SOCS3的上调表达雌激素在巨噬细胞模拟不是通过雌激素受体(ER)信号

文摘

Immuno-inflammation假说是动脉粥样硬化的机制目前的热点,而soc(细胞因子Sigaling Suppresor)是关键细胞因子抑制剂及其immuno-inflammatory信号。最近的研究表明,SOCS3可能是一个潜在的动脉粥样硬化的保护因素,而雌激素则显示动脉粥样硬化起到保护作用。在本文中,我们表明,雌激素可以增加SOCS3在巨噬细胞细胞以剂量依赖的方式表达。我们进一步证明雌激素调控SOCS3表达式不是通过传统的ER(雌激素受体)通路被雌激素inhibitor-ICI182780。我们的研究结果说明关于雌激素使动脉粥样硬化的机制保护的更多细节。

关键字

动脉粥样硬化、雌激素、SOCS3,巨噬细胞,Immuno-inflammation

介绍

改变人们的生活方式和社会环境因素的变化,心血管疾病(CVD)的发病率逐年增加,尤其是冠心病(CHD) [1]。动脉粥样硬化是最常见的一个病理过程,导致心血管疾病。它的特点是形成动脉粥样硬化斑块的组成的坏死核心,钙化区域,修改后的脂质积累和各种细胞(2]。有几种假说来解释动脉粥样硬化的发病机制,如脂质浸润,血栓形成,平滑肌细胞克隆,内皮损伤炎症反应和免疫(3- - - - - -5]。抑制细胞因子的信号(soc)蛋白质的细胞因子信号通路抑制剂中强调免疫炎症假说(6]。细胞因子,包括白介素、干扰素(ifn),生长因子等人发展有重要作用,免疫细胞的分化和功能(6]。最出类拔萃的蛋白质是细胞因子引起的,因此在一个经典的负反馈循环抑制细胞因子信号转导,从而调节免疫炎症反应[7]。SOCS3, sub-family soc,参与炎症反应,因为它调节巨噬细胞和树突状细胞激活和t细胞发育和分化的关键(7]。此外,据报道,失去SOCS3表达T细胞显著影响动脉粥样硬化发展(8]。流行病学调查显示,雌激素可能是动脉粥样硬化的一个有利因素,冠心病发病率在男性比女性高得多,绝经后妇女发病率迅速增加了冠心病(9,10]。几组展示了由雌激素改善动脉粥样硬化的机制,包括脂类代谢的调节(11和抑制平滑肌细胞增殖和迁移12]。soc介导炎症抑制是否参与改善动脉粥样硬化的雌激素尚未被研究过。在乳腺癌和肝癌细胞,SOCS3表达式被发现是相关的雌激素水平(13,14,可能是受雌激素反应元件与SOCS3启动子之间的相互作用(13]。最近的研究报告说,巨噬细胞在动脉粥样硬化的发展起着重要的作用15,16]。因此,我们关注的关系在巨噬细胞雌激素和SOCS3的表达,可能参与动脉粥样硬化的炎症调节雌激素。

材料和方法

细胞培养

RAW264.7细胞在DMEM培养基培养和维护(Hyclone)补充10% FCS (Hyclone), 100 U /毫升青霉素,链霉素50μg /毫升和2毫米谷酰胺(从Hyclone补充)。细胞使胰蛋白酶化0.25%胰蛋白酶和每2 - 3天刷新。

细胞治疗17β-estrodiol和ICI 182780

RAW264.7细胞培养在6井5×104 /毫升的浓度。细胞被洗两次与PBS和刷新2毫升同类群中blankA£€1% DMSOA£一€17β雌二醇100 nMA£10一个€nMA£€1海里。细胞进一步孵化12 h和24 h和细胞生存能力被MTT试验检查。与此同时,为实时PCR分析细胞收获。ICI 182780治疗,执行同样的步骤。对于每一个,我们添加了17β雌二醇10 nM, 17β雌二醇10 + ICI 182780 100 nM和孵化12 h实时PCR分析。

实时定量聚合酶链反应

250年细胞细胞溶解μL试剂盒(美国卡尔斯巴德英杰公司)和维持在-80 A¢„ƒ。总RNA提取使用RNeasy迷你包(Venlo试剂盒,荷兰)。核糖核酸的浓度和纯度测定使用NanoDrop ND - 1000分光光度计(美国热)。总RNA(2μg)是由上标第一链转化为互补的六聚体合成系统(英杰公司)使用随机引物。实时PCR是使用ABI棱镜7700序列检测器(生活技术,美国)。PCR进行20μL反应混合包含10μL SYBR预混料交货Taq TM II;0.8μL正向和反向引物(10μM)和6μL互补脱氧核糖核酸。样本被放大到95°C 10年代,紧随其后的是45周期为5 s在95°C, 63.5°C 15和72°C 10年代。标准化的RNA样品,我们放大内生看家基因GAPDH控制。PCR产品1.2%琼脂糖凝胶上电泳检查片段大小。

免疫印迹

包含50 mM细胞颗粒细胞溶解在裂解缓冲三,150毫米氯化钠,1% NP40, 0.25%钠脱氧胆酸盐。下面的蛋白酶和磷酸酶抑制剂添加:4毫米Na3VO4(450243), 1毫米Na4P2O7 (P8010), 2μg /毫升抑肽酶(A6103), 50μg /毫升亮抑酶肽(L2884), 500μg /毫升胰蛋白酶抑制剂(T9378), 10μM benzamidin(12072), 2.5毫米pnp苯甲酸(N8264), 1毫米AEBSF (A8456)和50μg /毫升抑肽素(P5318)(所有从σ),50 mM氟化钠(27860.231),5毫米EDTA(20296.260)(西切斯特,VWR国际PA)。细胞碎片被离心去除(5分钟,14000 rpm)和样品缓冲了。沸腾后,样品被分离在钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到PVDF膜(Bio-Rad大力神,CA)。膜被封锁的PBS包含5%的低脂牛奶和0.1%的渐变20。抗体SOCS3 GAPDH和从细胞信号技术。

统计分析

所有实验至少重复3次。日期被视为平均数±标准差(标准差)。团体之间的意义是决定使用Mann-Whitney U测试。结果被认为是重要的,当P < 0.05。

结果

调查是否雌激素可能在巨噬细胞调节SOCS3的表达,我们设计的实时PCR引物SOCS3基因和GAPDH基因(一个自立门户的基因控制)。这些引物的序列所示表1。实时PCR扩增后,我们检查特异性PCR产物的电泳。凝胶中清楚显示SOCS3基因的乐队在366个基点左右(图1)。此外,从溶解曲线我们可以看到一个单线态约为87°,表明SOCS3引物的特异性(图1)。

表1。SOCS3和GAPDH基因的引物序列。

自立门户的GAPDH基因,我们得到了一个乐队在498个基点凝胶和单线态87°C的溶解曲线(图2)。

接下来,我们分析了SOCS3的表达基因治疗的巨噬细胞与不同浓度的17β-estrodiol使用2^{——¢一个–³¢–³Ct}方法(17]。结果表明,17β雌二醇可能会上调SOCS3基因表达以浓度依赖方式后17β雌二醇治疗12 h(图3)。类似的结果后17β雌二醇治疗24小时在巨噬细胞(图4)。接下来,我们研究SOCS3的表达在巨噬细胞治疗10 nM 17β雌二醇免疫印迹。我们使用了BCA试验来确定蛋白质样品的浓度。我们说明BCA的标准曲线测定使用装备的标准样品。标准曲线是描述为y = 0.2209 x²0.1809 + 1.9457 x +(图5)。根据标准曲线计算每个样本的相应的浓度,所示表2。我们量化相同的蛋白质免疫印迹和结果表明,加载SOCS3表达增加巨噬细胞治疗后10 nM 17β-estrodiol 12 h和24 h(图6)。图6 b显示了每个样本的相应的灰色分析,明确表明SOCS3表达上调后17β雌二醇模拟。

表2。蛋白质浓度由BCA试验测量。

接下来,我们怀疑SOCS3表达上调的巨噬细胞通过介导雌激素模拟雌激素和雌激素受体(ER)信号。我们使用ICI182780(特定的雌激素受体抑制剂)阻止ER信号模拟巨噬细胞时雌激素。实时PCR结果显示,尽管抑制雌激素受体,17β-estrodiol仍然可以调控SOCS3表达式(图7),这表明SOCS3的老年病雌激素通过ER独立信号。

讨论

马修斯等人报道,雌激素可能会上调SOCS3时间的方式表达在乳腺癌T47D细胞(14]。他们证明了SOCS3 mRNA表达增加1 h与雌激素治疗后,和3 h(治疗后达到峰值。6小时后,SOCS3表达式返回到基础水平。梁等人证明SOCS3 mRNA表达达到峰值后2 h 100 nm模拟雌激素在肝癌HuH7细胞(13]。虽然体内切除卵巢的老鼠实验中,短时间内雌激素治疗(10 h和48 h)不能调控SOCS3表达肝脏组织。然而,由于长期的雌激素治疗(3 - 5周),SOCS3 mRNA在肝组织表达上调(13]。在人类胚胎肾细胞,梁等人报道,雌激素不能调控SOCS3 mRNA表达(19),这表明老年病SOCS3表达式的雌激素模拟细胞和组织学差异存在。我们首次报道在巨噬细胞,模拟雌激素可以调控SOCS3表达式,我们进一步指出,SOCS3上调不是雌激素受体介导的信号。通常雌激素与雌激素受体(ERα和ERβ)并激活其下游通路。有一些新颖的受体,如G protein-coupled受体30一个¯¼ŒGPR30 (GPER1),据报道,激活下游信号的模拟雌激素(20.]。伊丽莎白等人报道ERα的表达而不是RAW264.7细胞ER表达β(21),在老鼠身上发现了相同的结果,只有ERα巨噬细胞表达细胞(22]。在人类巨噬细胞,不仅ER还gp(是高表达23),但没有数据显示gp在RAW264.7细胞的表达。我们将进一步调查SOCS3的老年病是否被estrogen-GPER信号介导的。此外,找出是否SOCS3的老年病雌激素引起的巨噬细胞在动脉粥样硬化的保护作用及分子机制。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(30700320)。

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