研究和评论:研究的生物雷竞技苹果下载学》杂志上
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ISSN: 2322 - 0066
收到日期:28/12/2016;接受日期:30/01/2017;发表日期:04/02/2017
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铜绿假单胞菌是一种临床上重要的机会性病原体很少导致健康疾病免疫活性的个人。multi-drugresistant菌株的出现在铜绿假单胞菌分离株worlwide增加。氟喹诺酮类原料药作为杀菌药物通过抑制DNA促旋酶和拓扑异构酶IV,从而抑制DNA转录和复制。第二代喹诺酮类有更广泛的临床应用治疗复杂的尿路感染和肾盂肾炎,性传播疾病,选择的肺炎和皮肤感染。第二代喹诺酮的存在resistance-associated改变拓扑异构酶II: gyrA和拓扑异构酶IV: par C基因调查了54铜绿假单胞菌临床分离株与聚合酶链reaction-restriction片段长度多态性分析(PCR-RFLP)。我们的研究显示,gyrA(刺- 83→Ile)突变被发现在51.5%的环丙沙星耐药样本,虽然没有在环丙沙星敏感样品。因此,帕洛阿尔托研究中心(ser - 87→Leu)突变被发现在42.4%的环丙沙星耐药样品和parC突变主要陪同gyrA突变。GyrA(刺- 83→Ile)和帕洛阿尔托研究中心(ser - 87→Leu)突变也出现在相同的值的33.3%氧氟沙星耐药样品。更高层次的喹诺酮耐利率源于目标站点突变可以指导我们利用这些分子为假单胞菌感染的高效管理监控测试。
拓扑异构酶ⅱ(gyrA)、拓扑异构酶IV (parC)铜绿假单胞菌、环丙沙星、氧氟沙星
铜绿假单胞菌在本质上是一种革兰氏阴性细菌广泛包括医院环境(1]。铜绿假单胞菌与医院相关的流行导致传播一个克隆多个病人和站点(2]。医院病原体,特别是感染患者诱发因素如烧伤患者,免疫受损患者主机或代谢紊乱(3]。这是致命的遗传性疾病的主要机会性病原体囊性纤维化(4]。假单胞菌也是常见的病原体微生物角膜炎潜在致盲条件与隐形眼镜使用[雷竞技网页版5,6]。铜绿假单胞菌是主要病原体分离从重症监护病房。导尿管相关尿路感染占40%的院内感染铜绿假单胞菌导管内频繁地发展生物膜表面通过附加(7]。
防止医院或社区获得性感染需要开始广谱的常见策略抗生素抗生素治疗,直到文化数据可用来指导集中管理。然而,过度使用抗生素broadspectrum导致高度耐药菌株的出现铜绿假单胞菌增加死亡率、住院时间和成本的护理(8]。
氟喹诺酮类原料药和氨基糖甙类是两个重要的类假单胞菌感染的抗生素用于治疗。因为良好的抗菌活动,组织扩散,和口服生物利用度,氟喹诺酮类原料药已经广泛使用。氟喹诺酮类原料药是喹诺酮家族的成员,作为杀菌药物通过抑制细菌的DNA促旋酶和拓扑异构酶IV,从而抑制DNA转录和复制。虽然管理耐多药外排泵基因突变也值得关注,主要的耐药机制位于基因编码DNA促旋酶(gyrA)和拓扑异构酶IV (parC) (8- - - - - -10]。
在我们上一篇文章(11),异质性特征与ERIC-PCR的组合方式进行调查,sds - page概要文件。在这项研究中,我们的目的是检测的关键基因突变在上述(gyrA(刺- 83→Ile),帕洛阿尔托研究中心(ser - 87→低浓缩铀),从而表现出更深的洞察力抵抗相关因素。
临床分离株铜绿假单胞菌
共有54铜绿假单胞菌尿液分离收集来自各种临床标本(32%,痰17%,伤口15%,血液13%,呼吸道分泌9%,吸入6%,脓肿2%,气管吸入2%,胸膜液2%,精液2%)住院的人在锡诺普和附近的城市,土耳其(表1)。细菌被孵化Mueller-Hinton琼脂(尼古拉斯)(德国默克公司)37°C 24小时和隔离被确定基于革兰氏染色法和传统生理和生化测试包括增长42°C和46°C,盐耐受性,能动性,生产过氧化氢酶,水解明胶、柠檬酸利用率,Voges-Proskauer测试中,碳水化合物发酵试验、硝酸盐还原、氧化酶,DNase、吲哚、methy-red和王B琼脂测试。参考应变铜绿假单胞菌写明ATCC 27853被用作所有生理和积极控制生化测试,以及分子测试。所有测试都执行根据Bergey系统细菌学手册(12]。这些隔离Kirby-Bauer磁盘扩散法测试的Mueller-Hinton介质根据临床和实验室Standarts研究所(CLSI)推荐第二代喹诺酮类药物的敏感性环丙沙星和氧氟沙星。相应的样本分配给三组之一;耐药,中间或容易氟喹诺酮类原料药。耐药菌株和中间的隔离电阻阻力在总评价百分比概要文件。
| 没有 | 年龄(年) | 性别 | 源 |
|---|---|---|---|
| 1 | 64年 | 米 | 尿液 |
| 2 | 55 | 米 | 血 |
| 3 | 46 | F | 尿液 |
| 4 | 87年 | F | 脓肿 |
| 5 | 56 | 米 | 痰 |
| 6 | 58 | 米 | 气管内吸出 |
| 7 | 71年 | 米 | 伤口 |
| 8 | 74年 | 米 | 尿液 |
| 9 | 73年 | 米 | 尿液 |
| 10 | 52 | 米 | 伤口 |
| 11 | 71年 | F | 呼吸道分泌物 |
| 12 | 71年 | F | 痰 |
| 13 | 85年 | F | 伤口 |
| 14 | 27 | 米 | 胸膜液体 |
| 15 | 85年 | F | 呼吸道分泌物 |
| 16 | 24 | 米 | 精液 |
| 17 | 34 | F | 伤口 |
| 18 | 59 | 米 | 痰 |
| 19 | 60 | 米 | 痰 |
| 20. | 81年 | F | 尿液 |
| 21 | 71年 | F | 痰 |
| 22 | 80年 | 米 | 呼吸道分泌物 |
| 23 | 84年 | F | 呼吸道分泌物 |
| 24 | 81年 | 米 | 尿液 |
| 25 | 68年 | 米 | 血 |
| 26 | 78年 | F | 呼吸道分泌物 |
| 27 | 71年 | F | 痰 |
| 28 | 40 | 米 | 尿液 |
| 29日 | 80年 | F | 血 |
| 30. | 71年 | F | 伤口 |
| 31日 | 67年 | 米 | 痰 |
| 32 | 43 | 米 | 血 |
| 33 | 67年 | F | 尿液 |
| 34 | 67年 | F | 吸入 |
| 35 | 80年 | F | 吸入 |
| 36 | 84年 | F | 吸入 |
| 37 | 0.6 | F | 尿液 |
| 38 | 6 | F | 尿液 |
| 39 | 69年 | F | 伤口 |
| 40 | 2 | F | 尿液 |
| 41 | 1.1 | F | 尿液 |
| 42 | 88年 | 米 | 尿液 |
| 43 | 54 | 米 | 尿液 |
| 44 | 76年 | 米 | 伤口 |
| 45 | 48 | 米 | 血 |
| 46 | 29日 | 米 | 血 |
| 47 | 53 | 米 | 血 |
| 48 | 91年 | 米 | 痰 |
| 49 | 49 | F | 尿液 |
| 50 | 59 | F | 尿液 |
| 51 | 71年 | 米 | 尿液 |
| 52 | 41 | F | 痰 |
| 53 | 74年 | F | 尿液 |
| 54 | 61年 | F | 伤口 |
表1:年龄和性别的分布和源隔离的人住院。
DNA提取
DNA提取了根据Sambrook et al ., (13)做了一些调整。假单胞菌样品被激活与孵化24小时37°C。恢复细菌在3000转离心5分钟和细胞球团矿在500年resuspendedμl TE缓冲(10毫米Tris-HCl pH值8.0,1毫米EDTA)。球被孵化的55°C 30分钟后的50μl SDS(10%)和25μl蛋白酶K(20毫克/毫升)。总DNA是由序列拔牙与575年恢复μl苯酚/氯仿(1:1)。管被倒置,孵化冰面上几分钟,在14000转离心10分钟。上层(500μl卷)被转移到一个新的埃普多夫管和处理50μl乙酸钠(3 M, pH值:5.2)和330μl异丙醇(100%)。管反向和DNA被离心沉淀在14000 rpm 10分钟紧随其后与70% (v / v)乙醇洗涤,干燥,和100年resuspendedμl TE缓冲包含2μl核糖核酸酶。
检测电阻突变
铜绿假单胞菌PAO1染色体,完整的基因组参考序列NC_002516.2 NCBI用于底漆控制和限制酶乳沟网站计算。GyrA和帕洛阿尔托研究中心目标基因序列被放大使用特定引物PCR从公布的数据14]。进行PCR反应体积的50μl包含10 x PCR缓冲,1.5毫米MgCl2200μM deoxynucleotide三磷酸腺苷(核苷酸),50 pmol每个引物2.5 U的Taq DNA聚合酶(美国热科学)和1μl基因组DNA。执行的反应是在Techne tc - 5000热循环(美国加州)35周期,每个组成的变性1分钟94°C,退火为1分钟65°C (gyrA)或55摄氏度(parC)和扩展为1分钟72°C。RFLP分析、PCR产品接受SacII和HinfI酶隔夜gyrA和帕洛阿尔托研究中心分别和分子大小的片段标记(O 'Gene统治者1 kb DNA阶梯,现成的,热科学、美国)琼脂糖凝胶上分离和溴化乙锭染色和可视化凝胶文档系统(英国Cleaver-MicroDOC)。
住院的年龄/性别数据和源隔离的人了(表1)。
阀瓣扩散试验的结果表明,21个样品(38.9%)敏感和33个样品(61.1%)耐药环丙沙星。氧氟沙星,6个样品(11.1%)敏感和抗48个样品(88.9%)。代表PCR-RFLP凝胶图片描绘突变与non-mutant介绍(图1和2)。
图1:GyrA - RFLP。
图2:帕洛阿尔托研究中心- RFLP。
我们发现突变gyrA(刺- 83→Ile) 17(51.5%)的耐环丙沙星样本。没有发现突变环丙沙星敏感的样品。我们发现突变在帕洛阿尔托研究中心(ser - 87→Leu)在14个(42.4%)的耐环丙沙星样本。通常,帕洛阿尔托研究中心突变陪同gyrA突变,只有4隔离帕洛阿尔托研究中心没有gyrA突变的突变耐环丙沙星样本。
我们发现突变gyrA 16(33.3%)的氧氟沙星耐药样品和相同的值还发现了帕洛阿尔托研究中心突变。只有一个样本gyrA和帕洛阿尔托研究中心有一个突变基因氧氟沙星敏感的样品。
GyrA(刺- 83→Ile)突变被报道的主要替代出现在74.7%临床菌株的铜绿假单胞菌和高频率的帕洛阿尔托研究中心(ser - 87→Leu)改变陪同,确认在帕洛阿尔托研究中心发生改变第二步在gyrA菌株已经一个变更,导致更高层次的氟喹诺酮类耐药性的发展(15),发现在1997年首次暗示(16]。Wydmuch等人发现的突变gyrA(刺- 83→Ile)在65.2%的耐环丙沙星临床分离株17]。相同的突变被记录在耐环丙沙星临床分离株高达75.4%在最近的一项研究。另一方面,帕洛阿尔托研究中心(ser - 87→Leu)突变在同一研究中被报道为23.1%,将近一半的我们的价值(18]。Rieuwpassa等人发现gyrA 54.5%的环丙沙星耐药突变样本(19),这几乎反映了在我们的临床样本情况(51.5%)。
铜绿假单胞菌利用III型分泌系统(tts)传递效应毒素(挂式,ExoU、ExoY ExoT)直接进入宿主细胞,导致细胞坏死或快速调制的肌动蛋白细胞骨架,从而使病原体入侵宿主细胞,逃避吞噬作用。ExoU +经常被报告为氟喹诺酮类耐药菌株相比挂式+菌株(20.,21]。此外,exoU +菌株更有可能获得2个或更多的目标站点突变(gyrB gyrA帕洛阿尔托研究中心和削减)比挂式+菌株(两次更容易结合突变gyrA和parC) (21]。类似的结果也在最近的一份研究报告22]。在我们之前的研究11在我们调查的异质性特征铜绿假单胞菌临床分离株ERIC-PCR和sds - page配置文件相结合的方法,一些毒力基因的流行(algD,挂式,lasB、toxA rhlAB)也被调查。虽然我们没有足够的供应评估氟喹诺酮类耐药性的关系,这些效应的毒素,因为我们只研究挂式+但不是exoU +菌株,我们试图画只是一个粗略的估计,一看挂式+压力之间的关系和多个目标站点突变。共有54铜绿假单胞菌菌株,27(50%)菌株被记录为从这些挂式挂式+和+菌株,gyrA和parC突变被发现在一个隔离(3.7%),只有20个样品(74%)没有目标站点的基因突变。相对较低的价值总和突变gyrA和帕洛阿尔托研究中心(3.7%)在我们的挂式+临床分离株是发人深省的条款前瞻性研究设计。
虽然检测gyrA和parC突变并不总是意味着耐氟喹诺酮类原料药,阻力模式增加了这些突变的收购。Terzi等人提出的转录概况调查射流与耐喹诺酮[MexCD-OprJ和MexEF-OprN相关的基因23]。额外的分子机制形成氟喹诺酮类耐药性也可以为未来的研究考虑,因此结合分子的力量有效就业的方法可以利用窄谱抗生素和改善患者的结果。
总之,由于gyrA突变是临床菌株耐氟喹诺酮类原料药的主要机制铜绿假单胞菌在帕洛阿尔托研究中心和额外的突变可能导致更高层次的喹诺酮阻力,这些突变筛查会适合流行病学监测。此外,我们的数据表明,PCR-RFLP分析提供了简单、快速、廉价的检测resistance-associated改变拓扑异构酶基因。
作者宣称没有利益冲突。
致力于教授Ismet柏柏尔人的珍贵记忆。
