小说的影响草药药物Gamijakyakgamchobuja-Tang (KCHO-1)在小鼠的神经性疼痛

文摘

神经性疼痛是由神经系统损伤或疾病引起的。在神经性疼痛,抑制gaba ergic神经元被摧毁,并hyperactivated兴奋性神经元。在这项研究中,我们发现小说草药药物Gamijakyakgamchobuja-tang (KCHO-1)可以有效地减少神经性疼痛。在脊神经结扎(SNL)模型,神经性疼痛的结果利用神经元的损失γ-aminobutyric酸(GABA)和活性氧的生成(ROS)脊髓受伤。SNL治疗小鼠KCHO-1有氧化作用,减少活性氧生成,也诱导gaba ergic神经元的再生组织受伤。这些数据表明,KCHO-1可能是一个潜在的治疗药物治疗神经性疼痛。

关键字

神经性疼痛,Gamijakyakgamchobuja——唐(KCHO-1), GABA, ROS。

介绍

根据国际协会的疼痛、神经性疼痛是慢性疼痛的主要类型之一。它可以由中央神经系统损伤、周围神经损伤、肿瘤或代谢紊乱。神经性疼痛的病人可能会异常性疼痛、痛觉过敏感觉迟钝,感觉异常,射击和灼痛,电动失衡痛、刺痛或麻木(1- - - - - -8]。最近的治疗神经性疼痛包括离子通道阻滞剂如anti-convulsant,抗心律失常药物,和三环类抗抑郁药,因为周围神经的通路脊髓受损(9]。

的表达γ-aminobutyric酸(GABA)已被证明是减少在动物模型的疼痛而健康的动物。GABA,抑制性神经递质,是合成谷氨酸脱羧酶(gad) GAD65 GAD67。gaba ergic抑制性中间神经元位于脊髓背角和发挥重要作用的控制疼痛。此外,损失函数gaba ergic抑制性中间神经元导致增加的疼痛(10- - - - - -12]。

神经损伤后,活性氧(ROS)在痛苦异常的传播起着重要的作用。后背角ROS水平增加脊髓损伤,增加ROS水平下调gaba ergic抑制传播。

因此,兴奋和抑制性传输中断之间的平衡,有利于增强兴奋性传播,导致神经性疼痛(13]。在许多研究中,ROS水平之间的关系,清楚地证实了病理性疼痛。ROS水平增加引起病理性疼痛,ROS拾荒者有anti-hyperalgesic影响在神经性疼痛动物模型,如脊神经结扎(SNL)和慢性收缩损伤(CCI)模型(14,15]。

Gamijakyakgamchobuja-tang (KCHO-1)是一部小说草药药物基于Jakyakgamchobuja-tang和包含提取物姜黄粉末,天麻,Salviae Miltiorrhizae基数,Chaenomelis果实,Atractylodis根茎,远志基数等(16]。Jakyakgamchobuja-tang,由Paeoniae基数阿尔巴和Glycyrrhizae基数e根茎,在传统医学用于治疗腹痛、肌肉痉挛的腿,支气管哮喘,胆绞痛。

Jakyakgamchobuja-tang也被证明是有效的在anti-osteoarthritis [17]。天麻提取物姜黄粉末,Salviae Miltiorrhizae基数,Chaenomelis果实,Atractylodis根茎,和远志基数抗炎和氧化特性添加到Jakyakgamchobuja-tang创建KCHO-1 [18]。

在目前的研究中,我们测试是否小说草药药物KCHO-1可以缓解神经性疼痛SNL所致。与神经性疼痛动物,KCHO-1减少疼痛症状,增加gaba ergic神经元在脊髓损伤恢复。此外,KCHO-1显著降低ROS-mediated gaba ergic神经细胞死亡与生理盐水治疗。这些结果表明,KCHO-1可能提供一种疗效治疗神经性疼痛减少ROS和增强gaba ergic神经元的再生。

方法

诱导小鼠神经性疼痛和药物管理局

成人C57 / BL6小鼠体重25 - 30 g(大约8周的年龄)被安置在一个受控环境和提供标准动物食物和水。动物受到SNL在L5使用修改的协议被金等。19]。简单地说,这些动物麻醉用三溴乙醇。他们的皮肤,连接组织,切割和肌肉暴露16种板和髂嵴。

然后,16种横突和筋膜被使用microscissors和L5脊神经结扎使用线程。手术后,皮肤缝合,动物保持温暖和被允许从麻醉中恢复之前回到笼子里。手术后7天开始,老鼠给KCHO-1(500毫克/公斤)每天口服一次7天。大约3 h KCHO-1管理后,行为进行了测试。

行为测试

冯·弗雷测试

测试的机械触诱发痛,爪子撤军阈值(佩恩表的编制者)的机械刺激hindpaw足底表面用冯·弗雷丝测量。在测试前,每个鼠标放置在一个塑料盒用钢丝网地板,和机械刺激应用hindpaw下鼠标。

鼠标使用灯丝足底表面刺穿。刺激的间隔大约是30 - 60秒。脚撤离被表示为一个百分比的发生率5应用程序的每一个刺激力的函数。佩恩表的编制者定义为相对应的力提取率为50%,由线性插值。

减少的影响,个体之间存在的区别在机械响应性,撤军阈值也归一化值减去(同侧)治疗方面在侧端从相应的价值。

哈格里夫斯测试

后手术,动物发展热痛觉过敏。热疼痛因此衡量哈格里夫斯测试。短暂,老鼠被放置在一个塑料笼的玻璃桌子哈格里夫斯装置。玻璃的温度维持在27°C。每个hindpaw刺激使用热源(IITC模型390镇痛仪,系列8;生命科学产品,弗雷德里克,CA)从足底下表面。

热是申请最多20秒,的时间,直到鼠标撤回了hindpaw被记录。热刺激应用3 - 5倍为每个hindpaw约5分钟的间隔。hindpaw撤军延迟时间大约是15 - 20秒的控制老鼠。

RNA隔离和rt - pcr

脊髓的总RNA提取使用纯链接RNA迷你包(Ambion,卡尔斯巴德,CA)。隔离后的总RNA,互补脱氧核糖核酸合成使用AccuPower RT预混料(Bioneer、大田、韩国)。根据制造商的协议,1μg总RNA和益生元的dT底漆好坏参半,在70°C的环境为5分钟,然后放在冰。

接下来,混合物被转移到一个AccuPower RT预混料管及稀释到适当的反应体积RNase-free蒸馏水。互补脱氧核糖核酸的合成是在42°C 60分钟。当时RTase灭活5分钟在94°C,和反应混合物被储存在4°C。

PCR进行了使用AccuPower PCR预混料(Bioneer)如下:在94°C Pre-denaturation 5分钟;其次是35周期30秒94°C的变性,30秒在每个引物的退火温度退火,和30秒72°C扩展;和最终的扩展在72°C 5分钟,其次是存储在4°C。

描述了用于rt - pcr引物序列(表1)。然后,放大产品隔开电泳1.5%琼脂糖凝胶(ThermoFisher科学、沃尔瑟姆,MA)和溴化乙锭(Amresco,梭伦,哦)。使用GAPDH正常化了。

表1。为rt - pcr引物序列

西方墨点法

脊髓组织与microscissors碎和转移到Pro-Prep解决方案(# 17081,基因内区生物技术,凭借,韩国)。剁碎组织Pro-Prep溶液中均质(Littau-Lucerne Polytron pt - 2100, Kinemetrica AG),瑞士),然后在冰孵化至少30分钟。组织溶解产物离心机在4°C / 13000 rpm 10分钟,上层的收集和储存在-20°C。使用布拉德福德的蛋白浓度测定方法。蛋白溶菌产物(20μg)分离12%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)。经过电泳,凝胶被转移到硝化纤维素膜(绘画纸,通用电气医疗集团生命科学,白金汉郡,英国)。3%牛血清白蛋白的膜被封锁TBS-T洗涤缓冲(10毫米三(pH值7.4),150毫米氯化钠,1%,0.1% Tween-20)至少1 h,然后孵化主要抗体稀释阻挡一夜之间解决方案在4°C。主要的抗体使用如下:anti-GAD65 anti-GAD67, anti-vesicular GABA运输车(VGAT)和anti-GAPDH(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA),和anti-inducible一氧化氮合酶(间接宾语),anti-endothelial NOS(以挪士),anti-neuronal NOS (nNOS) anti-cyclooxygenase (COX2)和anti-α-tubulin (Abcam,剑桥,英国)。第二天,膜与TBS-T洗10分钟/清洗三次。然后,膜与适当的二次抗体2 h和孵化与TBS-T洗了三次。 The membranes were developed using enhanced chemiluminescence (ECL) solution (GE Healthcare). The normalization was performed using anti-GAPDH.

免疫组织化学

小鼠组织和4%多聚甲醛灌注固定。接下来,一夜之间,脊髓被收集在4%多聚甲醛和孵化在4°C。组织被转移到30%蔗糖和孵化至少1天4°C,然后使用冰冻切片嵌入化合物(徕卡FSC 22日,布法罗格罗夫,IL)和存储在-80°C。

组织被切割到10μm厚使用切片机(HM525 ThermoFisher科学),并附加到盐水镀膜玻璃幻灯片,然后干燥过夜。疣状,幻灯片用PBS三次10分钟/洗和孵化屏蔽解决方案(5%正常山羊血清,0.5% Triton-X100 PBS)至少1 h。

然后,幻灯片是孵化主要抗体稀释阻挡一夜之间解决方案在4°C。主要的抗体使用如下:anti-GABA anti-GAD65, anti-GAD67, anti-VGAT。第二天,幻灯片在PBS洗10分钟/清洗三次,孵化与适当的二次抗体稀释在屏蔽解决方案1 h,并与PBS再次清洗三次。

二次抗体使用如下:Alexa488-conjugated anti-mouse免疫球蛋白,Alexa488-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白,Alexa594-conjugated anti-mouse免疫球蛋白,和Alexa594-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白(分子探针/ ThermoFisher科学)。

核染色,幻灯片孵化与赫斯特染色(分子探针/ ThermoFisher科学)稀释在屏蔽解决方案与PBS三次5分钟,洗5分钟。然后幻灯片被安装,和求职应用。图片使用共焦显微镜拍摄(Eclipse TE200,尼康、东京、日本)。

Dihydroethidium(她)染色

dihydroethidium(她)染色、幻灯片和PBS洗10分钟和孵化2μmol她解决方案(分子探针/ ThermoFisher科学)为30分钟37°C。幻灯片在4°C孵化30分钟停止反应,用PBS三次。接下来,幻灯片被沾染了赫斯特标签核,然后安装,覆盖应用。图片在共焦显微镜拍摄(Eclipse TE200)。

统计分析

数据显示为均值±SEM从三个或更多独立的实验。行为测试分析了twoway方差分析(方差分析),和生化实验分析使用统计软件Prism 5.0 t (GraphPad软件公司,拉霍亚,CA)。对所有实验中,P < 0.05被认为是显著的。

结果

这部小说草药药物KCHO-1减少神经性疼痛的症状

研究KCHO-1在神经性疼痛的作用,L5 SNL模型用于控制老鼠(未经处理的、健康的老鼠),saline-treated SNL老鼠,老鼠接受KCHO-1 SNL之后。评估的影响KCHO-1神经性疼痛,冯·弗雷和哈格里夫斯行为测试。•冯•弗雷(机械阈值测试;图1一个)和哈格里夫斯(热刺激试验;图1 b)测试显示,KCHO-1后有效缓解神经性疼痛只是一剂。

KCHO-1促进gaba ergic诱发神经性疼痛模型中神经细胞再生

gaba ergic脊髓神经元细胞耗尽的动物和神经性疼痛。从SNL小鼠脊髓组织收集和gaba ergic评估神经细胞再生。首先,gaba ergic特异性神经元基因表达是评估。

gaba ergic特异性神经元基因GAD65的表达,GAD67, VGAT减少老鼠接受了SNL。与KCHO-1治疗后,这些基因的表达增加(图2一个)。

SNL动物的同样,KCHO-1治疗后,蛋白质GAD65的表达,GAD67 VGAT增加而saline-treated SNL老鼠(图2 b)。

此外,由于GABA ergic神经元细胞灭绝在神经性疼痛,GABA受体表达下调,谷氨酸受体被激活。KCHO-1治疗后,GABA受体基因表达(GABRA1, GABRG2、GABBR1 GABBR2)恢复,和谷氨酸受体表达下调基因表达(NMDAR2B),相比之下,saline-treated老鼠(图2 c)。

GABRB2基因表达也高于saline-treated SNL老鼠,尽管这种差异不显著(图2 c)。

综上所述,这些数据表明KCHO-1诱导GABA ergic神经元的再生和恢复酶的表达与GABA活动(GABA酶合成GAD65 GAD67和GABA运输车VGAT) (图2 d)。因此,得出KCHO-1诱导gaba ergic小鼠神经元与神经性疼痛。

SNL动物的KCHO-1介导氧化还原调控

脊髓神经损伤,包括疼痛,诱发ROS的表达如进气阀打开,以挪士,nNOS, COX2在受伤的组织。SNL之后,ROS增加与正常组织相比,减少了KCHO-1治疗(图3一)。她染色,受伤组织有较高的活性氧,KCHO-1治疗显著降低ROS在脊髓受伤(图3 b)。

讨论

这里,我们报告一个新颖的草药,KCHO-1,有潜力SNL小鼠模型的治疗神经性疼痛。这种新的药物,Gamijakyakgamchobuja-tang (KCHO-1),包含提取姜黄粉末,天麻,Salviae Miltiorrhizae基数,Chaenomelis果实,Atractylodis根茎,远志基数,Paeoniae基数Alba, Glycyrrhizae基数等根茎。这些草药都包括在朝鲜药典。尤其是姜黄粉末用于增加循环,具有抗氧化、抗炎作用。最近,这种草药研究对于缓解疼痛和炎症性肠病(20.- - - - - -22]。天麻,属于兰科家庭,正在积极研究监管的GABA神经递质(23]。Salviae Miltiorrhizae基数也被证明是一个抗氧化24]。因此,本研究进行了评估的能力KCHO-1抑制氧化和缓解神经性疼痛。

神经性疼痛是一种慢性疼痛发生在主要的损伤或功能障碍发生在中枢或周围神经系统(9]。神经性疼痛的原因大部分是棘手的疾病改变患者的心理健康,抑制他们的社会能力,降低他们的生活质量。神经性疼痛被认为是最严重的临床诊断,因为它是不可控的止痛药和抗多种药物。因此,神经性疼痛患者遭受长时间(25,26]。

基因表达在背根神经节直接改变神经元损伤。各种神经性疼痛动物模型包括绑定或削减整个神经或绑定在神经松散(27]。慢性压力损伤模型,这些模型包括部分坐骨神经结扎模型,坐骨神经冻结模型,胫骨和腓肠神经结扎模型(28- - - - - -31日]。其中,我们使用了SNL模式,因为这种方法的优点是有一个相对一致的水平的神经损伤和症状表现19]。

SNL后,动物开发机械触诱发痛和热过敏。这些神经性疼痛的症状可以量化使用·冯·弗雷和哈格里夫斯测试,分别。KCHO-1治疗减少机械触诱发痛和热敏感而SNL动物生理盐水处理。这些结果表明,KCHO-1显著减少神经性疼痛。

GABA(主要的抑制性神经递质)是由羧谷氨酸的迦得GAD65 GAD67。一种机制导致神经性疼痛是一个数量的减少gaba ergic神经元损伤后神经元。在这项研究中,KCHO-1导致gaba ergic神经元的再生,可能有助于减少神经性疼痛。通过rt - pcr、免疫印迹和免疫组织化学,GAD65的表达,GAD67, VGAT增加小鼠接受KCHO-1相比saline-treated SNL的动物。此外,GABA受体的表达(GABRA1, GABRB2, GABRG2、GABBR1 GABBR2) KCHO-1治疗后也增加了。然而,谷氨酸受体的表达NMDAR2B是减少KCHO-1老鼠。这些结果表明,减少gaba ergic SNL引起的神经元被KCHO-1口服治疗逆转。因此,KCHO-1减轻疼痛,促进gaba ergic神经元的再生。

NOS的表达,参与活性氧的生成,增加受伤的组织。由此产生的一氧化氮(NO)在过敏性慢性疼痛中发挥着至关重要的作用,还会增加COX2的表达。因此,ROS增加。检查机制KCHO-1缓解疼痛,ROS和ROS生成相关蛋白的表达以脊髓组织受伤。KCHO-1-treated SNL小鼠减少ROS和低表达的蛋白质参与活性氧生成比SNL动物生理盐水处理。这些数据表明,KCHO-1可能通过诱导活性氧清除机械减轻疼痛。

这项研究表明小说草本药物,KCHO-1,减少ROS生成和增强gaba ergic脊髓神经元的恢复与神经性疼痛的动物,导致疼痛。总之,KCHO-1可能重要的治疗神经性疼痛的活动。

结论

我们的研究表明,KCHO-1神经性疼痛的治疗有效地诱导功能恢复因为KCHO-1有效诱导gaba ergic神经再生和减少ROS的发生。因此,KCHO-1可能揭示了一个新的潜在的神经性疼痛调制的作用。

确认

这个项目已经被韩国联盟支持格兰特(2016 r1c1b1010742)和韩国传统医学研发项目资助的卫生和福利部通过韩国健康产业发展研究所(KHIDI)(批准号:HI11C2142)。

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