研究与评论:微生物学与雷竞技苹果下载生物技术杂志
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1北京化工大学生命科学与技术学院，生物过程北京市重点实验室，北京
收到日期:07/08/2017;接受日期:28/09/2017;发表日期:03/10/2017
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油腻的酵母毛孢子菌属cutaneum是一个理想的菌株发酵生产微生物油脂的水解玉米棒子。然而，糠醛，通常产生在木质纤维素水解，显示有害的影响微生物脂质积累，到目前为止还没有很好地标记出其中的机制。采用0.12 M稀H对玉米芯生物质进行水解2所以4并直接用作t . cutaneum发酵培养基。通过在解毒的玉米芯水解物中加入相应比例的糠醛，得到不同的初始糠醛含量。为了探索糠醛介导的微生物脂质积累机制，本实验采用原子力显微镜观察形态特征，采用高效液相色谱法对酵母在糠醛有害过程中的糠醛代谢进行评价。此外，流式细胞仪监测酵母生长和荧光光谱在微生物脂质积累的动力学过程中成像。分析表明，低浓度(≤0.4 g/L)的糠醛可被酵母代谢为2-糠酸，对微生物脂质积累影响不大。糠醛的损害机制可能与破坏细胞膜而阻止酵母细胞生长有关，并提出糠醛的损害机制可能是造成微生物脂质无积累的主要原因t . cutaneum在高浓度糠醛(≥0.6 g/L)情况下。这些结果为开发和设计更有效的生物质转化脂肪发酵生物工艺提供了有价值的信息。
毛孢子菌属cutaneum;微生物脂质积累;糠醛;有害的机制;Biomass-into-lipids生物工艺
共同关心在过去二十年里,一直认为是微生物产生的脂质油质的酵母代替植物油原料生物柴油生产［1，2］．最近，由于低成本和大量的木质纤维素资源，大量的注意力转向了生物质转化为脂类的生物过程。一些关于这个主题的优秀研究论文和/或综述文章已经出现在科学文献中。例如，张和他的同事[3.]利用海带残渣水解物生产脂质Rhodosporidium toruloidesY4和红酵母glutinisAS 2.107，脂质产率和细胞脂质含量达到0.16 g g－1总还原糖(TRS)和37.6%，和0.07克－1TRS和22.2%。刘等。[4]研究了脂质的产生r . glutinis使用未解毒的玉米芯水解物，脂质滴度和细胞脂质含量达到5.5 g L－1和36.4%。高和同事[5)报道毛孢子菌属cutaneumACCC 20271用于玉米芯残渣水解物的脂质发酵，其脂质滴度最高，为12.3 g/L，干细胞重量(DCW)为38.4 g/L。胡等人。[6发现酵母t . cutaneumAS 2.571能同时利用葡萄糖和木糖在玉米秸秆水解液发酵过程中产生脂质，脂质含量和系数分别为39.2%和0.15 g.g .g－1糖,分别。Jin和同事[2综述了利用微生物生产油脂的可行性和面临的挑战木质生物质在生物炼制。因此，各种产油酵母菌株在生物质转化为脂类的生物过程中显示出了生长和微生物脂类生产的潜力，尽管实际应用还需要很长一段时间。
鉴于产油酵母的生物量转化为脂质的生物过程，脂质生产最直接的技术障碍是木质纤维素水解物中存在许多抑制剂，这些抑制剂对酵母细胞生长和细胞内脂质积累具有不利影响。t . cutaneum产油酵母是否能利用各种糖，如葡萄糖、木糖、纤维素二糖、乳糖[6]以及具有相当大脂质积累能力的木质纤维素衍生抑制剂[7］．王与同事[7证明t . cutaneumACCC 20271对呋喃类抑制剂(包括糠醛和4-羟基苯甲醛)相对敏感，但对高滴度的弱酸抑制剂(包括甲酸、乙酸、乙酰丙酸)和酚类化合物(包括香草醛和丁香醛)耐受较强。相反，在2009年报道的对同一群体的研究中，Chen和同事[8发现乙酸、甲酸、糠醛和香草醛是产油酵母发酵的强抑制剂t . cutaneum，乙酰丙酸、5-羟甲基糠醛和羟基苯甲醛是较弱的抑制剂。上述看似矛盾的现象表明，抑制剂不仅对酵母细胞内脂质积累有不利影响t . cutaneum，但它们的抑制机制可能是不同的，并依赖于存在于木质纤维素水解物中的抑制剂类型。普遍关注的是，糠醛对木质纤维素水解物上微生物的生长具有最强的负抑制作用。
因此，充分了解抑制剂对产油酵母脂质积累潜力的影响t . cutaneum本实验以木质纤维素水解物为培养介质，对其进行了研究furfural-mediated机制首次从原子力显微镜(AFM)观察酵母细胞形态特征和高效液相色谱(HPLC)检测糠醛代谢产物的角度对糠醛有害过程进行了研究。此外，采用流式细胞仪(FCM)监测酵母的生长情况，并采用荧光光谱(FS)对微生物脂质积累的动态过程进行成像。
为达到上述目的，采用0.12 M稀酸H对玉米芯生物量进行水解2所以4，然后用Ca(OH)解毒2过度石灰去除水解产物中的抑制剂。将不同用量比例的糠醛添加到原料中，得到不同初始糠醛含量(0.4、0.8和1.2 g/L)解毒的玉米芯水解物。将解毒后的玉米芯水解液直接用作脂类的培养培养基
发酵作为本工作的空白参考。
微生物和化学品
t . cutaneum本研究采用ACCC 2.571(中国农业文化馆藏(ACCC)，北京，中国，http://www.accc.org.cn/)进行微生物产油。菌株常规保存在边缘4ºC的麦芽琼脂培养基上。糠醛(AR, 99%)从上海化学试剂有限公司(中国)获得。所有其他化学品均来自商业来源，并具有最高纯度。
玉米芯酸水解解毒研究
玉米芯是湖南省核农科航天育种研究所(湖南省，中国)赠送的，经碾磨风干为原料。采用Zhou等报道的方法对玉米芯进行辐照预处理。[9］．预处理后的玉米芯在500 mL高压反应器(中国北京)中使用0.12 M稀硫酸在120℃下水解1小时。与固体残渣分离后，玉米芯酸水解物被Ca(OH)脱毒。2过灰20小时[10］．去除CaSO得到脱毒的玉米芯水解液4沉淀，调节pH 6.0。通过高效液相色谱(HPLC)分析解毒玉米芯水解液中糖和呋喃化合物的浓度，以确保在该水解液中没有检测到呋喃抑制剂。该水解液的糖组成为:葡萄糖24.18 g/L，木糖43.40 g/L，阿拉伯糖9.82 g/L。此外，该水解液中醋酸酯的含量为8.6 g/L。
培养基与微生物产油
在不添加营养物质的情况下，以糠醛含量不同的脱毒玉米芯酸水解物(初始pH为6.0)为培养基，进行产脂试验t . cutaneum。通过在解毒的玉米芯水解物中加入相应比例的糠醛，得到不同的初始糠醛含量。在本实验中，玉米芯水解液中糠醛的最终浓度分别为0.4、0.8和1.2 g/L。
酵母先在30ºC、150 rpm的YPD培养基(20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨和10 g/L酵母膏)上培养12 h，然后将10%的培养液接种到新鲜YPD培养基中，30ºC、150 rpm培养24 h，作为种子培养脂质发酵。将10%的种子培养物接种到玉米芯水解液中。培养在250 mL的锥形瓶中进行，其中含有50 mL的水解物，在旋转振动筛中，28ºC和150 rpm，进行设计的时间。在预定的时间间隔内，酵母细胞生长、油脂积累、糖含量和糠醛代谢产物被监测如下。
细胞生长和细胞干重
采用756CRT紫外-可见光谱技术(上海优科有限公司)，在600 nm波长下测定了不同糠醛含量的玉米芯水解物上酵母细胞的生长(OD600)。微生物细胞生物量以干细胞重量(DCW)表示，根据文献中描述的方法收集[6]，然后进行生物质冷冻干燥至恒重。
流式细胞仪(FCM)
流式细胞术(FCM)实验按照Linger和同事报道的方法进行[11］．简单地说，培养48小时后，立即用磷酸盐缓冲溶液(PBS, pH 7.0)将酵母细胞样品稀释至约106个细胞/mL，然后用溶解在二甲基亚砜(DMSO)中的0.1 mg/ mL尼罗红染色15分钟。用PBS (pH=7.0)洗涤两次，并在5000 xg下离心5分钟后，用PBS重新悬浮染色酵母细胞进行流式细胞仪检测。流式细胞仪使用MoFlo XDP流式细胞仪(Beckman Coulter, USA)，配备22 mW离子激光器进行激发(488 nm)，同时使用单个发射通道(610 nm带通滤波器)进行监测。采用Cell Lab Quanta SC软件(Beckman Coulter, USA)进行仪器控制、数据采集和数据分析。对于每个样本，记录20,000个细胞以生成FCM直方图。所有试验均进行三次重复，用Origin 8.0软件(Originlab Co.， Northampton, Mass, USA)分析以平均值表示的最终数据。
原子力显微镜(AFM)
根据文献中报道的程序，用原子力显微镜(AFM)观察酵母细胞的形态特性[12］．AFM图像在环境条件下以ScanAsyst模式记录在尺寸FastScan AFM (Bruker, German)上。扫描频率为1.49 Hz。用标称频率为300 KHz，标称弹簧常数为40 N m的MPP-11100蚀刻硅探针在敲击模式(空气中)同时记录皮肤T.的高度和振幅图像－1。用仪器自带的软件对高度图像进行压平、平面拟合后，通常采用均方根(RMS)来表示表面粗糙度。
培养48小时后，从不同糠醛浓度的玉米芯水解物中提取200µL的细胞悬液。悬液在Eppendorf离心机中以5000 xg离心2 min，取上清液，无菌水洗涤2次，10%甲醛固定4 h，再以5000 xg离心5 min，得到固定细胞颗粒。这个过程重复了两次。最后，将固定细胞球重新悬浮于OD600 = 0.1的无菌水中。将5 μ L的细胞悬浮液放置在新切割的云母基底上，并立即在空气中干燥3分钟。所有AFM测量都在一小时内完成。应特别注意保证样品制备和成像条件的一致性。
荧光显微镜(FS)
使用DM1000荧光显微镜观察脂质堆积(Leica，德国)。用于成像的酵母细胞的制备根据先前报道的方法[13］．简单地说，在接种t=0、48、96、144 h时，用不同糠醛浓度的玉米芯水解物培养0.5 mL的培养液，在室温下5000 xg离心5分钟。去除培养上清后，在1×PBS中洗涤两次细胞球。然后用DMSO溶解的0.1mg/mL尼罗红染色15 min，再用1mL PBS重新悬浮。将5µL的细胞悬浮液置于无菌条件下新鲜清洁的玻片上，对盖玻片上的细胞进行荧光检测。图像采集使用尼康Eclipse 80i显微镜。采用带通滤波技术，在激发波长488 nm和发射波长610 nm处检测到尼罗红荧光。
糖的浓度、乙酸、糠醛和糠酸是由u - 3000高效液相色谱(美国Dionex),配备了示差折光检测器(美国Shodex ri - 101)和紫外检测器(1500年Alltech¯一个¼Alltech Co.A一个¯¼USA),使用一个Aminex hpx - 87 h列(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。高效液相色谱条件为:温度55ºC，紫外波长210 nm，流动相为2.5 mM H2SO4，流速0.5 mL/min。详细流程根据我们之前的工作进行了修改[9，10］．
糠醛浓度对酵母底物代谢及细胞生长的影响t . cutaneum
图1描述了酵母底物代谢和细胞生长t . cutaneum以不同糠醛浓度的玉米芯酸水解产物为研究对象。
图1:不同糠醛浓度的玉米芯酸水解产物中酵母皮T.菌的底物代谢和细胞生长。A:不添加糠醛(0 g/L，作为对照);B:糠醛0.4 g/L;C: 0.8 g/L糠醛;D: 1.2 g/L糠醛;E:酵母细胞生长的时间进程;D:培养144 h时的干细胞重量(DCW)。
如在图1一个，以不添加糠醛的解毒玉米芯水解液为培养基(作为对照)，有趣的是，t . cutaneum可以同时吸收葡萄糖和木糖，甚至木糖的平均消耗速率(0.43 g/L.h)略高于葡萄糖(0.35 g/L.h)。自1998年以来，文献中就报道了酵母中的这种不寻常现象[6，14，15］．木质纤维素水解物中葡萄糖和木糖的共同消耗对于生物质-微生物油生物过程至关重要[16］．而在发酵96 h后，直到培养基中葡萄糖和木糖的残留量减少，阿拉伯糖几乎没有被皮葡萄球菌利用。培养144 h后，T. cueeum几乎耗尽了所有糖。(图1)也表明t . cutaneum同时摄入醋酸盐和糖，而不是依次摄入。这一趋势与其他产油酵母(隐球菌curvatus)，可共同利用醋酸盐和糖，促进微生物从木质纤维素水解物中产生脂质[17］．一些研究还证实，醋酸酯被产油微生物如Motierella isabellina，c . curvatus而且Yarrowia lipolyticaPo1g [18］．
在解毒玉米芯水解液中添加0.4 g/L糠醛的情况下，酵母底物代谢的变化趋势t . cutaneum和对照组相似吗(图1 b)。此外，细胞生长的迟滞期t . cutaneum在水解液中添加或不添加0.4 g/L糠醛时均未观察到糠醛含量(图1 e)。这一结果揭示了酵母t . cutaneum在0.4 g/L糠醛的存在下，对玉米芯半纤维素水解物具有生长能力。与其他微生物的趋势一致(黏黏红酵母，米曲霉而且毛霉菌plumbeus)，以0.56 g/L糠醛对油棕空果串的水解物[18］．然而，王和同事们证明了这一点t . cutaneum对糠醛相对敏感，玉米芯水解物中0.5 g/L的糠醛使酵母细胞生长减少一半[7］．
为了进一步证实这一现象，当水解液中糠醛的浓度增加到0.8 g/L时(图1 c)，可以清楚地观察到糖的摄入量降低了，这导致了酵母细胞生长迟滞期的推迟(图1 e)。在144 h的培养结束时，培养基中残留的木糖约为35%，甚至阿拉伯糖和醋酸盐在最终发酵过程中也没有被利用。当实验中使用1.2 g/L糠醛时，酵母不消耗糖和醋酸盐t . cutaneum观察(图1 d)酵母细胞的生长几乎停止(图1 e)。
发酵144 h后，收集酵母的干细胞重量(DCW)，并根据不同浓度的糠醛情况进行评估。如在(图1)，酵母细胞生物量可达30.2 g/Lt . cutaneum在不含糠醛的解毒玉米水解物上生长。但随着培养培养基中糠醛浓度的增加，酵母细胞生物量呈下降趋势，当糠醛含量为0.4 g/L、0.8 g/L和1.2 g/L时，酵母细胞生物量分别为22.8 g/L、13.6 g/L和1.15 g/L。上述结果与糠醛对酵母底物代谢和细胞生长的影响基本一致t . cutaneum(图1 a-1e)。
糠醛对酵母脂质积累的影响t . cutaneum
测试酵母t . cutaneum对糠醛或糠醛对微生物油脂积累的有害影响相对敏感，t . cutaneum在250毫升的摇瓶中培养，摇瓶中充满不同浓度的糠醛培养培养基。酵母的接种量为10% (v/v)。所有病例均采用流式细胞仪(FCM)监测微生物油的积累情况。正如所料,t . cutaneum在无糠醛和添加0.4 g/L糠醛的解毒玉米芯水解液中生长良好。不添加糠醛的解毒玉米芯水解液在48h以上细胞内脂质积累，在610 nm处的荧光强度分布与添加0.4 g/L糠醛时相似(图2)。的等效细胞密度t . cutaneum荧光数据定量作为培养类型的函数(图2 b)。随着培养基中糠醛浓度的增加，酵母细胞密度降低(图2 b)。这一趋势与酵母细胞生长曲线吻合较好(图1)。结果表明，高浓度的糠醛对酵母有有害影响t . cutaneum增长。
图2:用流式细胞仪研究了糠醛含量对酵母皮t细胞脂质积累的影响。(A)记录了2万个尼罗红染色细胞的脂质堆积的FCM直方图t . cutaneum。在初始接种物(t=0)和培养t=48小时的不同糠醛浓度的玉米芯水解物培养基中，绘制细胞计数作为荧光强度的函数。(B)在接种培养基上生长的细胞荧光成像，脱毒的玉米芯水解物与0.4、0.8和1.2 g/L的糠醛用尼罗红染色显示微生物产油(上)。荧光定量t . cutaneum细胞的脂质积累作为一个功能的培养类型调整到等效的细胞密度(较低)。
在对照组和0.4 g/L糠醛的情况下，通过荧光显微镜和每个细胞定量的尼罗红染色证实，主要的荧光增加，反映脂质积累，发生在培养48小时内。在玉米芯稀酸水解液中培养144 h时荧光强度达到最大值(图3)。对于0.8 g/L和1.2 g/L的糠醛培养基，通过荧光显微镜尼罗红染色和每个细胞定量，即使在少数细胞生长中也未观察到脂质堆积(图3)。
图3:尼罗红荧光显微镜染色每个细胞t . cutaneum在不同浓度糠醛(0、0.4、0.8和1.2 g/L)和培养时间(0、48、96和144 h)下，细胞脂质积累随培养基类型的变化而变化。
油脂发酵过程中的糠醛代谢途径t . cutaneum
为了进一步了解糠醛的降解途径t . cutaneum脂质积累方面，采用高效液相色谱法(HPLC)监测发酵过程中糠醛的代谢性能t . cutaneum在250ml烧瓶反应器中加入不同浓度的糠醛。结果显示在(图4)。以脱毒的玉米芯水解液(不额外添加糠醛)为培养基，发酵24 h和48 h均未观察到2-糠酸、糠醛衍生物。在玉米芯水解液中分别加入糠醛(0.4、0.8、1.2 g/L)，发酵24 h后测定糠酸含量(图4一4 b 4 c)发酵24 h至48 h，糠酸未见进一步减少。这些结果表明t . cutaneum糠醛能被生物降解成糠酸吗?糠酸可能是糠醛的最终代谢产物t . cutaneum［7］．Ran和同事发现，呋喃酸经过六个步骤非常缓慢地转化，最终进入糖酵解或三羧酸(TCA)循环[19］．但糠醛浓度显著影响其生物降解速率。例如，玉米芯水解物培养基中糠醛含量为0.4 g/L，发酵24 h后糠醛含量为0.3 g/L(图4)。这表明糠醛几乎完全被酵母消耗掉了t . cutaneum并在24 h内降解为糠酸。当培养基中存在0.8 g/L的糠醛时，只有25%的原糠醛被降解t . cutaneum在相同的发酵时间48 h(图4 b)。培养基中存在1.2 g/L的糠醛，96.7%的原始糠醛(1.16 g/L)留在培养体系中，因此，约3.3%的糠醛在48 h后被酵母生物降解(图4 c)。
图4:酵母代谢糠醛的产物及途径t . cutaneum不同浓度糠醛对玉米芯酸水解物的生物降解。A:糠醛含量0.4 g/L;B:糠醛含量0.8 g/L;C:糠醛含量1.2 g/L;D:酵母皮T.经三步代谢糠醛的途径。
根据以上实验结果进行t . cutaneum和之前的通路研究t . cutaneum王等人。[7， A. resinae ZN1 by Ran等。[19]， Wierckx et al.[20]的basilensis Cupriavidus HMF14，可以提出T. Cupriavidus Cupriavidus basilensis代谢糠醛的途径为三步，如图所示(图4 d)。糠醛在第一步通过乙醇脱氢酶或醛还原酶转化为相应的糠醇。与糠醛相比，糠醇对皮t细胞生长的抑制作用相对较弱[7］．第二步，用乙醇脱氢酶或醛还原酶将糠醇氧化回糠醛。最后，在氧气条件下，醛氧化酶将糠醛氧化为糠酸，进行第三步转化。呋喃酸的进一步转化可能被阻止t . cutaneum在48 h根据实验结果。为了继续接下来的三个转化步骤，糠醛应保持在非常低的水平(≤0.4克/升)，以使其不影响t . cutaneum生长和代谢。否则，如果培养基中的糠醛浓度仍然保持在较高的水平(≥0.6 g/L)，酵母细胞停止生长，如图所示(图1C及1D)。王等。[7提示基因组中氧化还原酶基因的编码基因决定了酵母降解糠醛的能力及其耐浓度能力t . cutaneum。
糠醛对酵母形态特性的影响t . cutaneum
为了评价酵母的耐受能力t . cutaneum针对糠醛浓度，收集10%甲醛固定酵母细胞的典型AFM图像[12，13］．如(图5A及5A)，高度图像显示酵母t . cutaneum在不含糠醛的解毒玉米芯水解物中生长48 h，呈椭圆形，表面光滑，无细小结构。面板(图5B及5B)为酵母的相应振幅图像。结果表明，虽然酵母体的高度不同，但酵母体的振幅对比几乎相同，说明酵母细胞表面分布均匀。
图5:酵母的典型高度和振幅图像t . cutaneum不同浓度的糠醛(0、0.4、0.8和1.2 g/L)对玉米芯酸水解物的生长。成像大小:7μm (A、B), (C, D) 10μm (E, F) 9.4μm (G, H) 12μm (A, B, C, D, E, F, G, H) 1.8μm。
在培养基体系中加入糠醛后，酵母细胞的形态性质和大小随糠醛浓度的增加而改变。例如，酵母细胞在固定期开始时的长度约为6.84±0.65 μm，而添加0.4、0.8和1.2 g/L糠醛培养48 h后，细胞平均长度分别增加到10.59±0.10 μm、8.98±0.08 μm和11.56±1.67 μm。此外，整个细胞的形状也由椭圆形变为近棒状。
相应的，在0.4 g/L糠醛的情况下，AFM高度和振幅图像显示酵母随着尺寸和形状的变化呈现出一系列的表面形态变化。如(图5 c 5 d)时，酵母表面仍然光滑，但细胞长度由原始的6.84±0.65 μm增加到10.59±0.10 μm，振幅图像的特征，异质性有限(图5c及5d)。它表明t . cutaneum显示出对0.4 g/L糠醛浓度的耐受能力。这一现象已在文献中得到充分证实[5-7］．
当培养基体系中的糠醛浓度增加到0.8甚至1.2 mg/L时，如图所示(图5 e-5h)时，酵母表面出现了一些斑块。这些纳米斑块是从振幅图像压缩(图5 e-5h)，表明部分表面成分硬度增加。酵母细胞表面的异质性特征表明，酵母已死亡。换句话说，就是酵母t . cutaneum在高浓度糠醛(≥0.8 g/L)的培养培养基中无法存活。
此外，如所观察到的(图6)，随着培养基体系中糠醛浓度的增加，酵母表面粗糙度明显增加。地表地壳结构特征单一t . cutaneum本工作还对培养48 h后的酵母进行了研究。(图7 a1-7a4)为高度和振幅图像;(图7 b1-7b4)代表酵母的3D图像;而且(图7 c1-7c4)表示酵母高度和振幅图像的截面分析。这些细微的结构差异表明，高浓度的糠醛会破坏酵母t . cutaneum表面结构导致细胞死亡，因此脂质积累在这些情况下停止。通过荧光显微镜对每个细胞进行尼罗红染色，证实了这一推测的结论t . cutaneum细胞(图3)。
图6:不同糠醛浓度(0、0.4、0.8和1.2 g/L)下玉米芯水解物上酵母生长的平均粗糙度。
图7:用AFM分析了不同糠醛浓度(0、0.4、0.8和1.2 g/L)的玉米芯水解物培养48 h后单个皮t酵母的表面外壳结构特征。a1-a4高度和振幅图像;b1-b4站3 d图像的酵母;C1-c4为酵母高度和振幅图像的截面分析。
在本研究中，糠醛有害机制的脂质积累t . cutaneum对不同糠醛浓度的玉米芯水解液进行了直观考察。t . cutaneum表明糠醛的生物代谢能力在低水平时经过三个步骤，2-糠酸可能是最终的代谢产物。无脂质堆积的糠醛损害机制t . cutaneum在高水平糠醛的木质纤维素水解物中，酵母细胞的生长受到抑制，从而导致细胞膜的破坏。进一步研究其他抑制脂质积聚的抑制剂及其共同作用t . cutaneum我们实验室正在进行生物质转化为微生物油的生物过程。
作者宣称他们之间没有利益冲突。
HY写了手稿;LG负责整个实验的大部分;LW进行AFM实验，绘制AFM图形;YC进行FS图像实验;WS对稿件进行了修改;YL指导项目，构思实验，修改稿件。所有作者均阅读并批准了稿件提交。
感谢国家自然科学基金(NSFC, 31270858;21476016)。
