胚胎在镉诱导氧化应激的反应发芽豌豆种子

文摘

目前的研究表明氧化应激的一代的证据日益增长的胚胎发芽豌豆(Pisum一l .简历。文雅的省)种子,在暴露于200年μM氯化镉(CdCl2)。因此,我们专注于理解Cd诱导氧化应激,其后果和某些酶的生物学意义和non-enzymatic抗氧化剂作为潜在的选择标准为提高耐氧化应激已经进行了讨论。Cd上的氧化应激指标的影响进行了分析以研究金属毒性之间的关系,氧化应激和排毒反应。结果显示保护胚胎轴生长和新陈代谢对重金属的6天发芽,超出了那么严重的代谢紊乱导致氧化损伤蛋白和观察到显著的结构完整性的破坏细胞膜和细胞内稳态。这可能是相关的超越性在九天抗氧化防御系统,导致胚胎生长的延迟。

关键字

Aadmium、羰基化、胚胎轴,过氧化氢,氧化应激,Pisum一

介绍

近年来,重金属毒性已经成为农业和环境意义的问题由于采矿、过度使用化肥和排放的未经处理的城市,农业和工业残留物(1),导致广泛的土壤污染。种子萌发和随后的胚胎生长植物的重要阶段和周围介质的波动高度敏感,因为发芽种子是第一个界面植物开发周期和环境之间的物质交换(2]。有毒微量污染物已被证明干扰形态学、生理和代谢异常在种子萌发和植物生长3- - - - - -8]。在植物细胞中,他们可以改变细胞内氧化还原平衡对氧化状态(9- - - - - -12)和扰乱prooxidants /抗氧化剂平衡,举足轻重的赞成后者,诱导活性氧(ROS),和直接反应功能细胞大分子和细胞器(13- - - - - -15]。最常见的一种抗氧化蛋白修饰的形成羰基衍生物,氨基酸侧链,主要组氨酸、精氨酸、赖氨酸、脯氨酸,苏氨酸和色氨酸残基,是由活性氧的作用转化为醛或酮组(16]。

工厂使用各种内在和外在的防御策略公差或解毒每当面对压力条件下重金属引起的。很大程度上,植物可分为四组:metal-sensitive物种,耐金属防锈物种,metal-tolerant non-hyperaccumulator物种,和metal-hypertolerant hyper-accumulator物种,各有不同的分子机制来完成他们的阻力/公差金属压力或减少金属毒性的负面后果。采用的策略之一是避免爆发排除压力通过限制金属从土壤吸收或排除,防止进入工厂。这可以通过一些机制如固定化菌根的金属协会金属封存或流露出一种有机化合物络合的根。在下个阶段,如果这些策略失败和重金属进入植物内部组织管理,宽容解毒机制被激活,包括金属封存和区分各种细胞内的隔间(例如,液泡),细胞内由有机酸络合或螯合金属离子,多糖,转移(pc)和金属硫蛋白(MTs)。如果所有这些措施被证明是徒劳的,植物成为了重金属的毒性,抗氧化防御机制的激活是追求(6,11,13,17- - - - - -19]。这些涉及;(我)抗氧化酵素,i.g.超氧化物歧化酶(SOD);EC 1.15.1.1) [20.),谷胱甘肽氧化酵素(GPX;EC 1.11.1.9), guaicol过氧化物酶(G-POX;EC 1.11.1.7)和过氧化氢酶(猫;EC 1.11.1.6), (2) ascorbate-glutathione周期的酶(21)和(3)非酶抗氧化剂分子抗坏血酸盐(AsA)、谷胱甘肽(GSH)、类胡萝卜素、生物碱、维生素e脯氨酸,酚类化合物(黄酮类、单宁酸和木质素)作为自由基拾荒者(22,23]。非生物压力也可能引起多个生物挥发性有机化合物的排放(BVOCs)如萜烯、oxylipins,甲醇,乙醇,甲醛、乙醛,等。尽管许多研究调查植物中重金属毒性,仍有许多不确定性和我们理解的鸿沟ROS生成机制和潜在的战略来提高氧化在植物抗压力。在目前的工作中,各种不利后果的豌豆种子接触镉(Cd)压力进行了讨论。这包括Cd的生理表现在种子的主要器官毒性;细胞内的胚胎轴,解毒。

材料和方法

发芽和镉处理

豌豆(Pisum一l .简历。文雅的省)种子与2%的次氯酸钠surface-sterilized 10分钟,然后发芽在25°C在黑暗中两张滤纸不断滋润同样体积的蒸馏水或200μM CdCl₂。在适当间隔0、3、6和9天,胚胎轴采样化验。

200年μM CdCl₂浓度选择的基础上初步实验证明这个浓度导致50%的抑制生长参数(数据没有显示)。

H₂O₂测量

H₂O₂据Sergiev水平测定et al。24]。提取了0.1% (w / v)三氯乙酸(TCA),其次是离心12000 g×15分钟在4°C。上层清液的吸光度测量在390 nm,后添加10毫米磷酸钾缓冲(pH值7.0)和1 M碘化钾(KI)。

丙二醛测定

样品(约3 g)均质在20毫米Tris-HCl (pH值7.4;1:3、样品鲜重/缓冲体积),离心机在3000 g×20分钟,然后在1毫升derivatized反应混合物包含10.3毫米1-metyl-2-phenylindole(溶于乙腈/甲醇,3:1,v / v),盐酸32%,100毫升水和同等体积的样品或0.6毫米1,1,3,在20毫米3-tetramethoxypropane Tris-HCl (pH值7.4)。40分钟的孵化后45°C,样本在冰上冷却,离心机在15000 g×10分钟和上层清液的吸光度被记录在586海里。MDA水平与丙二醛标准校准曲线,表示为nmol mg-1蛋白质。

羰基和硫醇组织分析

羰基化合物提取在10毫米磷酸钠缓冲区包含1毫米EDTA的pH值7.4,2毫米德勤,0.2% triton x - 100 (v / v) PMSF和1毫米。离心后(27000×g / 20分钟/ 4°C),上层清液用于公司化验。量化的蛋白质羰基化合物进行了根据雷茨尼克先生的经典方法和封隔器(25使用分光光度DNPH方法)。蛋白质的混合物提取和dinitrophenylhydrazine(10毫米,准备在2 N HCl)被允许站在黑暗中在室温下1 h和连续的涡流,然后用冷三氯乙酸沉淀(20%最终浓度)和离心机在20000 g×15分钟。蛋白质颗粒是用20%三氯乙酸,洗净,然后用乙醇/乙酸三次(v / v)。样本然后resuspended 6 M盐酸胍(盐酸溶解在2 N)和孵化40°C与涡流搅拌30分钟。羰基含量测定的吸光度在480 nm(ε= 22000¹厘米¹Levine)作为描述等。26]。protein-carbonyl内容表示为nmol mg-1蛋白质。

总蛋白硫醇是根据Ellman化验(27]。减少5.50 -dithiobis (2-nitrobenzoic酸),(ε= 13600¹厘米¹),之后通过测量吸光度的增加在412海里。

脯氨酸测定

脯氨酸含量测定根据修改后的贝茨方法等。28]。样本均质在研钵和研杵10毫升sulphosalicylic酸(3%,w / v),然后通过绘画纸2滤纸过滤离心机在18 000 g×15分钟。2毫升的上层清液添加到试管,而2毫升冰醋酸和2毫升刚做好的酸性茚三酮溶液(1.25 g茚三酮溶解在30毫升的冰醋酸和20毫升的6米磷酸)被添加。试管被孵化的水浴1小时在100°C,然后冷却至室温。然后4毫升的甲苯被添加到反应和混合在一个旋涡混合器15 - 20秒。试管被允许站至少10分钟,让分离的甲苯和水阶段。甲苯阶段是仔细用移液器吸取到一个玻璃试管和吸光度测量的波长520 nm的分光光度计。脯氨酸的含量标准曲线计算。

酶的活动分析

CAT,过氧化氢酶(EC 1.11.1.6),活动测量根据Aebi [29日),估计通过监测H的吸光度下降₂O₂减少在240 nm(ε= 36×10⁶米¹疲倦¹)。超氧化物歧化酶SOD (EC 1.15.1.1),活动测量根据Mishra Fridovich [30.使用1.88 U mL)¹过氧化氢酶。SOD活性约为490纳米,使用肾上腺素作为标准。抗坏血酸盐过氧化物酶(APX型(EC 1.11.1.11),活动测量根据Nakano和浅田和另外31日)通过监测抗坏血酸盐的吸光度下降290海里(ε= 2.8×不过十的负三次方米¹疲倦¹)。G-POX Guaicol过氧化物酶(EC 1.11.1.7),活动测量根据菲尔丁和大厅(32)通过监控tetraguaiacol吸光度的增加在470 nm(ε= 26.6 M¹疲倦¹)。谷胱甘肽过氧化物酶(GPX (EC 1.11.1.9),活动测量根据Nagalashmi和普拉萨德(33使用1毫米),谷胱甘肽(谷胱甘肽),减少2.5毫米H₂O₂,0.5毫米NADPH和1 U GR(100 - 300单位/毫克蛋白,SİGMA)。NADPH的氧化是评估通过测量吸光度下降在340 nm(ε= 6.22×103米¹疲倦¹Navrot et al。34])。

蛋白质的测定

酶提取的蛋白质浓度由布拉德福德[35]的方法,评估使用牛血清白蛋白作为标准蛋白。

统计分析

实验至少重复两次。提出了数据来自代表性的实验。的平均值±SE比较的意义差异p < 0.05使用方差分析测试之后,t检验学生的分析。

结果与讨论

镉的影响胚胎的生长

豌豆种子的生长发芽期间进行了分析在没有或Cd的压力。图1显示Cd-treated种子胚胎轴的长度,减少与控制。这种延迟增长超过两个折叠之后控制少6和9天。事实上,据报道,在过量重金属暴露下,植物显示生物量减少,抑制根系生长,和形态变化,经常导致植物死亡过度曝光(36]。为了阐明这一点,我们感兴趣的研究越来越多的胚胎细胞金属体内平衡轴,包括监管metal-induced活性氧(ROS)信号通路。

镉胁迫下的氧化压力参数的变化

图2显示水平的提高过氧化氢H₂O₂暴露水平Cd种子,显示生成氧化过程的证据,同意其他报告在许多沉重metal-stressed-species [6,19,37]。这一发现可能导致氧化应激通过令人不安的氧化剂和抗氧化剂之间的平衡在植物细胞内稳态。因此,Cd的机制似乎在于经营,而间接的金属效果,可能诱导氧化应激的产生。因此,这可能导致多个退化的疾病和细胞失调,主要是蛋白质和脂质氧化,氧化DNA攻击,氧化还原平衡和变性的细胞结构和膜,最终导致程序性细胞死亡(PCD)的激活途径。此外,Cd non-redox活跃金属间接造成氧化应激通过多种机制包括谷胱甘肽耗竭,绑定到含巯基的组蛋白,抑制抗氧化的酶或酶诱导ROS-producing NADPH氧化酶类。在这里,我们的研究结果表明,Cd治疗增加了脂质过氧化产物MDA的水平在Cd发芽后9天(图2),这可能导致膜的结构完整性的破坏。类似的结果已经被其他作者在许多重金属报告强调物种(2,6,12,19]。除此之外,蛋白质也被ROS的目标,已确认的修改蛋白质状态。的确,观察蛋白质羰基化合物的增加,伴随显著减少减少SH池在9天(图2);这可能导致硫醇群体的损耗,以及持续的和不可逆的蛋白质损伤,其次是功能丧失。类似的结果被其他作者报道使用不同的重金属12,26,29日,38]。此外,图3显示明显的增强抗氧化酶SOD活动,猫和氧化酵素(APX型、GPX和G-POX)的Cd, 3和6天后,从而提供一个足够高效的抗氧化防御机制对重型metalinduced氧化应激。然而,9天后,不同的抗氧化酵素的活动下降相比各自的控制(图3)。类似的海拔ROS清除抗氧化酶的生产,提供充分有效的抗氧化防御机制对重型metal-induced氧化应激被其他作者报道(6,14,18,19,37,39,40]。

此外,不同的细胞生物分子的生物合成是容忍或中和金属毒性的主要方式。这显然是明显的感应一个巨大的free-proline积累在Cd胚胎治疗,特别是在3和6天,与控制(图4)。事实上,据报道多功能化的脯氨酸帮助植物耐受重金属螯合和antioxidant-related因为它可以展览活动。同样重要的是要指出,控制种子表现出高度的脯氨酸含量,这可能与其他角色扮演的脯氨酸,包括促进胚胎和种子发展(41]。生产在我们的工作,这很明显的Cd,也同意其他报告应对紧张引起的广泛的生物和非生物胁迫因素,例如过度盐度、干旱、太阳紫外辐射增加,重金属和氧化应激。此外,据报道,脯氨酸提高植物的抗重金属的毒性,通过扮演一个金属螯合剂,蛋白质,大分子和细胞器稳定器,以及从变性酶保护器42]。Rastgoo和Alemzadeh41]研究重金属的影响(Cd、Co、铅和Ag)在Gouan (Aeluropus littoralis)报道最多脯氨酸积累发生在Cd的压力。另一方面,脯氨酸积累的抑制发生在9天,与天3和6相比,可能表明,脯氨酸含量增加随着Cd的数量增加超过某个阈值,到一个特定的水平。事实上,据报道,Cd是一个不必要的重金属,可以唤起强烈反应的植物细胞即使只应用于低浓度(43,44]。因此,当应用Cd浓度低于限制,大概6天,豌豆苗似乎宽容和生存。然而,当遇到浓度超过这个极限,豌豆胚胎和显示Cd-toxicity轴变得敏感,这主要是显示超出6天;(我)显著延迟增长(图1),(2)升高ROS-induced细胞和分子赔偿(图2),(3)价值归因抗氧化剂酶和non-enzymatic防御(图3和图4)。因此,脯氨酸的积累和增强抗氧化酶在第一天的Cd污染可以被视为耐重金属指标压力,而紧随其后的是拒绝容忍种植幼苗和Cd毒性增加的9天,这可以解释为防御系统的效率的降低。然而,这种直接联系金属毒性和激活/抑制抗氧化应激反应在分子水平上仍需要进一步调查。

确认

这项工作是由突尼斯高等教育和科学研究部(UR / 11 / ES-32)。

引用

1. Appenroth KJ。“重金属”的定义及其在生物系统中的作用。土壤重金属。2010;19-29。
2. Aebi h .过氧化氢酶体外。方法在Enzymol。1984; 105:121 - 126。
3. Aina R, et al . Thiol-peptide水平和蛋白质组的变化对栽培稻l .镉毒性反应的根源。环境实验。2007;59:381 - 392。
4. Ahsan N, et al。过量铜诱导生理和蛋白质组的改变水稻种子发芽。臭氧层。2007;67:1182 - 1193。
5. Artetxe U, et al .弱光浮萍植物生长更防止PhysiolBiochem毒性引起的锌和Cd。工厂。2002;40:859 - 863。
6. Balestrasse KB, et al Hemeoxygenase活动和氧化应激信号在大豆叶子。植物科学。2006;170:339 - 346。
7. 贝茨LS, et al。快速测定游离脯氨酸对水压力的研究。植物和土壤。1973;39:205 - 208。
8. 布瓦吉吉H, et al .铜过量对H的影响₂O₂积累和过氧化物酶活动bean的根源。ActaBiol挂。2008;59:233 - 245。
9. 布拉德福德毫米。一个快速和敏感的方法定量微克量的蛋白质利用的原则染料绑定。学生物化学肛门。1976;72:248 - 254。
10. 棕色的我,等。类黄酮结构的依赖关系与Cu2 +离子相互作用:对其抗氧化性能的影响。生物化学,1998;330:1173 - 1178。
11. Chaoui A和El Ferjani e .镉和铜在抗氧化能力的影响,木质化和生长素退化豌豆(Pisumsativum l .)幼苗的叶子。CR医学杂志。2005;328:23-31。
12. Ellman GL。组织含巯基的组。拱BiochemBiophys。1959;82:70 - 77。
13. 菲尔丁JL杰和大厅。根过氧化物酶的生化和细胞化学的研究活动Pisumsativum:我;比较dab-peroxidase guaicol过氧化物酶和特别强调细胞壁的性质的活动。J Exp机器人。1978;29:969 - 981。
14. jana公里,et al。铜离子对经济增长的影响,脂质过氧化反应,酚类化合物的积累和本地化扁豆(镜头culinaris医生)。J植物杂志。2010;167:270 - 276。
15. 吉梅内斯,et al .证据的存在ascorbate-glutathione周期在线粒体和过氧化物酶体的豌豆(Pisumsativum l .)树叶。植物杂志。1997;114:275 - 284。
16. 约翰LR, et al。镉和铅对经济增长的影响,在Lemnapolyrrhiza生化参数和吸收。植物土壤环境。2008;6:262 - 270。
17. Karmous我,et al。铜过剩损害动员贮藏蛋白质的大豆子叶。跟踪Elem研究》杂志2011;144:1251 - 1259。
18. Karmous我,et al .蛋白水解活动菜豆子叶下铜压力。PhysiolMolBiol植物。2012;18:337 - 343。
19. Karmous我,et al . ubiquitin-proteasome通路的作用和一些肽酶在种子萌发和铜压力bean子叶。植物PhysiolBiochem。2014;76:77 - 85。
20. Lavid N,等。多酚和过氧化物酶活动的参与重金属积累的表皮腺睡莲(睡莲科)。足底。2001;212:323 - 331。
21. 勒麦尔SD。在氧光合生物glutaredoxin家族。Photosynth杂志2004;79:305 - 318。
22. 莱文RL, et al。羰基氧化改性蛋白质的测定分析。方法Enzymol。1994; 233:346 - 357。
23. 林YF和亚特米高梅。锌和镉胁迫响应的分子机制在植物。细胞摩尔生命科学。1994;69:3187 - 3206。
24. 罗G, et al。位置区分不同类型的SOD的染色方法。ProgBiochemBiophys。1996;23:356 - 359。
25. Maksymiec W和z Krupa茉莉酸和重金属在拟南芥植物Fa相似的生理反应压力?。J植物杂志。2002;159:509 - 515。
26. Mishra惠普和Fridovich即超氧化物阴离子的作用在肾上腺素的自动氧化作用和超氧化物歧化酶的简单分析。生物化学杂志。2002;247:3170 - 3175。
27. Møller IM, et al。氧化修饰在植物细胞组件。为植物杂志。2007;58:459 - 481。
28. Monferran MV, et al . Copper-induced响应的生理参数和抗氧化剂enyzymes水生macrophytePotamogetonpusillus。环境调查。2009;157:2570 - 2576。
29. Nakano Y和浅田和另外k .过氧化氢的回收是ascorbate-specific过氧化物酶在菠菜叶绿体。植物细胞杂志。1981;22:867 - 880。
30. 普拉萨德Nagalakshmi N和MNV。谷胱甘肽循环酶、谷胱甘肽代谢的反应在Scenedesmusbijugatus铜压力。植物科学。2001;160:291 - 299。
31. Navrot N, et al。植物谷胱甘肽氧化酵素功能抗氧化蛋白分布在几个亚细胞的隔间和监管在生物和非生物压力。植物杂志。2006;142:1364 - 1379。
32. Polge C, et al。证据存在的蛋白酶体拟南芥蛋白水解途径;激活对镉的反应。生物化学杂志。2009;284:35412 - 35424。
33. Posmyk MM,等。抗氧化酶活性和酚类化合物含量红球甘蓝幼苗接触铜压力。Ecotoxicol围住Saf。2009; 72:596 - 602。
34. Rastgoo L和Alemzadeh a Gouan生化反应的(Aeluropuslittoralis)重金属压力。ajc。2011;5:375 - 383。
35. Rellan-Alvarez R, et al .应激反应的玉蜀黍镉和汞。土壤植物。2006;279:41-50。
36. 雷茨尼克先生阿兹和封隔器l .蛋白质氧化损伤:羰基测定的分光光度法。方法Enzymol。1994; 233:357 - 363。
37. Rouhier N, et al . Glutaredoxins:角色在铁体内平衡。趋势生物化学科学。2010;35:43-52
38. Schutzendubel A和Polle植物对非生物胁迫的响应:重型metal-induced mycorrhization氧化应激和保护。J Exp机器人。2002;53:1351 - 1365。
39. Sergiev我,et al。精胺的影响,阿特拉津和组合它们之间在一些标记在植物内源性保护系统和压力。Comt的撕裂AcadBulg Sci。1997; 51:121 - 124。
40. Sharma SS和迪茨KJ。金属毒性和细胞氧化还原平衡之间的关系。植物科学的趋势。2009;14:43-50。
41. 谢尔登和孟席斯n的影响铜毒性罗兹草的生长和根系形态(Chlorisgayana Knuth)树脂缓冲溶液的文化。土壤植物。2005;278:341 - 349。
42. Traverso是的,et al . Immunocytocheical定位Pisumsativum硫氧还蛋白f和m non-photosynthetic组织。J Exp机器人。2008;59:1267 - 1277。
43. Yadav SK。植物中重金属毒性:谷胱甘肽的作用和转移概述重金属压力宽容的植物。南误判率J机器人。2010;76:167 - 179。
44. 张HX, et al。铜产生过氧化氢的生产过剩的叶子Elsholtziahaichowensis通过我和symplasticCuZn-superoxide歧化酶。J风险板牙。2010;178:834 - 843。