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ISSN: 2321 - 6212

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百里香功能化聚多巴胺包覆ZnO纳米颗粒增强抗菌活性的生物医学应用

Parinaz Nezhad-Mokhtari1，， Nahideh Asadi1， Yaeghob Sharifi2， Morteza Milani，3.

1伊朗大不里士医科大学医学纳米技术系

2伊朗乌尔米亚医科大学微生物学系

3.传染病和热带疾病伊朗大不里士医科大学研究中心

*通讯作者:
Yaeghob·沙里夫,
微生物学系，
乌尔米亚医科大学，
Urmia,伊朗

电子邮件: (电子邮件保护)

收到了: 03- 03- 2022，稿件编号:joms - 22 - 56037;编辑分配:05- 2022年3月，预qcJoms -22-56037 (pq);综述了: 19- 2022年3月，QC号JOMS 22 - 56037;修改后的日期:24- 2022年3月，稿件编号:Joms -22-56037 (r);发表: 31- 2022年3月，DOI: 10.4172/2321-6212.10.3.003。

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摘要

细菌感染是与伤害相关的死亡的主要原因，已经开发了一些努力来解决这一问题。为此，我们合成了一种基于百里香功能化多多巴胺包被ZnO NPs ((电子邮件保护))．在合成ZnO NPs后，采用一步简单的方法对其进行了表面改性(电子邮件保护)TH。这一发现证明，创造杆状形态的NPs为细菌创造了一个大的接触表面积。雷竞技网页版在NPs表面形成均匀的TH层对其形状没有实质性影响。抗菌实验揭示了这一点(电子邮件保护)对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有更高的抗菌活性。这表明(电子邮件保护)的表面接枝TH(电子邮件保护)具有优良的协同抗菌作用。总之，我们建议做好准备(电子邮件保护)可以用作生物医学的抗菌剂。

摘要

细菌感染是与伤害相关的死亡的主要原因，已经开发了一些努力来解决这一问题。为此，我们合成了一种基于百里香功能化多多巴胺包被ZnO NPs ((电子邮件保护))．在合成ZnO NPs后，采用一步简单的方法对其进行了表面改性(电子邮件保护)TH。这一发现证明，创造杆状形态的NPs为细菌创造了一个大的接触表面积。雷竞技网页版在NPs表面形成均匀的TH层对其形状没有实质性影响。抗菌实验揭示了这一点(电子邮件保护)对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有更高的抗菌活性。这表明(电子邮件保护)的表面接枝TH(电子邮件保护)具有优良的协同抗菌作用。总之，我们建议做好准备(电子邮件保护)可以用作生物医学的抗菌剂。

关键字

氧化锌纳米颗粒;Polydopamine;百里香;抗菌剂

简介

细菌感染是导致各种疾病蔓延的最重要问题之一[1-4］．虽然使用抗生素是阻止细菌活动的常用手段，但过度处方和滥用抗生素的主要缺点是耐药性的增加[5-7］．因此，抗菌剂的存在已被证明是一种局部抑制细菌活性而无副作用的替代方法。抗菌纳米颗粒(NPs)是一种很有前途的限制细菌活性的药物[8，9］．纳米技术已发展出各种类型的纳米级材料[10］．NPs是一大类材料，包括至少有一个维度小于100纳米的颗粒物质[11］．许多不同类型的金属NPs，如金(Au)、银(Ag)、锌(Zn)和铜(Cu)，在纳米科学中发挥着重要作用，并具有许多有趣的应用，包括有趣的生物医学和光学用途，因为它们固有的抗菌活性和鲜艳的颜色[12］．众所周知，无机抗菌剂具有很强的迁移抗性，如Ag、ZnO和钛白粉(TiO2) NPs [13，14］．Ag NPs是无机抗菌剂的典型代表，具有良好的抗菌活性[15，16］．然而，它的安全性存在争议。一些研究表明银对人体和环境有毒[17］．此外，含有Ag的聚合物复合材料由于Ag变色而发生颜色变化，这严重限制了其潜在的应用。此外，Ag材料价格昂贵，Ag NPs合成工艺复杂。氧化锌是另一种抗菌剂，由于其成本低、耐高温、抗菌活性强、光催化和防紫外线、高温变色，以及最重要的对人体的安全性而引起了人们的广泛关注[18-20.］．它被检测为生物安全的无机材料。其应用于化妆品已获FDA(食品及药物管理局)批准[21］．但氧化锌的缺点是抗菌活性太低。因此，提高ZnO的抗菌活性后，可获得一种抗菌活性好、安全性好、耐高温的优良抗菌剂[22］．

对不同官能团的NPs进行表面改性和表面涂层是消除无机NPs在生物医学用途上的几个缺点的有前途的方法[23］．此外，涂层可以与复杂的生物环境相互作用，并根据应用表现出不同的性能。考虑到天然有机抗菌剂的安全性和良好的抗菌效果，非常适合对NPs进行改性以提高抗菌活性，如百里香(TH) [24，25］．TH是一种来自胸腺的安全无害的天然抗菌和生物杀灭单萜类药物。它对细菌、真菌、酵母和霉菌也有适当的抗菌活性[26，27］．根据FDA的规定，TH是公认的安全食品添加剂[28］．此外，TH还具有抗真菌、抗氧化、抗糖尿病、抗炎以及单独或与其他化合物联合抗肿瘤等特点。为此，我们使用TH和肉桂醛(CA)对ZnO进行了改性。抗菌活性测定表明，TH和CA对提高ZnO-TH-CA的抗菌性能也有很好的协同作用[29］．结果还表明，将亲水性的TH和疏水性的CA接枝在ZnO的同一表面上是一种高效抗菌药物的有效途径。多巴胺(DOP)是一种分子，可以模仿贻贝的生物黏附行为，并容易通过自聚合沉积在各种基质上，形成聚多巴胺(PDA) [30.］．由于PDA薄膜表面含有丰富的胺和邻苯二酚基团，据报道，PDA薄膜可以作为一种活性模板和良好的还原剂，将Zn离子还原为ZnNPs [31，32］．适当厚度的PDA膜可以抑制Zn的迁移。在此基础上，研究人员制备了PDA包覆ZnO棒状NPs ((电子邮件保护))具有显著的抗菌活性和生物相容性。他们表明，发展(电子邮件保护)与ZnO NPs相比，NPs不仅对人体细胞无毒，而且能显著促进细胞存活。增强活性的发展(电子邮件保护)使用天然TH的NPs尚未被研究。本研究旨在制备一种基于ZnO NPs和TH-PDA ((电子邮件保护))，研究TH涂层对ZnNPs抗菌活性的影响[33-35］．

材料与方法

ZnO纳米颗粒(粒径范围10- 30nm)来自伊朗马什哈德nanosany公司。盐酸多巴胺98%购买Sigma-Aldrich。百里香粉来自伊朗的大不里士。大肠埃希菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 25923标准株均来自波斯型培养标本(PTCC)。其他溶剂和试剂均为试剂级。

多多巴胺功能化ZnO NPs的合成((电子邮件保护)）

(电子邮件保护)在多巴胺水溶液中加入ZnO NPs [36］．简单地说，40mg氧化锌纳米颗粒主要通过超声清洗分散在去离子水中。将10 mg多巴胺溶解于浓度为2 mg/ml的Tris-HCl缓冲液(pH=9)中，制备新鲜多巴胺溶液。然后将ZnO NPs分散到多巴胺溶液中制成悬浮液。将该悬浮液在37°C下剧烈搅拌24小时。(电子邮件保护)以10000转/分离心15分钟，冷冻干燥。

百里香功能化Zn/PDA NPs的合成((电子邮件保护)）

百里香溶液由100 mg百里香溶于无水乙醇制成。(电子邮件保护)是由与(电子邮件保护)制造。为此目的，得到了(电子邮件保护)离心后将百里香分散在乙醇溶液中。将该悬浮液在37°C下剧烈搅拌24小时，最后冷冻干燥。

合成纳米颗粒的表征

采用傅里叶变换红外(FTIR, Bruker, TENSOR 27, Germany)， KBr颗粒在400-4000 cm-1范围内对所有样品进行化学结构评价。通过扫描电镜(FE-SEM, MIRA3, Tescan)观察所得纳米颗粒的形貌。为了扫描电镜成像，首先，在冷冻干燥的样品上涂上一层薄薄的金。此外，利用能量色散x射线光谱(EDX)研究了纳米颗粒的元素。用动态光散射法(ZetaSizer, Malvern Instruments, Ver. 7.11)测量纳米颗粒在去离子水中分散的zeta电位。x射线衍射(XRD)。用Ital structure, MPD 3000)分析了纳米颗粒的结构，2θ范围为10°至80°，步长为0.001。

纳米颗粒的抗菌分析

对合成的纳米颗粒进行了抗菌活性评价金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性细菌)和大肠杆菌(革兰氏阴性菌)基于最低杀菌浓度(MBC)和最低生物膜根除浓度(MBEC)。

纳米颗粒的最低抑制浓度(MIC)

采用微肉汤稀释法确定纳米颗粒的最低杀菌浓度(2019)。在MHB (Mueller-Hinton肉汤)培养基(默克，德国)中制备连续浓度的纳米颗粒。随着纳米颗粒浓度的调整，范围从15到0.029 mg/ml。根据CLSI推荐(CLSI 2020)，在无菌生理盐水中制备相当于0.5 McFarland的细菌悬液，并接种到含有纳米颗粒的培养基中。37℃孵育24小时后，取100 μl试管内容物在营养琼脂培养基上传代培养，观察分离菌的生长情况。MBC被定义为能杀死99.9%的测试菌株的最低浓度的纳米颗粒。本试验分别对三个菌株进行。

最小生物膜根除浓度(MBEC)

每孔分别加入含有0.5%葡萄糖的Trypticase大豆肉汤(180 μl)和等量0.5 McFarland的菌悬液(20 μl)。37℃孵育过夜后，取孔内内容物，用300 μl无菌磷酸盐缓冲液洗涤3次。然后在孔中加入甲醇(150 μl)，在实验室温度下孵育约20 min。染色时，加入结晶紫(150 μl)，室温下孵育15分钟。洗净后倒置放置，彻底晾干。最后，在孔中加入33%的乙酸(150 μl)，室温静置30 min。在570 nm处使用微量滴度板阅读器检测每孔内容物的光密度。根据我们之前的研究，生物膜形成的截止光密度评估如下:强烈形成(+++)，中等形成(++)，弱形成(+)，无生物膜形成(0)。为了优化结果并提供可靠的数据，每个菌株重复试验3次。在此基础上，研究了纳米颗粒对生物膜根除的影响。 With the difference that after pouring the culture medium into the wells, serial dilutions of nanoparticles were prepared in each well and bacterial suspension was added to them. Finally, the results were interpreted as follows: no biofilm formation (0); OD ≤ ODc, weak form (+); OD ≤ 2ODc, medium (++); 2ODc

结果与讨论

如图1，新型TH功能化Zn/PDA NPs ((电子邮件保护))已成功备妥。用扫描电镜(SEM)对制备的NPs的形貌和形状进行了表征。扫描电镜图像(电子邮件保护)而且(电子邮件保护)显示针状和杆状的NPs (图2)．在用Zn(NO)合成ZnO NPs的类似研究中也发现了这种形态3.）2和锌(CH3COO)2体细胞。由于其较大的表面体积比，这种形态有利于几种生物材料的使用。最近的一项研究也说明了这种形态的抗菌特性。的(电子邮件保护)百里香包衣后形态无明显改变。然而，NPs表面出现了一些球形沉降，证实了PDA/TH涂层的存在。

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图1:百里香功能化Zn/PDA NPs (TH(电子邮件保护))．

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图2:多多巴胺功能化ZnO ((电子邮件保护)(a, 200 nm)， (b, 500 nm)，和(c, 1 μm))纳米颗粒和百里香功能化(电子邮件保护)（(电子邮件保护)(d, 200 nm)， (e, 500 nm)， (f, 2 μm))。

zeta电位是研究纳米乳液稳定性的一个重要因素。为了确定制备的NPs表面电荷，进行Zeta电位测试(图3 a,b)．结果表明，(电子邮件保护)(−17.2 mV)电荷呈负增强(电子邮件保护)(−8.36 mV)。可以看出，该化合物的胺基之间存在静电相互作用(电子邮件保护)与百里香结合导致百里香层形成羟基官能团，导致表面负电荷的产生。

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图3:(a)多多巴胺功能化ZnO NPs的Zeta电位((电子邮件保护))， (b)百里香功能化(电子邮件保护)（(电子邮件保护))．

EDX分析

结果对edx点映射进行了分析(电子邮件保护)而且(电子邮件保护)显示在图4和图5．所有应用的元素，包括C、N、O和Zn，在上述NPs表面的存在，也没有任何杂质被EDX测定证实。百里酚吸附基团结束(电子邮件保护)也被证实是O信号的来源。百里酚是锌上负载的活性化学物质之一，因此O信号表明(电子邮件保护)通过积极、环保的还原程序完美生成。Zn在~1 keV处的尖锐主峰是生物合成NPs晶体性质的一个强烈信号，目前的工作产生了符合的一致结果。此外，每个表面元素的峰值强度与样本中现有元素的值成正比关系。结果表明，所制备的NPs具有优良的纯度，其组成符合规定的质量百分比。这一观察结果证实了XRD的发现。

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图4:EDX分析(电子邮件保护)

红外光谱

图6为粗TH、ZnO和改性ZnNPs的红外光谱((电子邮件保护)而且(电子邮件保护))．TH谱(图6)在~3220 cm-1处有一个吸附峰，对应于涉及氢键的酚-OH拉伸。TH的芳香族特征表现为苯环在~1615 cm-1处C=C拉伸。氧化锌谱线在~1425 cm-1和~3400 cm-1处出现特征峰(图6 b)．羟基锌是氧化锌合成过程中不能完全脱除的中间产物。光谱(电子邮件保护)而且(电子邮件保护)发现所有的特征峰，以及ZnO和TH都出现在光谱中(图2)．的(电子邮件保护)光谱(图6 c)在3410 cm-1处有一个峰，对应于PDA中O-H和N-H基团的拉伸振动。此外，在~1580和1250 cm-1处的峰与C=O键和C-O键有关，表明ZnNPs已被功能化。PDA在ZnNPs上的存在也通过在ZnNPs上C=N和C=C基团对应的特征峰的出现得到了证实(电子邮件保护)光谱在~1472 cm-1。TH的光谱混合(电子邮件保护)（图6 d)显示特征波段的位置有轻微的移动。在(电子邮件保护)光谱的主要变化是-OH拉伸峰(~200移)，可能证实TH与(电子邮件保护)

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图5:EDX分析(电子邮件保护)

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图6:傅里叶变换红外(FTIR) (a)百里香的光谱，(b)氧化锌纳米颗粒，(c)多多巴胺功能化氧化锌NPs ((电子邮件保护))， (d)百里香功能化(电子邮件保护)（(电子邮件保护))．

XRD分析

ZnNPs的XRD谱图(电子邮件保护),(电子邮件保护)显示并证实了NPs的结晶性质(图7)．从图中可以看出，在2θ=31、34、36、47和56°附近的特征峰与ZnO晶体有关[37，38］．此外，在任何模式中都没有发现额外的杂质峰。由于PDA非晶结构的衍射作用，在ZnO特征峰旁出现了2θ=21处的宽峰((电子邮件保护))，这与之前Tavakoli等人的报告一致。[35］．的XRD谱图中(电子邮件保护)， Zn(OH)的剩余峰2被有趣地抹去了[39］．由此可见，DPA首先与Zn(OH)结合。2和具有胺和邻苯二酚自由官能团的ZnNPs，氧化生成Zn(OH)。2转化为ZnNPs。

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图7:ZnNPs的XRD谱图(电子邮件保护),(电子邮件保护)

抗菌活性

表1揭示了NPs样品对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑制活性的研究结果。整齐的TH和(电子邮件保护)(对照组)对所研究细菌的抑制活性较弱。然而，Th融入了(电子邮件保护)提供更强的抗菌活性。根据以往的文献，氧化锌的抗菌性能可能归因于氧化锌产生活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)，其破坏细胞壁，破坏DNA复制和蛋白质合成[40］．此外，Zn2 +氧化锌释放的离子增加了NPs穿过细菌细胞壁的渗透性，通过与细胞质物质相互作用杀灭细菌[41］．细菌表面与ZnO之间的静电或直接相互作用导致NP渗透细菌细胞，这是ZnO抗菌活性的另一种机制[42］．NPs的抗菌活性金黄色葡萄球菌明显高于E.coil(见表1和表2)．细菌细胞壁系统在细菌对抗菌药物的耐药中起着重要作用。革兰氏阳性菌的肽聚糖层比革兰氏阴性菌的肽聚糖层厚[43］．然而，革兰氏阴性菌具有更复杂的细胞壁结构，由一层薄薄的肽聚糖层和具有屏障特征的外膜组成。因此，这些细菌的外膜层阻止了产生的离子和ROS通过ZnO NPs穿透细菌细胞。

浓度(μg / ml)
组 标准菌株 15 7．5 3.75 1.875 0.937 0.468 0.234 0.117 0.058 0.029
(电子邮件保护) 大肠杆菌 - - - - - - + + + +
金黄色葡萄球菌 - - - - - - - - - -
(电子邮件保护) 大肠杆菌 - - - - - - - - - -
金黄色葡萄球菌 - - - - - - - - - -
TH 大肠杆菌 - - + + + + + + + +
金黄色葡萄球菌 - - - + + + + + + +

+:细菌存活率;-:不是细菌存活

表1。不同浓度(mg/ml)组的MBC试验。

最低杀菌浓度的测定:结果表明，与对照组相比，开发配方的MBC对细菌有很好的抑菌效果(表1)．

不同组别的生物膜产量评估

细菌生物膜的形成是一种防御机制，可以保护它们免受抗菌药物，特别是抗生素的伤害。这一特点对临床结果有重要影响大肠杆菌而且金黄色葡萄球菌感染。我们评估了所有分离株中生物膜的产生，我们发现菌株对生物膜的发展呈强阳性。然后，在th负载的情况下(电子邮件保护)，(电子邮件保护)，游离TH形式，研究了这些菌株的最小生物膜根除浓度。与对照组相比，我们的研究结果表明th负载(电子邮件保护)可在低浓度下根除生物膜的形成(表2)．

组 标准菌株 MBEC上亚MBC浓度(µg/ml)
(电子邮件保护) 大肠杆菌 234 117 58 29 14.5 7.2
没有 弱 弱 弱 温和的 温和的
金黄色葡萄球菌 14.5 7.2 3.6 1．8 0.9 0.45
没有 没有 没有 没有 弱 弱
(电子邮件保护) 大肠杆菌 234 117 58 29 14.5 7.2
没有 没有 没有 没有 没有 弱
金黄色葡萄球菌 14.5 7.2 3.6 1．8 0.9 0.45
没有 没有 没有 没有 没有 弱
TH 大肠杆菌 1875 937 469 234 117 58
没有 没有 没有 弱 弱 弱
金黄色葡萄球菌 1875 937 469 234 117 58
没有 没有 没有 没有 弱 弱

表2。不同组别的生物膜产量评估。

结论

在本研究中，我们利用百里香(TH)功能化的聚多巴胺/氧化锌NPs ((电子邮件保护))．TH被移植到(电子邮件保护)先后。所制NPs的抑菌活性金黄色葡萄球菌而且大肠杆菌通过将TH嫁接到植物表面，可以显著改善细菌的生长(电子邮件保护)由于TH和具有良好的协同抑菌作用(电子邮件保护)，根据抗菌试验的结果。TH嫁接到(电子邮件保护)表面增加了TH与每种细菌的接触概率，使它们能够雷竞技网页版有效地利用其抗菌优势。结果，(电子邮件保护)具有双重协同抑菌作用，增强抑菌活性。此外，发达的(电子邮件保护)由于表面带有负电荷，所以有可能产生凝血。上述观察结果不仅为开发高效、环保的有效抗菌剂提供了一种新方法。

利益冲突

没有需要声明的冲突。

道德声明

该研究程序得到了大不里士医科大学伦理委员会的批准(批准ID:IR.TBZMED.VCR.REC.1398.303)。

确认

作者要感谢“大不里士医学大学干细胞研究中心”的友好合作。

参考文献

全球科技峰会