参考基因的选择比较Flavoids生物合成的l . confusa和金银花

文摘

稳定8候选人参考基因4 l . confusa组织和金银花进行评估通过使用四个算法评估的有效性参考基因的精确的qRTPCR正常化数据使用。8候选人参考基因β-TUB、eIF-4a ACT11, eEF-1α,GAPDH, UBQ10, 18和25个年代,和4组织叶子,绿芽,白色的花蕾和白色的花朵。结果表明,最稳定的基因选择的四个算法为这些组织这些8基因略有不同,但是最不稳定的基因是相同的。ACT11 eIF-4a和β-TUB是三个最稳定的基因选择由geNormβ-TUB是最稳定的根据δCT和Normfinder Bestkeeper GAPDH。18和25个年代两个最不稳定基因根据所有的四个算法。来验证这些选择基因的有效性的四个方法,FSa…¡基因的相对表达水平在这些8组织规范化。类似的表达谱FSa…¡被认为与最稳定的基因选择的四种方法,发现最高的叶子和花朵的l . confusa最低。但他们显然是不同的配置文件时进行规范化的至少两个稳定的基因:18和25个年代。这表明apporatative是不可或缺的参考基因基因化验,这些推荐的四个基因的算法都是可靠的。这是第一次报告的选择候选人参考基因在忍冬物种,这将提供一个更精确的学的生物合成途径基因表达之间flavoids l .混淆和金银花。

关键字

l . confusa,金银花,参考基因,geNorm存在。

介绍

金银花japonicae红花(Jinyinhua),忍冬的干燥花蕾和花,是中医的清算和热解毒,消除风和热量,保护肝脏和阻力的毒药1]。l . confusa相似的药理作用l . japonicae不认为是好jinyinhua的植物来源,因为它有一个低的内容luteoloside [2- - - - - -5]。luteoloside内容这两个物种之间的差异可能会导致不同的酶参与flavoids生物合成途径。比较分析这两个物种之间的基因表达是一个基本的步骤来回答这些问题。

基因表达分析的两种最常用的方法在转录水平微阵列和定量逆转录聚合酶链反应(存在)。存在,其速度优势,灵敏度、重现性和宽动态范围,成为基因表达选择提供同步测量的方法在许多不同的样本数量有限的基因。目前,广泛应用于分子医学、生物科学、微生物学和诊断(6- - - - - -9]。的纯度和完整性RNA,反转录的效率和其他因素可以影响定量结果的准确性(9- - - - - -11),所以有必要规范和调整中存在的数据参考基因。理论上,这些参考基因应该保持不变在不同组织的细胞或组织接受不同的治疗方法。因此,在基本的细胞过程,如基因18 s rRNA,泛素、肌动蛋白、微管蛋白和GAPDH基因常被用作参考。但一些研究表明,绝对没有基因稳定表达;只有相对恒定的某些细胞类型或在一定条件下(12- - - - - -14]。因此,当务之急是为准确估计参考基因的有效性存在数据的标准化。

存在认识到内部控制的重要性,一些统计评估算法是可能的参考基因在一个给定的生物样品。GeNorm,第一个报告软件,计算表达式稳定值平均成对变异的一个特定基因与其他基因(15]。NormFinder估计稳定值根据内部和部落之间的变化16]。BestKeeper决定看家基因的秩使用双向和泊松对候选基因的关联分析以及目标基因(17]。三角洲排名CT基因的稳定使用的标准差均值ΔCt一个基因与其他基因。

基因的表达水平相对于flavoids已经研究了在不同的生物合成金银花的物种(18]。不幸的是,参考基因的识别并没有执行。在这项研究中,8看家基因的适用性作为内部控制进行评估的组织金银花和l . confusa,通常用作参考基因在植物。我们的工作将使随后的两个物种之间的基因表达分析更准确。

材料和方法

材料

四个组织包括叶子,绿芽,白色的花蕾和白色的花朵,分别收集的L。广西confusa生长在新城县,金银花生长在山东省曲阜县2014年在开花季节的开始。样品的叶子,绿芽,白色的花蕾和白色的花朵l . confusa被称为顺序FL, FG,弗兰克-威廉姆斯和FF。相应地,相同的组织金银花被称为会、LG、分别LW和低频。

RNA隔离和第一链互补脱氧核糖核酸的合成

从这些8组织总RNA提取试剂盒方法(美国表达载体)。RNA是对待RNase-free DNase我根据制造商的指令(豆类、日本)。RNA完整性1%琼脂糖凝胶电泳检测,和它的纯度和浓度测量紫外分光光度计(日本岛津公司、日本)。所有RNA样本调整同等浓度,测量并调整再次同质化RNA输入在随后的互补脱氧核糖核酸的合成反应。第一链cDNA被lamv合成第一链cDNA合成装备(Sangon,中国),然后作为模板的PCR稀释8倍。

引物设计和实时PCR

Gene-specific引物设计使用引物最佳时期的5.0软件的扩增子的长度70 - 250 bp和熔化温度57 - 61℃之间。给出了引物序列表1。PCR混合物包含2μL稀释cDNA、10μL 2 x SybrGreen PCR大师混合,200海里每20μL gene-specific底漆在最后一卷。实时PCR进行雇佣LightCycler480软件设置(罗氏公司、瑞士)和ABI SybrGreen PCR反应混合液(2 x)工具包(美国ABI)。所有pcr在以下条件下进行:3分钟为95℃,40周期15 95°和40年代60°C。特异性的扩增子被融化曲线分析(65 - 90℃)后40周期。底漆效率计算基于一个标准曲线生成使用10倍稀释系列5稀释点以一式三份。表达水平的每个示例计算基于三个技术复制。负控制用水代替cDNA包含为每个目标基因化验。

表1:描述的参考基因和FSⅡgene以及存在的引物序列

数据分析

分析基因表达稳定,geNorm NormfinderδCT和BestKeeper (http://www.leonxie.com/ referencegene.php)软件。比较2^△△Ct方法被用来评估每个放大产品的相对数量。

结果

候选人参考基因的变异

所有基因的Ct值测试,范围从16到32在所有的数据集(图1一个),显示他们的表达丰度差异在不同的组织。eEF-1α和eIF-4a是两个最丰富的基因意味着最少的Ct值小于20。相比之下,UBQ10和ACT11是最丰富的Ct值高(29.81和27.49)。Ct值的变化程度也不同:UBQ10和GAPDH相对狭窄的变化范围,和18和25个年代有一个宽的变化范围。此外,Ct为同一基因的变异程度是不同的l . confusa(图1 b)和l .粳稻品种(图1 c)。一般来说,候选基因的变异程度l . confusa比在吗金银花,尽管他们的平均Ct值略有不同的两个物种。在组织的样本l . confusaeEF-1α多样的Ct值,至少与各自的基因金银花eIF-4a。这些变量Ct值相同的基因在不同组织的不同物种加固的有效性的意义本研究旨在确定的参考基因准确定量PCR正常化。

候选基因的选择

我们使用geNorm分析这些8中的基因表达的稳定性测试组织和确定所需的最少数量的参考基因在各个实验中对基因表达的相对数量。在geNorm, M是定义为一个特定基因的平均成对变异与所有其他的候选基因。通常,一个基因M值较低被认为有更稳定的表达。结果表明,这些基因的稳定性在不同样本集不是相同的。所有组织样本的考虑时,M值eIF-4a ACT11最低,与18岁和25 s是最高的(图2一个)。这表明eIF-4a和ACT11是两个最稳定的基因,和18和25个年代是最不稳定的基因测试的8基因。然而,最稳定的基因是β-TUB eEF-1αl . confusa(图2 b)和β-TUB GAPDH金银花(图2 c)。有趣的是,18和25个年代是最不稳定的基因样本的L。confusa和金银花。

候选人参考基因的数量标准化是由成对变异V_{n / n + 1}所有样本的两个连续的标准化因素之间,这反映出额外的基因的影响。结果表明,V成对变异_{n / n + 1}上面的三个数据集是0.15 (图3)。所有的样品一起,成对变异V_{n / n + 1}减少到最小值(0.237)的第四个因素时,表明三个标准化因素是足够在这个数据集。当结合上述结果排名的候选人参考基因(图2一个)、eIF-4a ACT11β-TUB将最合适的参考基因。同样,V的成对变异_{n / n + 1}样品的l . confusa也减少了从0.346 V_2/3到0.245 V的_3/4的最小值V的成对变异_{n / n + 1}在这个数据集,3参考基因图2 b应该足以计算基因相对表达水平的组织吗l . confusa。他们是ACT11,β-TUB eEF-1α。的组织金银花,两两变化V_2/3是0.184 V_3/4是0.214 V_4/5是0.172,这表明4将最优数量的参考基因在基因表达的相对量化。然而,很多的情况下测试基因和基因的拷贝数较低时,不恰当的使用4同时控制基因。之间的平衡精度和实践,2参考基因可能更适合于定量PCR的组织金银花。结合的秩检验基因(图2 c),数据将表明β-TUB和GAPDH是最好的候选基因。

最小化geNorm产生的偏见,也总样本的表达数据分析了其他三种不同的统计方法对候选人看家基因的稳定性。这是δCT, BestKeeper Normfinder。结果表明,不同等级的候选基因来源于不同的算法(表2)。在三个算法,计算出的排名三角洲CT与Genorm最相似。β-TUB是最佳人选δCT和Normfinder参考基因,并通过BestKeeper GAPDH。值得注意的是,18和25个年代是最不稳定的从所有这四个基因选择算法。

表2:候选人的排名参考基因分析了不同的策略

选定的参考基因的有效性

进一步评估参考基因从这四种算法的有效性,我们确定FSⅡ基因的相对表达水平在整个样本,检查其是否与这些选定的参考基因表达模式改变normolization因素分别。FSⅡ基因编码黄酮合酶负责合成luteoloside, discreaminates索引组件金银花从别人在忍冬的物种。结果显示,当eIF-4a的结合,ACT11和β-TUB (geNorm公司选中,图4一)和β-TUB(选择Normfinder和δCT,图4 c由Bestkeeper)或GAPDH(选择,图4 d)就招募了,组织的相对表达谱基因是相似的:最高的叶子,中间的花蕾和花最低的物种。当18和25个年代,最不稳定的参考基因被四个排名方法,应用,FSⅡ基因相对表达模式改变了:它的叶子和味蕾的表达水平金银花(类似图4 f和4 g),这是不可能的木樨草素的总含量和luteoloside叶子是味蕾大约10倍(19,20.]。这些结果暗示这四个方法是可靠的方法来选择看家基因。值得注意的是,FSⅡ的表达式模式计算出的8个样本eIF-4a (图4 b)符合eIF-4a的结合,ACT11和β-TUB (图4一)。因此,eIF-4a也可以作为唯一的参考基因在基因表达水平的组织金银花和l . confusa测量。

讨论

已经被普遍接受,选择合适的参考基因的基因表达分析的成功的先决条件。因此,各种各样的管家基因表达的稳定在给定的实验条件下必须评估。在这项研究中,为了比较flavoids合成金银花和L。confusa, 8候选人参考基因的表达稳定性叶,芽和花在这两个物种估计。表达式的排名稳定在这些由不同的算法计算的样本是略有不同,但FSⅡ的相对表达水平与自己的最稳定的基因在这些组织内部控制是相似的:最低最高的叶子和花朵。这意味着这四种方法都是可靠的参考基因的选择标准化中存在的数据。

一个小的表达水平差异也观察到FSⅡFG和弗兰克-威廉姆斯当多个基因作为内部控制以及单个基因单独使用的时候。当eIF-4a的结合,ACT11和β-TUB被用作参考基因,FSⅡ较高的表达水平比弗兰克-威廉姆斯FG,但是相反的是当β-TUB (图4 c)或GAPDH (图4 d)被单独使用。这是类似于SmDXR [21],它显示了一个表达式模式在组织的丹参不同取决于行动和泛素结合使用或单独作为内部控制。

如果eIF-4a, ACT11β-TUB作为内部控制,FSⅡ表达水平在FF FL的6688倍,但这只是在弗兰克-威廉姆斯FG的1.67倍。见图4FL, FSⅡ表达水平在所有六个情况下是最高的,但是其相对数量在FG和弗兰克-威廉姆斯改变当我们使用不同的参考基因规范化,如图所示数字4,4摄氏度和4 d。这意味着当样本中的表达水平的差异在数量级,单个基因的合成基因表达计算也是可靠的。但当不同之处在于,规范化与多个参考基因变得更加准确。当然,这不是绝对的。见数字4和4 bFSⅡ相同的表达谱估计时单独使用eIF-4αeIF-4a, ACT11和β-TUB组合。同样,在Aquilaria AsC的表达水平没有随GAPDH和组合或单独使用GAPDH[图阿22]。然而,当18和25个年代,最稳定的基因在所有四个算法,分别用作参考基因的差异FSⅡ叶和芽的表达水平金银花可能是没有检测到(图4 e),尽管叶子是12倍的表达水平在LG和47倍,在LW (图4一)。这种情况与早期的研究的结论一致,即标准化策略基于单个基因可能导致错误的表达谱(15,23,24]。

人民币的研究(25),FSⅡ在味蕾的表达水平金银花被证明是低于其他Lonicra物种和比叶高味蕾吗金银花。研究是完全相反的结果发现在这项研究中,即FSⅡ较高的表达水平的味蕾金银花比在l . confusa,和更高的嫩叶相比的金银花。很明显,不同的结论推导是由于不同的标准化中存在的数据。元等人使用18岁的参考基因,由四个排名算法作为第二个最稳定的基因在我们的研究中。元这里给出的结果类似于我们的结果与18岁标准化中存在数据(图4 f)。这加强了参考基因的有效性评估的重要性在他们申请正常化基因表达。

相同的看家基因在不同的物种丰度和稳定性,如在金银花和l . confusa(图1 b和1 c)。成对变异作为基因表达稳定的标准可以减少非特异性的错误源自不同的治疗方法或不同类型细胞(15),因此尤其适合不同物种之间的基因表达的比较分析。此外,平均值会比使用单一更好地反映真实的数字统计,归一化平均最高最稳定的基因的表达会让我们获得更客观和准确的结果。基于上述分析,我们建议geNorm是适当的方法把候选人参考基因中存在数据的归一化时的比较两个物种等金银花和l .混淆。

确认

感谢博士是由于Dev Sooranna编辑这个手稿。这项工作是由美国国家科学基金会支持的中国(批准号31260353),广西自然科学基金(2012号gxnsfda053019)。

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