confusa和L. japonica fl避菌生物合成比较内参基因的选择

摘要

采用4种算法对8个候选内参基因在莴苣和粳稻4个组织中的稳定性进行了评价，以评估内参基因用于qRTPCR数据精确归一化的有效性。8个候选内参基因为β-TUB、eIF-4a、ACT11、eEF-1α、GAPDH、UBQ10、18S和25S, 4个组织为叶、绿芽、白芽和白花。结果表明，这8个基因的4种算法在这些组织中选择的最稳定的基因略有不同，但最不稳定的基因在每种情况下都是相同的。在geNorm算法中，ACT11、eIF-4a和β-TUB是三个最稳定的基因，Delta CT和Normfinder算法中β-TUB最稳定，Bestkeeper算法中GAPDH最稳定，18S和25S是四个算法中最不稳定的两个基因。为验证四种方法所选基因的有效性，将FSâ…′基因在这8种组织中的比较表达量归一化。FSâ…′的表达谱相似，4种方法筛选的基因最稳定，叶片表达量最高，花表达量最低。但当它们被两个最不稳定的基因(18S和25S)归一化时，它们明显不同。说明在基因谱分析中，配位内参基因是必不可少的，四种算法推荐的基因都是可靠的。本文首次报道了忍冬属植物中候选内参基因的选择，这将更精确地比较L. confuse和L. japonica在fl生物合成途径中的基因表达。

关键字

l . confusa，金银花， qRT-PCR，内参基因，geNorm。

简介

忍冬(金银花)，忍冬的干芽和花，是清热解毒、祛风解热、保肝抗毒的中药[1］．l . confusa，其药理作用与l . japonicae金银花中木犀草苷含量低，不被认为是金银花的良好植物来源[2-5］．两种木犀草苷含量的差异很可能是由两种木犀草生物合成途径中酶的差异造成的。比较分析这两个物种之间的基因表达是回答这些问题的基础步骤。

在转录水平上进行基因表达分析最常用的两种方法是微阵列和定量逆转录PCR (qRT-PCR)。qRT-PCR以其速度快、灵敏度高、重现性好、动态范围广等优点，正成为同时测定有限数量基因在多个不同样本中基因表达的首选方法。目前广泛应用于分子医学、生物科学、微生物学和诊断学[6-9］．RNA的纯度和完整性、逆转录效率等因素都会影响定量结果的准确性[9-11]，因此有必要用内参基因对qRT-PCR数据进行归一化和调整。理论上，这些内参基因应该在不同组织的细胞中保持不变，或者当组织受到不同的处理时。因此，18S rRNA、泛素、肌动蛋白、微管蛋白、GAPDH等参与基本细胞过程的基因常被用作内参基因。但几项研究表明，没有基因有绝对稳定的表达;只有在特定的细胞类型或特定的条件下，它才相对恒定[12-14］．因此，估计内参基因的有效性对于qRT-PCR数据的准确归一化是非常必要的。

认识到qRT-PCR内部控制的重要性，开发了一些统计算法来评估给定生物样本中可能的内参基因。GeNorm是第一个报道的软件，它通过一个特定基因与所有其他基因的平均成对变异来计算表达稳定性值[15］．NormFinder根据组内和组间的变化估计稳定性值[16］．BestKeeper通过对所有候选基因和目标基因进行配对和泊松相关分析来确定管家基因的等级[17］．Delta CT使用一个基因与所有其他基因的平均值ΔCt的标准偏差对基因的稳定性进行排名。

在不同的植物中，研究了与生物合成相关的基因的表达水平金银花的物种［18］．不幸的是，没有进行内参基因的鉴定。在本研究中，评价了8个管家基因作为内控的适用性金银花而且l . confusa，这些基因在植物中常被用作内参基因。我们的工作将使后续的两个物种之间的基因表达分析更加准确。

材料与方法

材料

从广西新城县产的confusa中分别采集了叶片、绿色芽、白色芽和白色花4种组织金银花于2014年开花期在山东省曲阜县种植。样品有叶、绿芽、白芽和白花之分l . confusa分别为FL、FG、FW、FF。相应地，同样的组织金银花分别表示为LL、LG、LW和LF。

RNA分离和第一链cDNA合成

用Trizol法(Invitrogen, USA)从这8个组织中提取总RNA。根据制造商说明书(Takara, Japan)，用无rnase - DNase I处理RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，用紫外分光光度计(日本岛津)测定其纯度和浓度。将所有RNA样品调整到等浓度，测量并再次调整，以使后续cDNA合成反应中输入的RNA均质化。用AMV First Strand cDNA Synthesis Kit (Sangon, China)合成First Strand cDNA，稀释8倍作为PCR模板。

引物设计和实时PCR

采用Primer Primer 5.0软件设计基因特异性引物，扩增子长度70 ~ 250 bp，熔解温度57 ~ 61℃。引物序列给出表1．PCR混合物中含有2 μL稀释的cDNA, 10 μL 2X SybrGreen PCR Master Mix，每个基因特异性引物200 nM，最终体积为20 μL。采用LightCycler480软件设置(Roche, Swiss)和ABI SybrGreen PCR Master Mix (2X)试剂盒(ABI, USA)进行实时PCR。所有pcr均在以下条件下进行:95℃3 min, 95℃15 s, 60℃40 s，循环40次。40次循环后，通过熔化曲线分析(65 ~ 90℃)验证扩增子的特异性。引物效率的计算基于在5个稀释点上使用10倍稀释级数生成的标准曲线，这些稀释点以三次为单位进行测量。每个样品的表达量基于3个技术重复计算。以水代替cDNA作为阴性对照，检测每个基因靶标。

表1:内参基因和FSⅡ基因描述，qRT-PCR引物序列描述

数据分析

为了分析基因表达稳定性，geNorm、Normfinder、Delta CT和BestKeeper (http://www.leonxie.com/ referencegene.php)软件。比较级2^△△Ct用该方法对各扩增产物的相对数量进行评价。

结果

候选内参基因变异

所有测试基因的Ct值，在整个数据集中范围为16至32 (图1一个)，表明它们在不同组织中的表达丰度差异很大。eEF-1α和eIF-4a是基因丰度最高的两个基因，平均Ct值最小，小于20。UBQ10和ACT11丰度最小，Ct值分别为29.81和27.49。其Ct值的变异程度也存在差异:UBQ10和GAPDH变异范围较窄，18S和25S变异范围较大。此外，同一基因的Ct变异程度不同l . confusa（图1 b)及粳稻(图1 c)．一般来说，候选基因的变异程度l . confusa比那个大吗金银花，尽管这两个物种的平均Ct值略有不同。在组织样本中l . confusa， eEF-1α的Ct值随各基因的变化最小金银花eIF-4a。同一基因在不同物种不同组织中的这些可变Ct值，加强了本研究的有效性，本研究旨在确定内参基因，为定量PCR的准确规范化提供依据。

候选基因的选择

我们使用geNorm分析了被测基因在这8个组织中的表达稳定性，并确定了在单个实验中相对基因表达量所需的最小内参基因数量。在geNorm中，M被定义为一个特定基因与所有其他候选基因的平均成对变异。通常，M值越低的基因被认为表达越稳定。结果表明，这些基因在不同样本集的稳定性不尽相同。当考虑所有组织样本时，eIF-4a和ACT11的M值最低，18S和25S的M值最高(图2一个)．这说明eIF-4a和ACT11是两个最稳定的基因，18S和25S是8个被测基因中最不稳定的基因。而最稳定的基因是β-TUB和eEF-1αl . confusa（图2 bβ-TUB和GAPDH金银花（图2 c)．有趣的是，18S和25S是confusa和L.confusa样本中最不稳定的基因金银花．

通过成对变异V确定归一化的候选内参基因数量_{n / n + 1}两个序列间的归一化因子均为所有样本，其中反映了附加基因的影响。结果表明，V_{n / n + 1}在所有三个数据集中均高于0.15 (图3)．把所有样本放在一起，成对变化V_{n / n + 1}当包含第四个因子时，下降到最小值(0.237)，表明在该数据集中三个归一化因子是足够的。结合上述候选内参基因排序结果(图2一个)、eIF-4a、ACT11和β-TUB为最合适的内参基因。类似地，V的成对变化_{n / n + 1}在样本中l . confusa也从0.346的V下降_2／3到0.245 V_3／4为V的成对变化量的最小值_{n / n + 1}在这个数据集中，3个最重要的内参基因图2 b应该足以计算基因在组织中的相对表达水平l . confusa．它们是ACT11、β-TUB和eEF-1α。对于人体组织金银花，即成对变化V_2／3等于0.184,V_3／4是0.214,V_4/5为0.172，说明在基因表达的相对量化中，4是最优的内参基因数量。但是，在被测基因较多、基因拷贝数较低的情况下，同时使用4个对照基因是不合适的。在准确性和实用性的平衡下，2个内参基因更适合用于组织定量PCR金银花．结合被测基因的排序(图2 c)，这些数据表明β-TUB和GAPDH是最好的候选基因。

为了尽量减少geNorm产生的偏差，我们还采用其他三种不同的统计方法对总样本的表达数据进行分析，对候选管家基因的稳定性进行排序。它们是Delta CT, BestKeeper和Normfinder。结果表明，从不同的算法中得到的候选基因的等级略有不同(表2)．在这三种算法中，Delta CT计算出的秩与Genorm最相似。β-TUB是Delta CT和Normfinder的最佳内参基因，GAPDH是BestKeeper的最佳内参基因。值得注意的是，18S和25S是四种算法中最不稳定的基因。

表2:不同策略分析的候选内参基因排序

所选内参基因的有效性

为了进一步评价这四种算法的内参基因的有效性，我们测定了FSⅡ基因在整个样本中的相对表达量，并分别以这些选择的内参基因作为归一化因子来检验其表达模式是否发生变化。FSⅡ基因编码黄酮合酶，该酶负责木犀草苷的合成，木犀草苷是一种离散的指数成分金银花忍冬属的其他物种。结果表明，当eIF-4a、ACT11和β-TUB (geNorm选择)结合时，图4一)和β-TUB(由Normfinder和Delta CT选择，图4 c)或GAPDH(由Bestkeeper、图4 d)，该基因在两种植物组织中的相对表达谱是相似的:叶中最高，芽中中等，花中最低。当使用4种方法中最不稳定的内参基因18S和25S时，FSⅡ基因的相对表达模式发生改变:其在叶片和芽中的表达量金银花是类似的(图4 f而且4 g)，这是不太可能的，因为叶片中木犀草素和木犀草苷的总含量大约是芽中的10倍[19，20.］．这些结果表明，所采用的四种方法是选择管家基因的可靠方法。值得注意的是，在eIF-4a计算的8个样本中FSⅡ的表达模式(图4 b)与eIF-4a、ACT11和β-TUB的组合一致(图4一)．因此，eIF-4a也可作为肿瘤组织中基因表达水平的唯一参考基因金银花而且l . confusa测量。

讨论

人们普遍认为选择合适的内参基因是基因表达谱成功的前提。因此，在给定的实验条件下，必须评估各种管家基因表达的稳定性。在本研究中，为了比较氟乙烯的合成金银花对8个候选内参基因在两种植物叶、芽和花中的表达稳定性进行了评价。不同算法计算的这些样品中FSⅡ的表达稳定性等级略有不同，但在这些具有自身最稳定基因作为内控的组织中，FSⅡ的相对表达水平相似:叶片最高，花最低。这说明四种方法均可用于选择内参基因进行qRT-PCR数据归一化。

在FG和FW中，当使用多个基因作为内控时，FSⅡ的表达水平与单独使用单个基因时也有微小差异。以eIF-4a、ACT11和β-TUB组合为内参基因时，FG中FSⅡ的表达量高于FW，而β-TUB (图4 c)或GAPDH (图4 d)单独使用。这类似于SmDXR [21]，显示出在丹参组织中，ACT和泛素联合使用或单独作为内控时，其表达模式略有不同。

如果使用eIF-4a、ACT11和β-TUB作为内控，FL中的FSⅡ表达量是FF的6688倍，而FG中仅为FW的1.67倍。如在图4， FSⅡ在FL中的表达量在所有六种情况下都是最高的，但当我们使用不同的内参基因归一化时，其在FG和FW中的相对表达量发生了变化，如图数字4，4摄氏度而且4 d．这意味着，当样本中表达水平的差异达到数量级时，用单个基因计算得到的基因表达量也是可靠的。但当差异很小时，多个内参基因的归一化变得更加准确。当然，这不是绝对的。如在数字4而且4 b单独使用eIF-4α和eIF-4a、ACT11和β-TUB联合使用时，FSⅡ的表达谱相同。同样，在沉香中，AsC的表达水平不随GAPDH和TUA组合或单独GAPDH而变化[22］．而以4种算法中最不稳定的基因18S和25s分别作为内参基因时，叶片和芽中FSⅡ表达量的差异金银花无法检测到(图4 e)，但其在叶片中的表达量是LG的12倍，LW的47倍(图4一)．这种情况与早期研究的结论是一致的，即基于单个基因的标准化策略可能会导致错误的表达谱[15，23，24］．

25]， FSⅡ在芽中的表达量金银花的含量低于其他忍冬属植物，芽的含量高于叶的含量金银花．该研究的结果与本研究的结果完全相反，FSⅡ在花蕾中的表达水平较高金银花比在l . confusa叶子的含量比花蕾的含量高金银花．显然，不同的结论是由于qRT-PCR数据的归一化不同所致。Yuan等人使用18S作为内参基因，四种算法都将其列为我们研究中第二不稳定的基因。Yuan的结果与我们用18S归一化qRT-PCR数据的结果相似(图4 f)．这就强调了在内参基因应用于基因表达规范化之前，对其有效性进行评估的重要性。

相同的管家基因在不同的物种中在丰度和稳定性上有所不同，例如在金银花而且l . confusa（图1 b而且1 c)．以成对变异作为基因表达稳定性的判据，可以最大限度地减少因不同处理或不同类型细胞而产生的非特异性误差[15]，因此特别适用于不同物种间基因表达分析的比较。此外，在统计中使用平均值比使用单个数字更能反映真实情况，用最稳定基因的平均表达量进行归一化会使我们得到更客观准确的结果。基于以上分析，我们认为在比较两个物种时，geNorm是对qRT-PCR数据规范化的候选内参基因排序的合适方法，如金银花和L.混淆。

确认

感谢Dev Sooranna博士编辑这篇手稿。国家自然科学基金项目(No. 31260353)和广西自然科学基金项目(No. 2012GXNSFDA053019)资助。

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