在巨噬细胞中，雌激素模拟上调SOCS3的表达并不是通过雌激素受体(ER)信号通路

摘要

免疫炎症假说是目前动脉粥样硬化机制研究的热点，而SOCS (Suppresor of Cytokine Sigaling)是细胞因子及其免疫炎症信号传导的关键抑制剂。近期研究表明SOCS3可能是潜在的动脉粥样硬化保护因子，而雌激素对动脉粥样硬化具有保护作用。在这篇论文中，我们证明了雌激素可以以剂量依赖的方式增加巨噬细胞中SOCS3的表达。我们进一步证明雌激素上调SOCS3表达并不是通过雌激素抑制剂- ici182780检测到的传统ER(雌激素受体)途径。我们的研究结果更详细地说明了雌激素诱导的动脉粥样硬化保护机制。

关键字

动脉粥样硬化，雌激素，SOCS3，巨噬细胞，免疫炎症

简介

随着人们生活方式的改变和社会环境因素的变化，心血管疾病(CVD)的发病率逐年增加，尤其是冠心病(CHD) [1］．动脉粥样硬化是导致心血管疾病最常见的病理过程之一。它的特征是在动脉中形成动脉粥样硬化斑块，由坏死的核心、钙化区域、累积的修饰脂质和各种细胞组成[2］．动脉粥样硬化的发病机制有脂质浸润、血栓形成、平滑肌细胞克隆、内皮损伤反应和免疫炎症等几种假说[3.-5］．细胞因子信号通路抑制因子(SOCS)蛋白是免疫炎症假说中强调的细胞因子信号通路的抑制剂[6］．细胞因子，包括白细胞介素、干扰素(IFNs)、生长因子等，在免疫细胞的发育、分化和功能中起着重要作用[6］．大多数SOCS蛋白受细胞因子诱导，呈经典负反馈回路抑制细胞因子信号转导，从而调控免疫炎症反应[7]。SOCS3是SOCS的一个亚家族，参与炎症反应，因为它调节巨噬细胞和树突状细胞的激活，对t细胞的发育和分化至关重要[7］．此外，据报道，T细胞中SOCS3表达的缺失显著影响动脉粥样硬化的发展[8］．流行病学调查显示，雌激素可能是动脉粥样硬化的有利因素，男性冠心病发病率远高于女性，且绝经后女性冠心病发病率迅速增加[9，10］．多个研究小组已经证实雌激素改善动脉粥样硬化的机制，包括调节脂质代谢[11]以及平滑肌增殖和迁移的抑制作用[12］．SOCS介导的炎症抑制是否参与雌激素改善动脉粥样硬化尚未有研究。在乳腺癌和肝癌细胞中，SOCS3的表达与雌激素水平相关[13，14]，可能受雌激素反应元件与SOCS3启动子相互作用的调控[13］．近期研究报道巨噬细胞在动脉粥样硬化的发生发展中发挥重要作用[15，16］．因此，我们重点研究雌激素与巨噬细胞SOCS3表达的关系，SOCS3可能参与雌激素对动脉粥样硬化的炎症调节。

材料与方法

细胞培养

RAW264.7细胞在DMEM培养基(Hyclone)中培养，培养基中添加10% FCS (Hyclone)、100 U/ mL青霉素、50 μg/mL链霉素和2 mM l -谷氨酰胺(Hyclone补充品)。细胞用0.25%胰蛋白酶胰化，每2-3天刷新一次。

17β-雌二醇和ICI 182,780细胞治疗

RAW264.7细胞培养在6井5×104 /毫升的浓度。细胞被洗两次与PBS和刷新2毫升同类群中blankA£€1% DMSOA£一€17β雌二醇100 nMA£10一个€nMA£€1海里。细胞分别孵育12h和24h, MTT法检测细胞活力。同时，采集细胞进行实时PCR分析。对于ICI 182780处理，执行相同的程序。每孔分别加入17 β -雌二醇10 nM、17 β -雌二醇10 nM+ICI 182780 100 nM孵育12h进行实时PCR分析。

实时定量PCR

细胞用250 μL Trizol (Invitrogen, Carlsbad, USA)裂解，保存于-80Ã①Â Â。使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen, Venlo, Netherlands)提取总RNA。RNA的浓度和纯度用NanoDrop ND- 1000分光光度计(Thermo, USA)测定。总RNA (2 μg)通过SuperScript First-Strand Synthesis System (Invitrogen)以随机六聚体为引物转化为cDNA。实时PCR使用ABI PRISM 7700序列检测器(Life Technologies, USA)进行。在含有10 μL SYBR Premix Ex Taq TM II的20 μL反应液中进行PCR;0.8 μL正向和反向引物(10 μL)和6 μL cDNA。样品在95°C放大10s，然后在95°C放大5s, 63.5°C放大15s, 72°C放大10s，循环45次。为了标准化样本RNA的数量，我们扩增了内源性管家基因GAPDH作为对照。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳，以检查片段大小。

免疫印迹

细胞球在含有50 mM Tris、150 mM NaCl、1% NP40和0.25%脱氧胆酸钠的裂解缓冲液中裂解。添加以下蛋白酶和磷酸酶抑制剂:4mm Na3VO4(450243)， 1mm Na4P2O7(P8010)， 2 μg/mL抑肽蛋白(A6103)， 50 μg/mL leupeptin (L2884)， 500 μg/mL胰蛋白酶抑制剂(T9378)， 10 μM苯甲酰胺(12072)，2.5 mM pnp苯甲酯(N8264)， 1mm AEBSF (A8456)和50 μg/mL pepstatin A (P5318)(均来自Sigma)， 50 mM NaF (27860.231)， 5 mM EDTA(20296.260)(均来自VWR International, West Chester, PA)。通过离心(5分钟，14000 rpm)去除细胞碎片，并加入样品缓冲液。煮沸后，样品在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上分离，并转移到PVDF膜上(Bio-Rad, Hercules, CA)。用含有5%低脂牛奶和0.1%吐温20的PBS阻断膜。SOCS3和GAPDH抗体来自Cell Signaling Technology。

统计分析

所有实验至少重复3次。数据以Mean±SD(标准差)表示。使用Mann-Whitney U检验确定组间的显著性。当P<0.05时，认为结果显著。

结果

为了研究雌激素是否能调节SOCS3在巨噬细胞中的表达，我们设计了SOCS3基因和GAPDH基因(一种家政基因控制)的实时PCR引物。引物序列如图所示表1．实时PCR扩增后，通过电泳检测PCR产物的特异性。在凝胶中，它清楚地显示出大约366bp的SOCS3基因条带(图1)．此外，从溶解曲线中我们可以看到在87°左右的单线态，这表明SOCS3引物的特异性(图1)．

表1。SOCS3和GAPDH基因引物序列。

对于管家型GAPDH基因，我们在凝胶中得到了约498bp的条带，在溶解曲线中得到了87°C的单线态(图2)．

接下来，我们用2^{——¢一个–³¢–³Ct}方法(17］．结果表明，17 β -雌二醇作用12h后，能以浓度依赖的方式上调SOCS3基因的表达(图3)．17 β -雌二醇作用于巨噬细胞24h后也得到了类似的结果(图4)．接下来，我们通过western blot研究了SOCS3在10 nM 17 β -雌二醇处理的巨噬细胞中的表达。我们用BCA法测定蛋白质样品的浓度。我们用试剂盒中的标准样品绘制了BCA测定的标准曲线。标准曲线描述为y=0.2209X²0.1809 + 1.9457 x +(图5)．根据标准曲线，我们计算出每个样品的相应浓度，如表2．western blot检测了相同的蛋白载量，结果显示10 nM 17 β-雌二醇作用12h和24h后，巨噬细胞中SOCS3的表达增加(图6)．图6 b为每个样本对应的灰色分析，可以清楚地表明SOCS3在17 β -雌二醇模拟后表达上调。

表2。BCA法测定蛋白质浓度。

接下来，我们想知道雌激素模拟对巨噬细胞SOCS3表达的上调是否通过雌激素和雌激素受体(estrogen receptor, ER)信号通路介导。我们使用ICI182780(雌激素受体的特异性抑制剂)在模拟雌激素巨噬细胞时阻断ER信号。实时PCR结果显示，在抑制雌激素受体的同时，17 β-雌二醇仍能上调SOCS3的表达(图7)表明雌激素对SOCS3的上调是通过ER独立信号通路实现的。

讨论

Matthews等报道雌激素可在乳腺癌T47D细胞中以时间依赖的方式上调SOCS3的表达[14］．他们发现SOCS3 mRNA的表达在雌激素处理1h后增加，并在处理3h后达到峰值。6h后，SOCS3的表达恢复到基础水平。Leong等人在肝癌HuH7细胞中经100nM雌激素模拟后2h SOCS3 mRNA表达达到峰值[13］．在活体去卵巢小鼠实验中，短时间雌激素处理(10h和48h)不能上调肝组织中SOCS3的表达。但在长期雌激素治疗(3-5周)后，肝组织中SOCS3 mRNA表达上调[13］．在人胚胎肾细胞中，Leung等报道雌激素不能上调SOCS3 mRNA的表达[19]，表明雌激素模拟上调SOCS3表达存在细胞和组织学差异。我们首先在巨噬细胞中报道了雌激素模拟可以上调SOCS3的表达，我们进一步指出SOCS3的上调不是由雌激素受体信号介导的。雌激素通常与雌激素受体(ER α和ER β)相互作用并激活其下游通路。有一些新的受体，如G蛋白偶联受体30ï¼ GPR30 (GPER1)，被报道通过雌激素模拟激活下游信号[20.］．Elisabetta等报道了在RAW264.7细胞中ER α的表达，而没有ER β的表达[21]，在小鼠中也发现了同样的结果，只有ERα在巨噬细胞中表达[22］．在人巨噬细胞中，不仅ER高表达，GPER也高表达[23]，但尚无数据显示GPER在RAW264.7细胞中的表达。我们将进一步研究SOCS3的上调是否由雌激素- gper信号通路介导。进一步研究雌激素诱导巨噬细胞SOCS3上调是否对动脉粥样硬化有保护作用及分子机制。

致谢

本研究得到国家自然科学基金(No. 30700320)的资助。

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