纳米银颗粒[AgNPs]对小球藻叶绿素A和à ²-胡萝卜素含量[作为两种天然抗氧化剂]的影响

摘要

叶绿素是一种存在于植物、藻类和蓝藻中的绿色色素，这种生物分子被认为是光合作用中最重要的分子，它允许植物从光中吸收能量。另一方面，β-胡萝卜素作为一种具有抗氧化活性的色素，是目前最常用的食品添加剂。除此之外，金属纳米颗粒(NPs)由于其与宏观相相比具有新的和不同的化学、物理和生物特性而引起了越来越多的兴趣，这使得其在各个领域具有吸引力的应用。小球藻(Chlorella vulgaris)是一种单细胞绿藻，具有较高的光合效率，可作为食物来源。在目前的研究中，我们评估了精氨酸包被AgNPs和裸AgNPs对小球藻叶绿素和β-胡萝卜素含量的影响。生物合成的AgNPs分别以100、200和400 μg/mL的浓度使用。微藻也在BG-11培养基中培养。然后对AgNPs进行超声检测，添加到含有小球藻的Erle nmeyer中。叶绿素和β-胡萝卜素含量分别在第0天和第16天进行测定。采用Camiel Eijckelhoff & Jan Dekker方法，在668.2 nm、646.8 nm和450 nm波长进行光吸收测定，得到了较好的结果。 The row results which have gained by spectrophotometry were analyzed by SPSS and Prism5 software. Our result shows that the effects of arginine coated AgNPs in the concentration of 100μg/mL has the most positive effect, and naked AgNPs in the concentration of 400μg/mL, most negative effect on chlorophyll content in chlorella vulgaris. The evaluation of β-carotene also have done by the same method in 450 nm wavelength, analyzed results on β-carotene content also shows the same results.

关键字

叶绿素，Β-Carotene, Agnps，裸，精氨酸包被，小球藻寻常的、纳米技术。

简介

纳米材料和结构的应用通常在1 - 100纳米之间，是纳米和纳米技术的一个新兴领域。纳米材料可为太阳能转换、催化、医学、水处理和农业应用等领域的技术和环境挑战提供解决方案[1］．与宏观尺度的纳米材料相比，纳米材料往往表现出独特的、显著变化的物理、化学和生物特性[2］．AgNPs是关键的多功能应用于现代技术的许多不同领域，包括环境修复[3.]、食品工业[4]，由于它们具有很高的化学反应活性，并能作为电子供体催化各种各样的反应[5]， AgNPs已被应用于改变植物和藻类中的叶绿素和β-胡萝卜素等生物分子含量。银NPs可产生多种活性氧[6]通过脂质过氧化和蛋白质和DNA上的巯基氧化对细胞造成氧化损伤[7］．自相矛盾的是，Ag也是浮游植物的一种有毒微量营养素，也是一些基本细胞功能所必需的[8］．小球藻(Chlorella vulgaris)是一种直径约2 ~ 10 μm的球形微藻[9]，并无鞭毛[10］．这种微藻在叶绿体中含有绿色光合色素叶绿素A和B。活细胞由于其细胞内和细胞内的活动，暴露于自由基。这些自由基由于其配价层中有自由电子，在细胞中引起不必要的反应，可导致细胞死亡，也可能是有机体[11］．为了捕获这种自由基，活细胞需要使用抗氧化化合物[12］．叶绿素(13]和β-胡萝卜素[14]是两种具有高抗氧化活性的重要生物分子，这促使我们将其作为天然的绿色抗氧化剂[14］．

由于我们希望获得最安全、最便宜的所需材料来源，因此绿色合成这种药物将引起人们的高度兴趣。在早期的微藻研究和药物研究中，对其抗氧化性能进行了研究小球藻寻常的1985年对该微藻进行了研究，结果表明该微藻具有抗肿瘤活性。小球藻素是微藻的活性成分，已被证明具有天然抗氧化剂的潜力[15］．

在本研究中，首先微藻样本由设拉子医科大学药学院生物技术系提供。小球藻细胞系在BG-11培养基中培养[6]，装入250ml的Erle nmeyer烧瓶中，室温保存。为了保持介质的均匀性，烧瓶放在电子功率激振器上。下一步，生物合成的AgNPs由设拉子医科大学药学院药剂学系提供，分为两组，第一组为裸AgNPs，第二组为含精氨酸氨基酸包被的AgNPs。为了将AgNPs添加到烧瓶中，NPs需要进行超声处理，因此每个AgNPs的定义测量用实验室秤称重并插入独立的猎鹰。每只猎鹰加5毫升蒸馏水，准备超声和分散。超声处理后，将规定数量的分散AgNPs注入含有微藻的不同烧瓶中。用于研究的定义浓度为:100、200和400 μg/mL。

本研究进行了三次重复，目的是测定微藻悬浮液中叶绿素α和β-胡萝卜素的浓度。在任何重复中，都需要进行读吸附的准备，目前我们使用了Camiel Eijckelhoff和Jan Dekker方法[16]，若要测量叶绿素含量，OD应测量668.2 nm和646.8 nm两个波长[17]，测定β-胡萝卜素含量时，OD应在450nm测量。

材料与方法

叶绿素测量

这种方法被称为丙酮80% [18]，因为微藻细胞悬浮液转移到分光光度法前是在丙酮溶液中解决80%。当样品准备好后，收集细胞悬液3ml，注射到专用隼离心，以2500rpm的转速离心10分钟。下一步，将上清液倒出，将3mL 80%的丙酮加入剩余的细胞悬液中。第二次离心在10分钟内完成，现在上述相的溶液中含有叶绿素。取1 mL悬浮液经进样器转入石英比色皿，再经蒸馏水使最终体积达到2 mL。最后一步设置分光光度仪，分别在668.2 nm和646.8 nm两个波长下，将任意一个样品注入石英比色皿，分别在两个波长下进行测量，并根据公式计算出总叶绿素a。

β -胡萝卜素测定

所采用的方法称为正己烷法[19]，因为这种方法中主要的细胞悬浮液是正己烷。取1 mL微藻细胞悬液，注入离心专用隼，3000转/分离心5 min，甩出上清液，加入3 mL乙醇和正己烷，按2:1的比例加入沉淀细胞悬液，漩涡1 ~ 1.5 min。在第二步，立即同时加入2ml蒸馏水和4ml正己烷，使溶液再次发生摇晃和漩涡。之后离心在5分钟内完成，转速3000转。现在在猎鹰身上可以看到三个独立的相，其中最上面的相是含有类胡萝卜素的化合物，比如β-胡萝卜素。作为测量β-胡萝卜素的最后一步，我们采集了1mL上述相，并注入石英比色皿中。通过分光光度法读取吸光度，可能比色皿中液体的最终体积为2mL，因此我们在比色皿中加入1mL蒸馏水，并将其放在分光光度法的设计位置，经过设定和调整，波长读数为450nm，并保存排结果。

结果与讨论

对行数据进行描述性统计分析，其中已在表1和表2，表明一般Arginine包被AgNPs的积极作用比裸AgNPs更可观。不同浓度AgNPs对小球藻叶绿素含量和β-胡萝卜素含量的影响不同。如表1在100μg/mL精氨酸包被铁纳米颗粒中，AgNPs对小球藻总叶绿素含量的提高作用最大。叶绿素含量计算公式如下:

表1:AgNPs对叶绿素含量的影响(µg/mL)。

表2:AgNPs对ß-胡萝卜素含量(µg/ml)的影响。

对照样品的叶绿素含量与其他浓度处理一样逐渐增加，但经过几天的实验后，叶绿素含量发生了变化。第二次测量是我们的最后一次测量，在第16天，100μg/mL浓度的精氨酸包被AgNPs的叶绿素含量显著[p<0.05]高于对照组图1，在裸AgNPs中图2与精氨酸包被AgNPs相同，100μg/mL浓度下的叶绿素含量显著[p<0.05]与对照样品差异显著。矛盾的是，当精氨酸包被浓度为400 μg/mL时，AgNPs的降低作用最大。裸AgNPs的浓度在400 μg/mL时出现了明显的下降，但下降幅度低于精氨酸包被AgNPs。

我们上面讨论的所有信息都显示在图1．正如它所显示的图13个样品与对照样品的对比表明，AgNPs对叶绿素含量的增加作用最大小球藻寻常的微藻的浓度为100μg/mL。AgNPs浓度为400 μg/ mL时，效果反而下降。

与叶绿素相比，尤其是类胡萝卜素，β-胡萝卜素对铁纳米颗粒[AgNPs]的敏感性较低。所显示的信息表2β-胡萝卜素的敏感性较低。

根据我们的分析计算公式[2]，除经过16 d后400n外，其余各处理β-胡萝卜素的增加均与对照有显著差异[p< 0.05)。结果表明，裸AgNPs具有明显的毒性小球藻寻常的高于精氨酸包被AgNPs的细胞。文中也作了比较图3．

如所示图3除200μg/mL处理中β-胡萝卜素含量增幅最大外，其余样品中β-胡萝卜素含量增幅基本一致。另一方面，裸AgNPs在400μg/mL样品中β-胡萝卜素含量下降幅度最大。

高浓度的金属纳米颗粒会对活细胞产生毒性，我们在当前研究中的发现也证明了这一点。我们已经证明400μg/mL的AgNPs浓度对微藻的毒性很高，可导致微藻细胞死亡[7］．另一方面，裸AgNPs与精氨酸包被[20.］．AgNPs也相当可观。由于裸露的AgNPs更容易释放其价层电子，因此在高浓度的价层电子与介质中其他可用电子快速反应，引起大量不必要和不希望发生的反应，使细胞承受压力，有时死亡。

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