热休克蛋白基因的转录稳定性和细胞增殖率为萨希瓦尔牛(波斯indicus) PBMCs对夏季胁迫的细胞耐受性提供了证据

摘要

季节变化给奶牛带来了环境压力，损害了动物的健康和生产力。为了测量特定品种/动物对热应激的性能能力，必须确定其耐热能力。热休克蛋白(HSPs)是在应激期维持蛋白质天然构象和细胞活力的分子伴侣。外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, pmcs)已被广泛用于研究家畜热休克反应的细胞模型。本研究假设季节变化会导致奶牛品种热休克蛋白转录物水平的变化。因此，本研究旨在评估热休克蛋白家族基因在Sahiwal奶牛(Bos indicus)、Holstein奶牛(Bos taurus)和Murrah水牛(Bubalus bubalis)中的转录稳定性和细胞增殖率。分析热休克蛋白家族基因(HSP27、HSP40、HSP60、HSP70和HSP90)在夏季和冬季高峰时在PBMCs中的基础表达水平。与Sahiwal奶牛和Murrah水牛相比，HSP70、HSP40、HSP60和HSP90 mRNA的相对表达量在夏季应激条件下显著诱导。细胞增殖数据进一步表明，夏季应激显著(p<0.05)抑制了荷斯坦奶牛的细胞增殖。热休克蛋白mRNA转录稳定性和细胞增殖的总体数据表明，与HF奶牛相比，Sahiwal奶牛pbmc对夏季应激的存活率更高。

关键字

热休克蛋白(HSP)基因，基因表达，细胞增殖率，夏季应激，Sahiwal奶牛，荷斯坦奶牛。

介绍

印度拥有丰富的农业生物多样性，其中农场动物生物多样性在农村经济中起着主导作用。印度广阔而多样的农业生态区帮助发展了大量自然进化的牛和河水牛品种。印度本土牛(Bos indicus)和水牛(Bubalus bubalis)被认为是印度次大陆的主要产奶物种，因此它们在夏季压力下的生产表现对农民和乳制品行业都具有重要意义。几个世纪以来，本地牛的遗传资源是农民经济的支柱，生产牛奶和牵引力。印度有超过20458万头牛，约占世界牛总数的15.97%，是一些最好的zebu (Bos indicus)品种，有37个定义明确的品种。除此之外，许多鲜为人知的牛种群也分布在全国各地，每一种都有自己的特点。这些品种中的许多品种不仅有生存的潜力，而且在各种恶劣的气候条件下也能维持生产、繁殖和牵引力。印度本土牛，如Tharparkar, Hariana, Sahiwal, Rathi, Gir, Kankrej和Nagori等，以其对高温的适应性，生产潜力和强大的耐旱能力而闻名。同样，印度拥有极其丰富的水牛多样性，拥有9690多万头水牛，分别占世界水牛总数(1.704亿头)的一半以上(56.8%)和亚洲水牛总数(1.654亿头)的58.9%(粮农组织2004年)。印度有13个定义明确、种类多样的河水牛品种，以高产、富含脂肪的牛奶和适应性特点而闻名。水牛在印度的乳制品行业中具有特殊的意义，除了作为动力源和肉类来源外，还贡献了50%以上的牛奶总产量。虽然水牛也适合炎热和潮湿的气候，但当它们暴露在太阳直接辐射下或在炎热的天气里在阳光下工作时，它们会表现出痛苦的迹象。据报道，在环境温度较高的时期，水牛的产奶量、生长速度和繁殖力都会下降[1]。这是由于水牛的深色皮肤和稀疏的皮毛会吸收大量的太阳辐射。此外，由于它们的排汗能力相当差，它们的蒸发冷却系统效率较低。此外，水牛皮肤的汗腺密度只有牛皮肤的六分之一，因此水牛通过出汗来散热的能力很差。在热应激下，水牛的体温、脉搏率、呼吸率和全身不适都会迅速增加。热应激期间水牛产奶量的减少是印度乳制品行业的一个主要问题。

热应激是许多畜牧企业面临的一个重大问题。热应激对奶牛的影响已被充分记录[2-6]，包括采食量减少，但营养能量需求增加，生育力降低，呼吸和心率增加，喘气活动增加，外周血流量和出汗增加，产奶量减少，奶质降低。总的来说，这些变化表明，动物的主要菌株最终导致乳腺炎、瘤胃酸中毒和酮症等健康相关问题的频率增加。7]。这些影响可能导致重大的收入损失和管理成本的增加。据保守估计，美国乳制品行业因热应激造成的平均动物损失每年约为9亿美元[雷竞技官网8]。近年来，随着全球变暖的加剧和奶牛场努力使牛奶产量最大化，这些担忧甚至增加了。然而，随着产奶量的增加和干物质采食量的增加，奶牛的代谢热输出增加，这进一步增加了对热应激的敏感性[9这不仅会影响奶牛的产奶量和收入，还会影响奶牛的生育能力、健康和福利，这种影响持续时间远远超过季节性炎热天气，并可能使这些损失加倍。

汉森(3.报道称，相比于欧洲牛磺酸牛品种，瘤牛在应对热应激时具有更好的调节体温的能力。然而，到目前为止，还没有系统的尝试来比较印度本土牛(Bos indicus)和外来牛(牛)和水牛(Bubalus bubalis)对热应激的反应。在细胞水平上，外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, pmcs)已被用作评估牛和其他家畜不同热应激反应的潜在模型[10-15]。本研究旨在分析印度牛(Bos indicus)、荷斯坦-弗里斯(HF)牛(B. taurus)和印度水牛(B. bubalis) PBMCs中HSP基因的耐热性差异及其对季节变化的适应机制。

乳制品品种，尤其是高产动物，通常对热应激更敏感，因为它们产生更多的代谢热[16]。当热应力伴随高环境湿度时，热应力效应更加有害[1]。当考虑到全球变暖的情况时，这个问题具有特别重要的意义。长时间暴露在较高的温湿指数下会降低泌乳奶牛的散热能力。为了调节体温，动物机体在生理和细胞阶段经历了多种适应机制。生理变化包括外真皮层血管扩张，使血液流向皮肤表面，有效散热，汗腺在皮肤表面产生汗液，带来降温效果。

pbmc作为细胞模型与热休克蛋白反应的结合已被广泛探索作为细胞水平热应激的合适评估指标[j]。10，11]包括季节变化的影响和适应机制[10，11，17]。牛磺酸、籼牛和印度水牛表现出不同的形态、解剖和生理参数，对热应激的适应反应不同[3.]并表现出不同的细胞反应[12]。热休克蛋白在细胞耐热性中有重要作用[18]，其表达可作为动物适应恶劣环境压力的潜在指标[3.]。本研究的目的是评估热休克蛋白基因的转录稳定性和细胞增殖率在Sahiwal (Bos indicus)， Holstein-Friesian (牛以深入了解它们对夏季压力的相对耐热能力。

材料与方法

材料

样本包括52匹正式登记的成年迈诺卡马(24公28母)，年龄在2.5岁以上(范围从3岁到16岁，平均8岁)。这些动物属于48个不同的主人，被饲养在不同的当地农场和骑马中心，在所有地点都有统一的管理和喂养条件。

样品收集

本研究共选取15头哺乳期奶牛，分别为Murrah水牛(Bubalus bubalis)、Sahiwal水牛(Bos indicus)和Holstein-Frisian水牛(Holstein-Frisian)。牛)牛也包括在内。研究中包括的Sahiwal奶牛和Murrah水牛属于卡纳尔国家乳制品研究所(NDRI)的养牛场，而荷斯坦弗里西亚奶牛则饲养在附近的私人养牛场。在炎热的夏季(7月平均温度为41±1℃，温湿度指数≥85)和寒冷的冬季(12月平均温度为12±1℃，温湿度指数≤72)，颈静脉采集血液(15 ml)，放入EDTA涂膜容器中。抽样程序是按照研究所动物伦理委员会的指导方针进行的。

外周血单核细胞的分离

采集的血液样本在2小时内进行处理，分离PBMCs，如我们之前的研究所述[12]。简单地说，全血用1X PBS (Ca^{2 +}和毫克^{2 +}免费的;Hyclone，犹他州)，并在室温下轻轻覆盖在Histopaque-1077 (Sigma- Aldrich Inc.， USA)上。400G离心30min，丢弃血浆，将单个核细胞白色环吸到新管中。将抽吸的细胞用2.0 ml冷冻滤过的RBC裂解缓冲液处理2分钟。裂解后立即用8.0 ml 1倍PBS (Ca^{2 +}和毫克^{2 +}免费的;加入Hyclone, Ultah)， 260倍g离心10分钟，去除微量的histopque -1077和红细胞。用1X PBS重复洗涤PBMC颗粒2次。取少量纯化细胞(9.0 μl)与1.0 μl台盼蓝染料混合，进行细胞活力计数。

细胞增殖率的测定

采用CyQuant细胞增殖试验(Molecular Probes)检测PBMCs的细胞增殖率。CyQuant细胞增殖试验的原理是，对于给定的细胞系或细胞类型，每个细胞中的DNA含量保持不变，因此基于DNA含量的测定可用于提供准确而简单的细胞数量测量。程序是按照制造商的说明进行的。简单地说，纯化后的PBMCs细胞颗粒悬浮在1X HBSS缓冲液中。取含有105个细胞的50 μl细胞悬液，一式三次滴入微孔中。然后在每个孔中加入50 μl的2X染料结合液，37℃孵育45分钟。这种孵育是染料- dna结合的平衡所必需的，从而产生稳定的荧光终点。最后使用荧光板阅读器(Perkin Elmer Victor X3)测量每个样品的荧光强度，激发波长为485 nm，发射探测波长为530 nm。

RNA分离和cDNA合成

总RNA提取和cDNA合成按照前期研究进行[12]。使用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies)估计的高质量RNA(平均od值260/280≥2.0)用于cDNA合成。在1%变性琼脂糖凝胶上观察18s和28s核糖体条带，检测总RNA的完整性。用半定量PCR检测合成cdna的质量。在含有4 μl cDNA模板、各0.4 μl正向引物和反向引物(工作浓度- 4pmol)、1 μl PCR缓冲液(1X)、0.75 μl MgCl2(1.5 mM)、0.5 μl dNTPs (200 μM)和0.2 μl Taq DNA聚合酶(1.0 U)的10 μl反应混合物中进行基因特异性PCR扩增(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)。在Master cycler梯度热循环器(Eppendorf，德国)中进行扩增，热循环条件为95°C, 2 min，然后进行35次循环，分别为95°C 30 s, 60°C 30 s, 72°C 30秒，最后延长至72°C 5 min。扩增子通过琼脂糖(1.5%)凝胶电泳分析其具体大小。

实时定量PCR

采用Light Cycler 480 (Roche, Germany)进行qPCR。在96孔白板(德国罗氏公司)中，每个反应由4 μl稀释后的cDNA与6 μl由5 μl 2X lightcycer 480 SYBR Green I主混合物(德国罗氏公司)组成的混合物，10 μM正、反向引物各0.4 μl，以及0.2 μl DNase/RNase自由水组成。对于每个基因，样品一式两份(技术重复)与6点相对标准曲线加非模板CTR一起运行。反应的扩增条件为:50°C 2 min, 95°C 10 min, 95°C 15 s 40个循环(变性)，60°C 1 min(退火+延伸)。采用升温95°C + 65°C 15s的解离方案，考察qPCR反应的特异性和引物的存在。主要热休克蛋白基因(HSP27、HSP40、HSP60、HSP70和HSP90)的基础表达水平见表1在pbmc样品中进行分析。不同样本间mRNA表达数据的分析基于周期阈值(CT)值。利用β-肌动蛋白(ACTB)作为内控基因，将循环阈值(CT)归一化，估计热休克蛋白基因的表达水平。每个目标基因的CT值从β-肌动蛋白的CT值中减去，计算Δ CT。采用GraphPad PRISM version 5.0 (La Jolla, CA, USA)统计软件包进行方差分析(ANOVA)，确定不同组间分析变量是否存在显著差异，组间差异采用Tukey多重比较检验。P值小于0.05和0.01认为显著。

结果

为了了解主要伴侣蛋白的表达稳定性、动物类型和季节变化之间的关系，我们在Sahiwal奶牛(Bos indicus)、异国荷斯坦弗里斯兰(Holstein Frisian) (牛)牛和墨拉水牛(Bubalus bubalis)。本研究的主要目的是确定季节变化是否影响Sahiwal、Holstein Frisian和Murrah水牛主要伴侣蛋白的转录和PBMCs的细胞增殖率。所有PBMCs样品的A260/A280比值为:Sahiwal奶牛为2.07±0.04,HF奶牛为2.10±0.62,Murrah水牛为2.08±0.05。每个基因的单峰qPCR反应的熔体曲线分析表明，PCR扩增具有特异性和高效性(R2范围为92.50 ~ 115.0);表1）.

在分析的不同HSP基因中，HSP70的表达水平差异较大，夏季荷斯坦弗里斯兰奶牛的HSP70表达水平变化为4.55倍(p<0.001)，其次是默拉水牛的HSP70表达水平变化为1.73倍(p=0.31)， Sahiwal奶牛的HSP70表达水平变化为-0.31倍(p=0.50)。HSP70 mRNA的相对表达量数据显示，荷斯坦弗里斯兰奶牛在夏季(图1和2）.其在默拉水牛中的表达量也较高，但增幅不显著(p < 0.05)。另一方面，两个季节Sahiwal奶牛的HSP70 mRNA表达变化不大。与HSP70相似，HSP40 mRNA在夏季与冬季相比，在荷斯坦弗里斯兰中表现出显著(p<0.05)的诱导作用，在默拉水牛中表现出不显著(p<0.05)的诱导作用，在萨希瓦尔牛中几乎没有变化(图1和2）.另外两种伴侣蛋白(HSP90和HSP60)转录本也表现出类似的模式，在荷斯坦弗里斯兰中诱导率最高，其次是Murrah水牛和Sahiwal牛。有趣的是，HSP27 mRNA呈现出相反的趋势，在所有动物类型中，与夏季相比，其在冬季的表达虽然不显著(p>0.05)(图1和2)。尽管很难解释这种趋势，但可以提出的一个原因是，HSP27可能具有组成性表达，与研究动物中其他研究的伴侣蛋白不同，它可能不是夏季应激的非常敏感的标志物。

在本研究分析的不同奶牛类型中，Sahiwal奶牛所有热休克蛋白基因的表达倍数变化最小，差异不显著(热休克蛋白27的表达倍数变化=0.36,p=0.24;HSP40 = 0.08, p = 0.78;HSP60 = -0.22, p = 0.59;HSP70 = -0.31, p = 0.51;夏季与冬季相比，HSP90=-0.33, p=0.33)。在夏季和冬季，荷斯坦弗里斯兰奶牛的HSP40(倍数变化=1.28,p=0.04)、HSP70(倍数变化=4.55,p<0.001)和HSP90(倍数变化=1.20,p=0.0)差异最大，默拉水牛的HSP27(倍数变化=-0.93,p=0.20)和HSP60(倍数变化=1.07,p=0.03)差异最大。

此外，除了分析单个HSP mRNA表达对夏季胁迫的诱导作用外，我们还通过结合表达数据评估了四种HSP转录本(HSP70、HSP40、HSP60和HSP90)表达模式的总体变化。纳入HSP27 mRNA表达值进行分析。这主要是为了评估显示不同表达趋势的HSP27 mRNA数据是否对整体HSPs表达模式有任何影响。我们的分析显示，HSP27的表达值对组合表达数据集(图3）.所有HSP的汇总表达数据显示出与单个HSP mRNA相似的趋势。HSP70、HSP40、HSP60和HSP90基因的联合表达值在荷斯坦奶牛中与Sahiwal奶牛和Murrah水牛相比，诱导率最高且极显著(p<0.01) (图3）.

细胞增殖数据显示，夏季应激对荷斯坦奶牛和默拉水牛的细胞增殖有显著(p<0.05)的抑制作用(THI-85;图4）.Sahiwal母牛的pbmc表现出更强的抗热应激能力，因为它们的细胞增殖率的下降比荷斯坦和默拉水牛要小得多。

讨论与结论

近年来，家畜品种对气候变化特别是热应激的分子适应机制受到了广泛关注。现在，一个公认的事实是，在品种或物种水平上，对环境热负荷的耐受存在变异性。然而，印度本土牛和水牛品种的这类数据严重缺乏，这些品种被认为比外来品种具有更优越的耐热性。本研究假设季节变化可导致适应热带和温带气候条件的奶牛品种的热休克蛋白转录物水平发生不同程度的变化。因此，本研究旨在评估热休克蛋白(HSP40、HSP60、HSP70和HSP90)转录本在印度母牛循环PBMCs中的相对表达谱。牛(荷尔斯泰因弗里斯兰)奶牛和(默拉)水牛在夏季和冬季。外来荷斯坦奶牛的PBMCs在夏季应激条件下对HSP转录本(HSP70、HSP60、HSP40和HSP90)的诱导程度高于热带适应的Murrah水牛和Sahiwal奶牛。在本研究中检测的所有热休克蛋白基因中，HSP70在荷斯坦·弗里氏虫中被诱导最多(图1)。这是意料之中的，因为热应激期间，为了稳定蛋白质的天然构象和维持细胞的生存能力，HSP70的表达被认为是最受诱导的(Beckham et al.， 2004)。观察到的夏季应激导致其表达增加的结果与在不同家畜物种中进行的研究一致[10，12，19-22]。

除了HSP70;热休克蛋白基因HSP40、HSP60和HSP90也参与了耐热性的研究。HSP40和HSP90通常作为哺乳动物HSP70的共伴侣/辅助因子，该复合物参与热休克后蛋白确认的恢复[23-25]。HSP60是在各种应激条件下另一个重要的分子伴侣[26]。这些热休克蛋白以其作为分子伴侣的主要作用而闻名，在生理应激条件下确保正确的蛋白质折叠和细胞凋亡调节。综上所述，夏季荷斯坦奶牛HSP40、HSP60和HSP90 mRNA的相对表达量显著高于冬季。这一发现与对山羊体内不同热休克蛋白的观察结果相似[11]。观察到的较高的热休克蛋白丰度对于在夏季应激期间提供细胞热保护至关重要[27，28]。一些报告也证明了热休克蛋白在体外和体内热应激条件下细胞存活中的重要作用[12，14，29]。

本研究的细胞增殖数据与我们之前的研究结果相吻合[12]，其中细胞活力下降百分比最高的是荷斯坦奶牛的pbmc，特别是热应激后，其次是默拉水牛和萨希瓦尔奶牛。本研究表明，适应印度热带环境的Sahiwal牛(Bos indicus)的PBMCs对夏季应激的生存能力优于Hostein Frisian牛(牛）.这些结果与早期的发现一致，即高温对着床前胚胎和母牛细胞的有害影响较小[3.，30.，31]。

综上所述，Sahiwal奶牛、Holstein Frisian奶牛和Murrah水牛PBMCs的HSPs mRNA表达程度和细胞增殖率存在差异，它们改善热应激有害影响、维持细胞完整性的能力存在差异。Sahiwal奶牛HSP转录本的表达随季节变化最小。这证明其细胞耐受性和适应性优于外来荷斯坦奶牛。另一方面，在夏季，4种主要HSP转录本(HSP90、HSP70、HSP60和HSP40)丰度较高的荷斯坦黑貂对环境热负荷的耐受性较低，特别是在热带条件下。尽管热休克反应是一种进化保守机制，但在本研究中，不同品种/物种在热休克过程中诱导热休克蛋白合成的内在能力可能存在差异。荷斯坦奶牛高热休克蛋白的表达和低细胞增殖率很可能与动物较高的应激状态有关，需要更多的热休克蛋白来应对应激状态。

鸣谢

这项工作得到了位于新德里的印度农业研究委员会国家研究员计划的支持。作者对NBAGR主任Karnal为本研究提供的研究设施表示感谢。

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