槲皮素和山奈酚代谢物清除自由基能力的理论研究

摘要

许多研究已经证明了类黄酮在与氧化应激有关的疾病中的有益作用。彻底清除是一种可能的作用方式，通过两个过程:氢自由基转移或电子转移。可以较准确地计算这两个过程对应的焓值，以评价其自由基清除性能多酚类物质．如果大量研究已经确定苷元或糖基化黄酮类化合物的自由基清除性能，则尚未对其进行理论计算代谢物这些化合物是人体组织或血浆中的活性分子。本文准确计算了两种丰富的黄酮类化合物代谢产物的两个自由基清除过程，即一个氢原子和一个电子的转移，槲皮素而且山柰酚并讨论了连续的代谢自由基清除性质的演变，在体内真正活跃的自由基清除剂提供了一些见解。

关键字

黄酮醇，键解离焓，电子转移焓，代谢物，抗氧化剂

简介

许多科学研究都支持多酚类物质对人体的保护作用慢性退行性疾病(1］．最初，这种效应被归因于这些化合物的自由基清除特性，但现在出现了更复杂的模式。与自由基清除特性相伴随的是在体外通过其他途径，特别是金属相互作用和抑制ROS产生，显示出氧化应激的减少酶如黄嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶和脂氧合酶[2］．也有证据表明，多酚作为信号分子的过程。在这种模式下，相互作用降低了炎症从而影响机体的反应，从而影响ROS的产生。然而，体内研究并不容易分析，而且可能与体外研究相矛盾。这是因为多酚在体内吸收过程中会被代谢。活性分子不再是摄入的分子。

据证实，每天从膳食中摄取的多酚量在0.15至1克之间[3.］．在多酚类化合物中类黄酮由于其众多的特性而受到了广泛的关注。其中一些，通常作为糖基化衍生物，每天可达到10-100毫克。然而，它们在人血浆中的含量很少超过1毫米。这是消化过程中强烈而复杂的分解代谢的结果，在体外和体内实验中都进行了广泛的研究。

分解代谢可发生在所有的消化系统和大多数葡萄糖苷在吸收前被特定的酶去糖基化。然后，其他酶代谢它们。的生物转化多酚是非常复杂的，是特定的消化系统的一部分，正如最近的一项研究所说明的那样[4[译文:它随之而来在体外苹果多酚的代谢，特别是糖基化槲皮素的代谢，在消化器官的不同汁液中。研究表明，取代槲皮素在口腔内的水解不是由于唾液，而是取决于口腔菌群。黄酮醇在模拟胃液中稳定。在十二指肠汁中，黄酮醇苷被发现是稳定的，但作者观察到苷元槲皮素通过中间的2,4,6-三羟基苯甲酸在3,4-二羟基苯甲酸和间苯三酚中几乎在2小时内完全降解。相反，槲皮素在回肠造口培养中是稳定的，但黄酮类苷可以被水解。代谢产物吸收后，可在肝脏中被修饰。为了研究这一过程，作者在新分离的肝细胞中培养了分子:苷元槲皮素发生了强烈的偶联反应，主要是在4 ' - o -葡萄糖苷中。综上所述，作者的发现与其他研究相关:苷元的重要代谢发生在十二指肠和肠道。糖苷被肠道更好地吸收，但在肝脏中进一步代谢。血浆中最常见的缀合物是葡萄糖醛酸盐、硫酸盐或甲基化化合物[5，6］．

其他研究强调了多酚在结肠中生物转化的重要性。槲皮素及其糖基化衍生物的生物转化非常重要，因为最初摄入的槲皮素只有一小部分(1-5%)从结肠的消化剂中排出[7］．这种新陈代谢的一个重要部分是由于微生物区系胃肠道的包含在胃肠道内的，尤指远端胃肠道内的胃肠道的每个部分都有独特的菌群，但细菌种类的浓度在其远端部分更为重要。由微生物群引起的转化包括O-和c -去糖基化、酯类水解和去葡萄糖醛酸化、芳香的去羟基化、去甲基化和芳香环破裂后产生的脂肪族元素的氧化。黄酮类化合物的生物转化有不同的可能性:a环的裂变(图1)与最终代谢物CO进行了观察₂．Eubacterium spp.用a降解黄酮类化合物deglycosylating活性和分裂c环的能力。一些研究[8，9]证明了其他细菌梭状芽孢杆菌(Clostridium spp.)快速裂解槲皮素的糖基化或苷元c环，形成3,4-二羟基苯乙酸和间苯三酚。第一个分子还可以进一步代谢为3-羟基苯乙酸和4-羟基- 3-甲氧基苯乙酸。3,4-二羟基甲苯也被认为是槲皮素的代谢物。对于大多数类黄酮来说，起源于b环的酚酸保留了它的完整。其他代谢物来自a环。结肠代谢的重要性可以通过对接受手术切除结肠的志愿者进行体内研究来评估。这些受试者的回肠液中含有86%他们摄入的槲皮素-3- o -芦丁苷[10]并且在他们的血浆或尿液中没有检测到代谢物。特别是尿中没有c环裂解产生的酚酸。相比之下，在健康志愿者中，这些酚酸的摄入量相当于类黄酮摄入量的22%。

由于黄酮醇和其他多酚代谢的重要性和复杂性，了解代谢产物是否保留摄入化合物的自由基清除特性是很重要的。本文的目的是计算两种丰富的黄酮醇代谢产物的自由基清除性能，以评估自由基清除的可能性在活的有机体内．

槲皮素是一种常见的类黄酮，在很多蔬菜和水果中都有。富含槲皮素的食物包括红茶和绿茶(Camellia sinensis;2000-2500毫克/公斤)、酸豆(1800毫克/公斤)、洛瓦奇(1700毫克/公斤)、苹果(440毫克/公斤)、洋葱，尤其是红洋葱(191毫克/公斤)、红葡萄、柑橘类水果、番茄、花椰菜和其他绿叶蔬菜，以及一些浆果[11]。山奈酚是另一种苷元类黄酮，含量较少抗氧化剂属性。它可以从茶叶中分离出来，[12西兰花、飞燕草、金缕梅、葡萄柚、卷心菜、羽衣甘蓝、豆类、菊苣、韭菜、西红柿、草莓、葡萄、球芽甘蓝和苹果。这两种黄酮醇在肠道和肝脏中代谢不同。克鲁恩等人[13]综述了人类血浆和尿液中不同多酚的结构。槲皮素是葡萄糖苷和槲皮素和甲基槲皮素的硫酸盐的混合物。山奈酚的分解代谢不那么重要，因为有证据表明人血浆中只有游离山奈酚和山奈酚- 3-葡萄糖苷。本文计算了这些不同代谢物的自由基清除性能，并与苷元化合物进行了比较。由于大量苷元黄酮醇被胃肠道的微生物代谢，因此c环或b环断裂产生的分子也被研究过。

计算方法

它已被证明[14在质子溶剂和水中，基本上有两种机制导致类黄酮清除自由基。在第一个过程中，自由基从抗氧化剂那里获得了一个氢原子，氢原子变成了自由基:

R^•+Φ哦→RH+ΦO^•(1）

这种氢转移(HAT)的发生是由温度决定的键解离焓(BDE)，用来测量OH键的强度。

式(2)给出该过程对应的焓:

12＝H(ΦO^•) +H（H^•)−H(Φ哦) (2)

H(ΦO^•)为phenoxyl自由基H的焓(H^•)为氢自由基的焓，H为Φ哦)黄酮的含量。如果多酚的BDE比RH低，则反应为放热反应。

如果多酚分子由于其低pKa而在生理pH值下以阴离子形式存在，则第二种机制被命名为顺序质子损失电子转移(SPLET): [15，16］．

Φ哦↔ΦO^-+ H⁺

ΦO^-+R^•→ΦO^•+R^-

与该反应相关的显著焓可记为ETE (electronic transfer焓)[17］．本文中ETE的计算方法为:

研讨会＝H(ΦO^•)−H(ΦO⁻) (4)

多酚清除自由基的能力取决于其ETE的相对值R⁻和ΦO⁻因此，电子或自由基的氢捐赠是两个独立的过程，依赖于自由基的ETE或BDE值来清除。但是，如果多酚的BDE或ETE值较低，则其清除相对稳定自由基的能力会增强。

上述两种机制对应的焓采用高斯09包[18］．计算是用密度泛函理论(DFT)方法和混合泛函B3LYP方法被广泛用于此类计算，因为它与大基集相结合时，实验结果具有良好的再现性。计算捐赠过程特有的两个热力学量的方法如下:

12:

一种FOH的焓可估计为:

（5）

在E₀为计算出的总电子能，ZPE为零点能，其他项为分子的平移、旋转或振动所产生的焓的热贡献。最后五项在高斯频率计算中计算。

利用B3LYP交换相关势和基集:6-31+G(2d,2p)，在密度泛函理论(DFT)方法中优化了整个分子和自由基的几何形状。对自由基采用无限制开壳法(UB3LYP)。焓H(FOH)和H(FOË ' s)在相同的计算水平上进行评估。BDE等于两种物质的焓差减去氢自由基的焓差。如参考文献[19]则HÃ‑·自由基的焓等于0.49764 hartrees。焓是在自洽反应场极化连续模型(SCRF-PCM)框架内计算的[20.，21通过建立一个重叠球体的空腔来模拟溶剂中的溶液。因此，已经计算了水中的bde，以给出更准确的量，因为在气相或水中的溶液中，几个分子的bde可能略有不同。

ETE:在计算电子传递焓时，采用相同的方法和基集B3LYP/6-31+G(2d,2p) (UB3LYP/6-31+G(2d,2p))优化了阴离子和自由基的几何形状。零点能量(ZPE)在同一计算级别内计算。ETE是由ZPE校正的能量差。与BDE相反，ETE在溶液相和气相中完全不同。溶剂效应在自洽反应场极化连续介质模型(SCRF-PCM)框架下进行评估[20.，21]在高斯包中实现。

结果与讨论

计算结果总结在表1．该表显示了代谢物在中性和阴离子形态下的BDE、ETE以及阴离子形态和中性形态DE之间的自由能差。前者的量、BDE和ETE以千卡/摩尔表示，后者以hartrees表示。能量差DE给出了对p的评价K_一个有关化合物[22与已知产品进行比较。槲皮素有两种构象[23]根据邻苯二酚部分OH键的方向。当邻苯二酚指向3位，OH键位于3 '位，OH键位于4 '位时，脱质子位点位于4 '位。当邻苯二酚的构象是4 ' OH键指向3 '位时，脱质子位点位于7位。这种构象稍稳定，但DE较高，可作为p的参考K_一个接近7。

替换类黄酮:甲基、硫酸盐或葡萄糖醛酸取代槲皮素中的一个羟基氢原子，可使BDE增加4至8千卡/摩尔。当邻苯二酚被取代时，这个结果是可以预料的，因为槲皮素主要在4 '位置上给出氢。而在脱质子苷元化合物中，位置3的BDE与位置4 '的BDE具有相同的数量级。如果BDE是羟基的局部性质，取代就不会有这样的效果。在3 '或3 '位置的取代降低了剩余羟基的BDE，再次说明BDE的值不仅与羟基在分子中的位置有关，而且与电子离域的可能性有关[24］．最有效的取代基清除剂是阴离子形式的槲皮素-3 ' -o-甲基。但其评估pKa似乎较高，在生理ph下不太可能存在这种形式。酸替代了其他代谢物。因此，它们是生理ph下的阴离子。已经计算了离子的DEs来评估第二次去质子化是否可能。槲皮素-3-o-葡萄糖苷只有一种构象具有与槲皮素相同强度的DE。槲皮素-3-o-葡萄糖苷有四种近似相同自由能的构象。这些构象因7和3’4’两个位置上羟基的方向不同而不同。当邻苯二酚基团的氢原子指向2 '位置时，计算表明脱质子发生在7号位置(图2)．计算出的DE为0.465 hartrees，与槲皮素相比，DE较高。当酚基指向另一个方向时，脱质子发生在4 '位置，计算出的DE与苷元槲皮素的DE大小相同。该离子具有较低的ETE，可被认为是取代槲皮素系列中最好的自由基清除剂之一。槲皮素-3 ' -o-sulfate只有两种稳定的构象:在这些构象中，位于4 '位置的羟基指向硫酸盐。的去质子化发生在位置7处，计算的DE较高。另一方面，槲皮素-3-o-硫酸酯具有槲皮素-3-葡萄糖醛酸酯的四种构型。但是在4 '位置上脱质子的阴离子的DE为2，使构象在生理pH下解离。

综上所述，具有一个取代基的槲皮素代谢物的BDE在75 ~ 79 kcal/mol之间，可以认为是通过氢自由基的贡献作为中度抗氧化剂。人们可以注意到，BDE的这些值足够低，可以清除脂质介质中的过氧自由基。然而，这些分子给出电子的能力可以忽略不计，只有一个例外:槲皮素-3-o-葡萄糖醛酸酯的电离子。二取代代谢物槲皮素-3-o-葡萄糖苷-3 ' -甲基已经失去了母体化合物的所有自由基清除特性。人们也可以观察到山奈酚代谢物的这种损失。

已知当取代基位于邻苯二酚或位置3时，糖基化对黄酮类化合物的BDE有降低作用。据观察，BDE的减少是取代化合物中羟基氧原子穆立肯电荷减少的结果[14］．葡萄糖醛酸、甲基或硫酸盐的替代具有相同的效果:它降低了类黄酮中所有羟基的电荷。由此可见，代谢物中其余羟基的BDE均高于母体化合物中相应羟基的BDE。此外，酸性基团的取代通常会大量增加ETE。人们可以用质子溶剂稳定分子的负形式这一事实部分解释这一发现。有一些例外，尤其是醋酸。槲皮素和山奈酚的大多数代谢物是通过取代一个或两个羟基而得到的，电子的馈赠已成为不可能。

c环裂解产生的代谢物:当槲皮素被裂解时，形成两种代谢物:3,4-二羟基苯乙酸和3,4-二羟基甲苯保存了B环的儿茶酚部分。它们仍然是良好的自由基清除剂，其BDE为74千卡/摩尔，尽管它们的构象不同。取代后的甲苯DE高，生理ph保持中性。3,4-二羟基苯乙酸的一个羟基在结肠内被裂解，形成的3-羟基苯乙酸通过氢原子给能使自由基清除能力变差，但通过电子给能保持良好的自由基清除能力。在组织中，3,4-二羟基苯乙酸转化为4-羟基-3-甲氧基苯乙酸。该化合物的BDE为76.9千卡/摩尔，具有一定的自由基清除能力，但失去了电子的释放能力。

文献14表明苷元和取代黄酮类化合物的自由基清除能力计算结果与实验结果吻合良好。图3表明槲皮素代谢物的这种一致性继续存在，因为3,4-二羟基苯乙酸、3-羟基苯乙酸和3,4-二羟基甲苯的BDE计算结果与dpp -清除率法测定的实验IC50值显示出良好的相关性[25］．c环裂解后从A环释放的代谢产物2,4,6-三羟基苯甲酸和间苯三酚不是很好的自由基清除剂。

结论

理论计算证实槲皮素或山奈酚的大部分代谢产物清除自由基的能力下降。然而，槲皮素的代谢物在保存类黄酮框架的同时，通常通过贡献一个氢原子来保持中度自由基清除。当c环被切割时，大多数摄入的黄酮醇都会发生这种情况，一些代谢物可能通过氢原子捐赠或电子捐赠(特别是当它们保存b环时)保持良好的自由基清除性能。其他代谢物被剥夺了初始能力。一些代谢产物的剩余效力可以部分解释富含蔬菜的饮食对许多与氧化应激有关的疾病发挥保护作用的效率[26］．Perez-Vizcaino等人[27对富含槲皮素的饮食效率提出了另一种解释。如果槲皮素苷元和糖苷在肠道吸收和肝脏中被取代，一些代谢物肯定会在组织中解凝。事实上，在人体血浆中没有发现槲皮素，但已经在组织中观察到它的存在。Shimoi等人[28]已证明类黄酮葡萄糖醛酸在人中性粒细胞和Lee-Hilz等人的水解。[29]在癌细胞系中。这样看来在活的有机体内，就有可能解除对monoglucuronides槲皮素，而不是硫酸盐。这两种可能性并不排除:摄取的部分黄酮类代谢物，解凝或由a环裂解产生，仍然可以作为自由基清除剂。

Aknowledgements

计算是用一台SGI计算机和一个由法国Région阿基坦公司购买的IBM P5-575集群进行的。作者感谢Université des Antilles Guyane的S. Bercion提供非常有帮助的讨论。

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