
30. Revajova V，等。增加omega-3不饱和脂肪酸含量的海豹油对无菌仔猪免疫参数的影响阿奇·蒂尔纳，2001;54: 315 - 327。
31. Turek JJ，等。饲粮多不饱和脂肪酸对猪肺免疫细胞的影响。J Leuk Biol, 1994;56: 599 - 604。
32. Fritsche KL等。母系提供的鱼油改变仔猪免疫细胞脂肪酸谱和类二十烷素的产生。脂质。1993;28日:677 - 682。
33. Kelley DS，等。饲粮脂肪种类对家兔免疫状态指标的影响。J纳特，1988;118: 1376 - 1384。
34. Yaqoob P，等。膳食脂质调节对小鼠t细胞源性细胞因子产生的影响。细胞因子。1995;7: 548 - 553。
35. 美国先生等。高亚麻籽日粮对妊娠和F1代sd大鼠脾细胞丝裂原诱导增殖、IL-2产生、细胞亚群和脂肪酸组成的影响食品化学毒物。2003;41: 905 - 915。
36. Alvarado C，等。膳食中补充抗氧化剂可以改善过早衰老小鼠白细胞的功能并减少氧化应激。营养。2006;22日:767 - 777。
37. Lee CY，等。α -生育酚和硒对人淋巴细胞的免疫调节和抗氧化性能。2002年生物微量元素决议;86: 123 - 136。
38. De LFM等。作为免疫功能调节剂的抗氧化剂。Immunol。细胞生物学2000;78: 49-54。
39. Rhee Y，等。亚麻籽木聚糖对在体外丝裂原刺激的T细胞增殖，中华医学杂志，2008;32: 208 - 215。
40. Delcenserie V，等。益生菌在肠道内的免疫调节作用。Mol生物学杂志，2008;10: 37-54。
41. Herich R等人。乳酸菌、益生菌与免疫系统。捷克兽医，2002年;47: 169 - 180。
42. Perdigon G，等。通过喂食含有干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌的发酵乳对小鼠免疫反应的系统增强。Immunolog。1988;63: 17-23。
43. Donnet-Hughes A，等。乳酸菌非特异性防御机制的调节:有效剂量。乳制品科学，1999;82: 863 - 869。
44. Paubert-Braquet M等人。不同干酪乳杆菌菌株发酵的酸奶或牛奶增强小鼠对鼠伤寒沙门菌的抗性。国际免疫杂志，1995;11: 153 - 161。
45. Perdigon G，等。益生菌和免疫状态，在:R.富勒(编辑)。《益生菌》，查普曼和霍尔，伦敦，1992;146 - 176。
46. Schiffrin EJ，等。乳酸菌对人血白细胞的免疫调节:菌株选择的标准。阿姆·J·克林·纳特，1997;66: 15 - 20。
47. Chytilová M，等。亚麻籽油和植物乳杆菌- Biocenol™LP96对感染肠毒素大肠杆菌的猪的抗炎和免疫调节作用。兽医科学2013;95: 103 - 109。
48. Perdigon G，等。乳酸菌激活粘膜免疫系统的可能机制研究。乳制品科学，1999;82: 1108 - 1114。